碱性磷酸酶比活力测定课件

实验碱性磷酸酶比活力测定1实验目的掌握酶活性测定方法的一般原理方法测定碱性磷酸酶制备各步骤酶制剂比活力2实验原理酶活力：即是酶活性，是表示催化某一特定反应的能力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学速度表示。酶催化反应速度越快，酶活性越高，反之则愈低。底物减少量或生成物增加量酶促反应速度v=

单位时间3

产物浓度

v=a/b

酶促反应进程曲线反应时间要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶反应时间成正比的这一段时间内进行初速度的测定。

活力测定中应注意的几个问题(1)活力测定一般测定产物增加速度为好。(2)测活过程应注意外界环境的影响。ab4方法：1.终止测定法（终点法）终止测定法是在酶和底物反应达到预定的时间时，立即加入终止剂使酶变性，终止酶促反应，在这段反应时间里面，产物的生成量基本成线性增加，用这段反应时间内的平均速率代替反应初速率。2.动力学分析法（连续监测法或速率法）5碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。6对-硝基苯磷酸二钠法碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解反应，以对-硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/LMg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在405nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405nm

值的增加计算酶活力的大小。反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-

无色黄色

可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。

碱性磷酸酶7酶活力单位定义为：在37℃下，以0.5mmol/LpNPP为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2mmol/LMg2+的测活体系中每分钟催化产生1

molpNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。8磷酸苯二钠法在pH10环境中，ALPase催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。测定红色物质的吸光度就可以计算酶活性的大小。反应式如下：

磷酸苯二钠+H2O苯酚+磷酸氢二钠苯酚+4-氨基安替比林

红色醌亚胺衍生物碱性磷酸酶9操作方法1

对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）：取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作。管号01234567pNP含量(

mol)00.050.100.150.200.250.300.350.5

mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.60.7H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.20.1Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mL

OD405nm以对硝基苯酚的绝对量(

mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数(

)值。＝8.80×103(mol/L)-1﹒cm-110管号空白1235mMpNPP(mL)各0.2mLNa2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mLH2O(mL)各0.50mL混匀，37℃，5分钟

酶液（mL）/各0.1mL37℃，精确反应10分钟0.2mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mL

酶液（mL）0.1mLOD405nm2酶活力的测定以0号管调零点，测定各管的OD405nm值，从对照标准曲线求出产物的

mol数，算出酶活力。113蛋白浓度的测定本实验采用双缩脲法测定蛋白浓度。分离提取的三步酶制剂按一定比例用Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定。（一般稀释5-10倍）。124结果处理

计算：式中：A为稀释倍数，B为由标准曲线查得的pNP

mol数或者通过＝8.80×103(mol/L)-1﹒cm-1换算（B=4000×OD405/

)，t为反应时间，C为由标准曲线查得的蛋白mg数，V1为测定酶活力所用的酶量(mL数)V2为测定蛋白浓度所用的酶量(mL数)酶的比活力（U/mg）＝酶活力（U/mL）蛋白浓度（mg/mL）纯化倍数=各步比活力/第一步比活力得率%=各步总活力*100/第一步总活力

13将测定的数据或计算结果用下表记录。（此为例子）

步骤总体积

mL蛋白mg/mL总蛋白mg酶活力U/mL总活力U比活力U/mg纯化倍数得率%匀浆过滤液4007.24

20.3

正丁醇处理上清液470

33.8

0.35饱和(NH4)2SO4上清液440

35.3

0.7饱和(NH4)2SO4沉淀溶解透析上清液40.3

314.7

DEAE-32酶液9.63.82

1002.2

SephadexG75酶液13.20.49

451.5

SephadexG200酶液6.80.21

509.3

14注意事项取液量一定要准确。反应时间一定要精确。加酶前后一定要将试剂混匀。空白对照一定要先加NaOH，后加酶。移液管或微量移液器的使用比色杯的使用三步样品一定要完全化冻才能进行测定水浴15管号11'22'33'44'55'

加酶时间（min）0.5m1m1.5m2m2.5m3m3.5m4m4.5m5m加NaOH时间10.51111.51212.51313.51414.515反应时间（min）1010101010101010101016微量移液器的使用吸液：调好量程后，用大拇指将按钮按下至第一停点，然后将移液器的吸嘴垂直插入液面几毫米，慢慢松开按钮回原点，吸取所需液体。排液：吸嘴贴着容器壁，接着将按钮按至第一停点，排出液体排出残液：稍停片刻待剩余液体聚集后，继续按按钮至第二停点，吹出残余的液体。最后松开按钮。17设定量程时，切忌使移液器量程旋钮超出其标示的最小和最大量程。选用合适量程的移液器，不能用大量程的移液器移取小体积样品。在将