隐形阿霉素脂质体的制备及体外细胞试验

隐形阿霉素脂质体的制备及体外细胞试验摘要用转铁蛋白(Tf)修饰盐酸阿霉素隐形脂质体(SL),以增加药物在肿瘤部位的积蓄,从而增加药物向肿瘤细胞内的转运。采用薄膜超声法制备空白脂质体,硫酸铵梯度法装载盐酸阿霉素(DOX);通过膜材DSPE-PEG2000-C00H上的活性羧基末端与Tf上的氨基连接制备Tf修饰的隐形脂质体(Tf-SL);采用凝胶柱-UV法测定脂质体中DOX的包封率，双辛丁酸试剂盒测定蛋白结合效率；通过流式细胞试验和激光共聚焦显微试验考察肝癌细胞HepG2对SL包封的DOX(DOX-SL)及Tf-SL包封的DOX(Tf-DOX-SL)的结合或摄取情况，并观察两种脂质体对HepG2细胞的体外杀伤作用oTf-DOX-SL的平均粒径为(62±17)nm,药物平均包封率为96.4%,蛋白结合效率为100.28卩gTf/Mmol磷脂。与DOX-SL相比，Tf-DOX-SL与肝癌细胞HepG2的结合及摄取均增加。48h细胞毒试验表明Tf-DOX-SL对HepG2细胞的杀伤作用(IC=20.4Mmol/L)明显优于50DOX-SL(IC=166.2Mmol/L)(P<0.01)。Tf修饰的隐形脂质体可作为肿瘤50靶向的载体通过受体介导的方式促进DOX向肿瘤细胞内的传递。考察转铁蛋白修饰的阿霉素(DOX)脂质体在大鼠体内的药代动力学及荷瘤小鼠体内的组织分布。将DOX注射液(I-DOX)、DOX脂质体(L-DOX)和转铁蛋白修饰的DOX脂质体(Tf-L-DOX)3种DOX制剂静脉给药后，测定大鼠血浆中DOX含量和荷瘤小鼠不同组织中的DOX含量，对3种制剂的体内生物分布特征和靶向性进行评价。在大鼠血浆中，I-DOX、L-DOX和Tf-L-DOX的半衰期分别为5.48、20.58和22.24h;AUC分别为0.538,1276.5,1221.3“g•h/mL;MRT分别为2.43,23.46和22.59h;CL分别为50.000,0.020和0.020L/(kg・h)。与DOX相比，L-DOX和Tf-L-DOX在小鼠肝、脾、肺和肿瘤组织中的药物含量明显增加,而在心、肾中的药物含量明显降低。与L-DOX相比,Tf-L-DOX在肿瘤组织中的药物含量显著增加。脂质体包载DOX后,可显著改变DOX的部分药代动力学参数，使药物在血浆中能维持较长时间，而转铁蛋白修饰对脂质体本身的药代动力学参数没有影响。Tf-L-DOX具有较好的肿瘤靶向治疗效果和较低的心脏不良反应,对提高DOX的治疗指数具有较好的临床价值。、八、'前言在疾病的治疗过程中,为了提高药效和减轻不良反应,药物定向输送和靶细胞特异治疗的研究越来越受到人们的关注。研究者正在探索药物定点和定向转运系统可能的应用方案,其中配体-受体介导的转运系统备受关注。隐形脂质体（stealthliposomes,SL）作为一种抗癌药物载体，能够在肿瘤组织中蓄积并显著提高药物的治疗指数。在隐形脂质体的表面用特异性配体（如叶酸、转铁蛋白或单克隆抗体等）进行修饰可进一步提高靶向性。转铁蛋白（transferrin,Tf）和转铁蛋白受体（transferrinreceptor,TfR）介导的内吞作用是生物体细胞最具特点的转运过程之一。由于恶性肿瘤细胞过度表达TfR,利用Tf-TfR转运途径，可明显增强抗癌药物的选择性、毒性和减少耐药性，从而增强疗效。利用Tf-TfR的转运途径,将药物特异性地转运至肿瘤部位及脑内发挥药效已取得进展。本实验以DSPE-PEG2000-C00H作为连接脂质，将TfR的配体Tf连接至盐酸阿霉素隐形脂质体,测定脂质体形态、粒径、稳定性、包封率,体外细胞结合、摄取与细胞毒等重要性质,为设计转铁蛋白修饰的主动靶向给药系统提供有效的调控方法。1材料药品与试剂盐酸阿霉素;二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交连物（DSPE-PEG2000-C00H）、胆固醇（Chol）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）（AvantiPolarLipids公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC.HCl）、转铁蛋白（Sigma公司）；N-羟基硫代琥珀酰亚胺;SepharoseCL-4B（Pharmacia公司）。其他试剂均为分析纯,实验用水为蒸馏水。仪器旋转蒸发仪；高速冷冻离心机;蛋白快速层析系统（美国GE公司）；JEM-2010UHR高分辨透射电镜；Zetasizer3000HSA型粒径分析仪（英国Malvern公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BectonDickinson公司）。2方法2.1转铁蛋白修饰脂质体的制备分别精密称取DSPC、Chol、DSPE-PEG2000-C00H（物质的量比为6：3：0.6）作为制备脂质体的膜材。膜材溶于有机溶剂（氯仿-甲醇,2：1）后置圆底烧瓶中于53°C水浴减压蒸发形成薄膜。加入250mmol/L硫酸铵溶液适量，涡旋振荡，水浴超声。所得脂质体装于透析袋中，置盛有PBS(pH7.4)lOOmL的烧杯中，室温下透析5次，每次lh。DOX用硫酸铵梯度法装载：将DOX固体粉末加到空白脂质体中，60°C水浴孵育lh,并不时振荡，即得阿霉素隐形脂质体(DOX-SL)。DOX-SL混悬于柠檬酸-磷酸盐溶液(pH4.0)中，每10微摩尔膜材中分别加入0.5mol/LEDC和0.5mol/LS-NHS的水溶液各360卩L,室温下反应10min。然后用1mol/LNaOH调pH至7.5,每微摩尔磷脂(DSPC和DSPE-PEG2000-COOH)中加入Tf125卩g,4C搅拌8h,即得转铁蛋白修饰的阿霉素隐形脂质(Tf-DOX-SL)。SepharoseCL-4B去除游离Tf,所得脂质体于4C冷藏备用。脂质体包封率的测定精密量取载药脂质体混悬液0.5mL加至预先用PBS(pH7.4)平衡好的SephadexG-50分子筛凝胶柱上，用PBS洗脱，收集480nm处有吸收的第一峰(DOX-SL)的红色洗脱液直至吸收度接近空白，得到除去游离DOX的含药脂质体溶液共8mL。取1mL置10mL量瓶中，加入乙醇-异丙醇(1:4)使脂质体完全破裂，用去离子水定容，摇匀，于480nm处测定吸收度，计算包圭寸率。并每隔7d取样品，两周内测定脂质体的包封率，计算贮存过程中的渗漏率。脂质体中磷脂含量的测定取Tf-DOX-SL200UL,先用乙醇-异丙醇破膜lh,氮气流下吹干，再溶于氯仿2mL中，加显色剂2mL,涡旋离心，硫氰铁铵显色法测定磷脂含量。BCA试剂盒测定蛋白结合效率精密量取Tf-DOX-SL0.1mL,加入甲醇0.4mL,涡旋，9000r/min离心10s;再加入氯仿0.2mL,涡旋，9000r/min离心10s;加入水0.3mL,涡旋，9000r/min离心1min,小心除去上层。在氯仿相和析出的蛋白层中加入甲醇0.3mL。混合样品,9000r/min离心2min。除去上清液，氮气流下干燥蛋白。所得的蛋白溶于PBS(pH7.4)0.1mL中，双辛丁酸(bicinchoninicacid,BCA)试剂盒测定蛋白含量。蛋白结合效率以卩gTf/LmolPL表示。2.5流式细胞实验考察细胞与DOX的结合HepG2细胞生长层单层，经胰酶消化后用新鲜的培养液洗1次，吸取一定量的细胞混悬液分别与Tf-DOX-SL、DOX-SL及DOX溶液(DOX质量浓度均为20卩g/mL)在37C水浴中孵育2h,孵育完毕用冷的PBS洗3次，流式细胞仪测定与细胞结合的DOX荧光强度（激发波长为488nm,测定波长为560nm）。2.6激光共聚实验考察细胞对DOX的摄取HepG2细胞种植于盖玻片上，贴壁生长至50%汇集，加入T-fDOX-SL、DOX-SL、DOX溶液（DOX质量浓度均为6.0Lg/mL）,置37°C、5%CO孵箱内培2养lh,依次用PBS缓冲液漂洗3次，95%乙醇固定，30%PBS甘油封片。用激光扫描共聚焦显微镜以480nm波长的激光束激发DOX（激发波长480nm,检测波长540nm）进行图象分析。2.7体外细胞毒试验HepG2细胞在37°C、5%CO孵箱内培养。取对数生长期的细胞，稀释成每毫2升0.4X104个细胞，加在96孔培养板上，每孔100UL;分别加入Tf-DOX-SL、DOX-SL、DOX溶液及RPMI1640（对照组）,DOX每组设6个浓度，分别为100,50,25,12.5,6.25,3.13Mmol/L,分别培养8h;用冷的PBS洗3次，继续孵育40h,每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20吐，孵箱内孵育4h,置酶标仪上检测，检测波长570nm。2.8体内分布大鼠，雄性，体重190~210g,;ICR小鼠，雌雄各半，体重18~22g,色谱条件色谱柱：DikmaDiamonsilC18柱（150mmX4•6mm,5|Jm）,检测波长:激发波长480nm,发射波长550nm;流动相：乙腈-5mmol/L乙酸铵水溶液（30:70）,pH3。5;流速:1.0mL/min;柱温:30°C。药代动力学研究2・8・1血浆样品的处理吸取大鼠血浆200JL,置离心管中，加入内标盐酸柔红霉素（4jg/mL）50jL及乙腈750JL,涡旋振荡30s后,4°C下15000r/min离心10min,吸取上清液20JL,用HPLC分析。2・8・2标准曲线的制备分别取空白血浆200JL,精密加入不同量的DOX及等量柔红霉素，使血浆中DOX质量浓度分别为0.02,0.04,0.1,0.2,0.4,1.0,2.0,4.0Jg/mL。按“2•・1”项下方法进行测定，记录色谱峰。以DOX峰面积与内标峰面积的比值（A/A）对DOXDNMDOX在血浆中的浓度进行线性回归。2・8・3药代动力学18只雄性大鼠，随机分为3组，分别尾静脉注射I-DOX、L-DOX和Tf-L-DOX,剂量均为5mg/kg,分别于给药后5,15,30,45min及1,2,4,8,12,24,36,48,72,96h眼眶取血0.5mL,置肝素化试管中，分离血浆0.2mL,置-20°C冰箱保存，供测定血药浓度用。2・8・4数据处理将大鼠血浆药物浓度-时间数据用3P97药代动力学计算程序进行模型拟合，以AIC值为拟合度指标，判断房室模型并计算出药物动力学参数。2・9组织分布研究2・9・1组织样品的处理分别取荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织,精密称定,置塑料试管中,精密加入内标盐酸柔红霉素(5卩g/mL)60pL,加入流动相1.44mL，分散匀浆，4C下15000r/min离心10min,吸取上清液20pL,用HPLC分析。标准曲线的制备分别取荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织空白组织(各取0.1g),精密称定,置塑料试管中，精密加入不同量的DOX及等量内标，使组织中DOX浓度分别为0.6,1.2,3.0,6.0,12.0》g/g。液相分析记录色谱峰。以DOX峰面积与内标峰面积的比值(A/A)对DOX在组织中的浓度进行线性回归。DOXDNM组织分布将126只荷瘤小鼠随机平均分成3组，分别尾静脉注射I-DOX、L-DOX和Tf-L-DOX，剂量均为5mg/kg,分别于给药后1,3,5,12,24,48,96h时间点取6只小鼠,分别摘眼球取血后,颈椎脱臼处死,取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织，生理盐水洗净，吸湿后称重，置-20C冰箱保存,供测定组织浓度用。数据处理根据文献，以相对摄取率(relativetissueexposure,Re)为考察指标，评价靶向性。AUC按梯形法进行计算：AUC二工(c+c)X(t-t)/2TOC\o"1-5"\h\z0—t ii-1 ii-1AUC=AUC+c/入0~8 0—tnnRe=(AUC)/(AUC)ic is其中C为最后采样时间点的浓度，入为末端相消除速率常数,t为最后采样n n n时间。式中AUC是由药物经时曲线算得的第i个器官或组织的曲线下面积；c表示在某一器官组织内L-DOX或Tf-L-DOX的药物分布情况；s表示在上述相同器官组织内I-DOX的分布情况。Re大于1表示脂质体在该组织有靶向性,Re愈大靶向效果愈好,Re小于1则表示无靶向性3结果3.1脂质体的形态、粒径和Zeta电位以纯水适当稀释Tf-DOX-SL,将其吸附于敷有支撑膜的铜网上，自然晾干后置透射电镜下。结果显示:脂质体粒度分布较窄,圆整度和分散度均较好。以纯水为分散介质，利用粒径仪测得Tf-DOX-SL的粒径大部分集中于43—78nm处，平均粒径为（62±17）nm,Zeta电位为-（30.33±2.08）mV。3.2包封率的测定按照UV-Sephadex法测定DOX-SL的包封率。过SephadexG-50柱时,可明显看到DOX-SL色带的快速下移，肉眼未见游离DOX的红色色带。从洗脱曲线（图1）中可以看出，游离DOX从63min左右开始被洗脱下来，DOX-SL从21min开始被洗脱下来,两者可以完全分离。3批样品的包封率分别为96.4%、95.5%和96.8%,样品含药浓度分别为0.540、0.508和0.527mg/mL。两周内DOX的渗漏率为0.9%,符合脂质体贮藏期间渗漏率检查的要求。Figure1Elutionprofilesofdoxorubicin-stealthliposomes(DOX-SL)(1)andDOX(2)3.3蛋白结合效率的测定蛋白结合效率按BCA试剂盒操作说明进行，其标准曲线为A=-6E-08c2+0.0007c+0.0099(r=0.9996,n=9),检测范围为20--2000Lg/mL。Tf-DOX-SL的磷

脂含量为(7.26±0.20)Lmol/mL,蛋白含量为(760±32.43)卩g/mL,转铁蛋白的结合效率为100.28卩gTf/Lmol磷脂。流式细胞试验图2可见，HepG2细胞与Tf-DOX-SL、DOX-SL及DOX溶液分别共同孵育2h后，与细胞结合的DOX的荧光强度从大到小依次为：DOX溶液、Tf-DOX-SL、DOX-SL。与DOX-SL相比，HepG2细胞与Tf-DOX-SL孵育后，与细胞结合的DOX的浓度增加。激光共聚焦试验SL-DOXZTf-SL-DOX利用激光共聚焦显微镜法考察HepG2细胞对DOX的摄取，结果见图3。HepG2细胞与不同DOX制剂共同孵育后，Tf-DOX-SL组HepG2细胞内的DOX荧光强度明显高于DOX-SL组，DOX溶液组细胞内荧光强度最大。这一结果与流式细胞试验结果相似,表明Tf修饰脂质体后能够促进药物向细胞内传递。SL-DOXZTf-SL-DOX10°101102FL2-H10310°101102FL2-H103104Figure2Flowcytometricmeasurementofdoxorubicin(DOX)uptakebyHepG2cellsafterincubatedwiththreepreparationsFigure3ConfocalmicroscopyofHepG2cellsafterincubationwithDOXSolutionAllthreeDOXformulationshavingDOXconcentrationof610Lg/mL体外细胞毒实验48h细胞毒实验结果(见图4)表明，Tf-DOX-SL对肝癌细胞HepG2的杀伤作用显著优于DOXSL(两者的IC分别为20.4Lmol/L和166.2Lmol/L,P<0.01)。在DOX浓度50达到100Lmol/L时，DOX溶液对肝癌细胞的杀伤率达96.8%,Tf-DOX-SL则为80.2%,而DOX-SL仅为40.3%。ora」UPora」UP七qzu_%Figure448hCytotoxicityassayofthethreepreparationsofDOXtoHepG2cells3.7色谱行为DOX和柔红霉素的保留时间分别为4・7min和10・7min,DOX与柔红霉素达到完全分离,血浆与组织中内源性物质均不干扰DOX和内标的色谱峰。3.7.1药代动力学以测得的DOX峰面积与内标峰面积的比值(A/A)对DOX在血浆中的浓度进行线DOXDNM性回归:y=0.7235x+0.0082(r=0.9998),说明DOX血浆浓度在0.02~4.0“g/mL范围内线性关系良好。3种DOX制剂在大鼠体内的血药浓度-时间曲线见图1,经房室模型拟合，I-DOX、L-DOX和Tf-L-DOX静脉注射给药后血药浓度随时间的变化均符合三室模型。各主要药代动力学参数见表1。

(E/6F1)uoqcoxopjoUOEUOOUOOFigure1 (E/6F1)uoqcoxopjoUOEUOOUOOFigure1 Meandrugconcentrationversustimeinratsplasmaatdoseof5mg/kgafterivadministrationofdoxorubicininjection(I-DOX),DOXliposomes(L-DOX)andL-DOXmodifiedwithtransferrin(Tf-L-DOX)(x±s,n=6)Table1Phamacokheti(*parailetersof<lox<)nil>i(*ii(DOX)airaktafteriva<hihislratkmofthreepreparatifinsatdoseof5mg/kg(x土,、n=6)Paraiieter I-DOX L-DOX TFLFOXP/{Hg/ml)5.956±1.62163.728±1：18952,297±13750Vc/〔L/k刃4.000±1.0000.E±00250.205±0.015也(pE/h0.046±0.009(1.339±02020.843±0.379*172a0.853±1.0153.551±07096.398±36275,47ft±1.69(52(1.?S1±090522.238±2.AUC h/mL)o.538±0.11^1276.5土195.412；!l.3±80.SCL(s)/(fh/kg)50.000+l.500(1.020±00050.020±0.000MRT/h2..43J±0.05023.461±l.12822.585±2.594cDOX在心、肝、脾、肺、肾和肿瘤中线性关系均良好。高、中、低3个浓度的日内、日间差分别为3.1%~6.2%,1.6%~6.3%,方法回收率为97.7%~100.6%,符合测定要求。荷瘤小鼠静脉注射3种DOX制剂后，用HPLC法于不同时间点测定心、肝、脾、肺、肾、肿瘤中DOX色谱峰，计算各组织中DOX含量。结果见图5。7000oo

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oo650040①nss匚6/xoQ6uooooooooo32102040 60801001207000oo

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oo650040①nss匚6/xoQ6uooooooooo32102040 6080100120Time/h9000rooooooooooAuooooooooooo87654321anss匚6/xoo6u50004500oooooooooooooooo050505054332211(DnssLL6/xoq6u20n

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s—DOX-•-SL-DOX*Tf-SL-DOXa)nss匚6/xoCJ6u40 60 80 100 120Time/hKidney DOX亠SL-DOX亠Tf-SL-DOX(Dnss-J.6/XOQ6u02040 60 80 100 120Time/h02040 60 80 100 120Time/hTime/hFig.5.Tissuesdistributionofmiceafteri.v.injectionofFreeDOX(_),SL-DOX(_)andTf-SL-DOX(_).DOXinsolutionorwithinSL-orTf-SL-liposomes(DOX:5mg/kg)wasinjectedviatailveinsoftumor-bearingmice.Atvarioustimesthereafter,themicewerethensacrificedbycervicaldislocation,andtheheart,liver,spleen,lung,kidneyandtumorwereimmediatelyexcised.DOXlevelsweremeasuredbyHPLC.Dataareshownasmeansandstandarddeviation(n=56).由相对摄取率公式计算脂质体组各组织Re参数值见表2。Rel代表AUC/AUC ,Re2代表AUC /AUC。L-DOXI-DOXTf-L-DOXI-DOXTabic2Al(:iilLiusiIfU冥也IoFvurin"timirattrfjvinlti]elisltiL-tk)nofHDOX^L'DOXandTFL-DOXhIdthetuni密「h护；irh吕mi(fTi^LieAlt：\-\)()\L-DOXTFL-DOXL-DOXTFl.-DOXHPiirt114.477.hW7.20.碍0.76l.npc105.S190.9252.9l.曲2.39IfrtiISO.9W3253.0I.MI.V)74.5121.1I10.2I.2l.北Kklney12().0I10.4105.10.920.87Tuti]jjc%IJ66J238.73.Ml5IS''eLtixftis^Lieexfjjj^nce结果显示，Tf-L-DOX与L-DOX在荷瘤小鼠心、肾中的AUC较I-DOX有降低趋势；Tf-L-DOX与L-DOX在荷瘤小鼠肝、脾、肺、肿瘤中的AUC较DOX明显升高，其中Tf-L-DOX在荷瘤小鼠肿瘤中的AUC与Re均较L-DOX也有显著增加。4讨论本实验用交联剂将Tf通过共价结合的方式连接到脂质体表面，交联剂选择不合适或反应条件不当，交联率则可能较低，交联过程也可能影响脂质体或药物的稳定性。本文参照文献方法，利用EDC和S-NHS为交联剂，将Tf连接到脂质体表面。EDC与脂质体上的羧基反应，形成氨基反应活性的R-酰基脲中间体。该中间体在水溶液中很不稳定，易水解暴露出羧基以及N-酰基脲。通过加入S-NHS，可以将该中间体转化为氨基反应活性的S-NHS酯，大大提高了EDC介导的缩合反应的效率，从而提高了蛋白结合效率。流式细胞分析法测定的是与细胞结合的所有DOX的荧光强度，包括吸附在细胞表面的DOX、细胞内的DOX以及被吸附或被内吞的脂质体DOX。DOX溶液与细胞共同孵育后所测得的DOX荧光强度远高于与两种DOX脂质体孵育后的荧光强度，需要指出的是,DOX包载入脂质体后，其荧光可能猝灭，结果使实际测得的荧光强度偏低。细胞毒实验表明在DOX浓度达到100Mmol/L时,Tf-DOX-SL对肝癌细胞的杀伤率达80.2%，而DOX-SL仅为40.31%,两者相比差异有显著性（P<0.