仪器分析第六章 色谱分析法

第六章色谱分析法导论

色谱法或色谱分析法，是一种别离分析技术，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差异，当溶质在两相间作相对移动时，各物质在两相间进行屡次分配，从而使各组分得到别离。可完成这种别离的仪器称为色谱仪。本章教学内容色谱别离仪的根本原理和根本概念色谱别离的理论根底色谱定性和定量分析的方法本章知识目标熟悉色谱分析中的根本术语;了解色谱分析中的塔板理论和速率理论;熟悉影响色谱柱柱效、别离度的因素;熟悉色谱分析中的定性和定量方法。本章能力目标熟练校正因子的计算方法;掌握归一化法、内标法的定量计算方法;掌握外标法，熟练绘制外标法工作曲线并进行定量计算;掌握填充柱的制备方法。第一节色谱及分类

茨维特实验固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚

色带一、色谱法色谱法是一种别离分析技术。它是利用各物质在两相中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行屡次反复的分配来到达别离的目的。色谱法以其具有高别离效能、高检测性能、分析时间快速而成为现代仪器分析方法中应用最广泛的一种方法。固定相——在色谱柱中固定不动的相。可以是固体，还可以是液体。流动相——携带试样混合物流过固定相的流体，是液体或气体。色谱柱——承载固定相的装置。各种材质和尺寸。被别离组分——不再仅局限于有色物质根本术语：二、色谱法分类

1．按两相分子的聚集状态流动相

固定相类型液相色谱液体

固体

液-固色谱液体

液体

液-液色谱气体

固体

气-固色谱气体

液体

气-液色谱气相色谱2．按固定相的固定方式平面色谱

纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱色谱

填充柱色谱毛细管柱色谱

3．按别离机制分分配色谱：利用分配系数的不同吸附色谱：利用物理吸附性能的差异离子交换色谱：利用离子交换原理空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同

色谱法的特点别离效率高：复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。灵敏度高：可以检测出μg.g-1(10-6)-ng.g-1(10-9)级的物质量。分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。应用范围广：气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的别离分析。缺乏之处：被别离组分的定性较为困难。别离过程当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复屡次的分配平衡，使得各组分被固定相保存的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。第二节色谱流出曲线和术语

一、色谱流出线

从进样到被测组分流出色谱柱进入检测器连续测定，得到的检测信号随时间变化的曲线称为色谱流出曲线或色谱图。二、色谱术语

1．基线：操作条件稳定后，无样品通过时检测器所反映的信号一时间曲线。

它反映检测器系统噪声随时间变化。稳定的基线是一条直线。2．色谱峰：从被测组分开始进入检测器至完全流出检测器所形成的峰型局部称色谱峰。基线与色谱峰组成了一个完整的色谱图。色谱峰3．保存值保存时间tM：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间。保存时间tR：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间tM和组份在固定相中滞留的时间。调整保存时间：某组份的保存时间扣除死时间后的保存时间，它是组份在固定相中的滞留时间。死体积Vm：不被保存的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体积，又指色谱柱中未被固定相所占据的空隙体积〔包括色谱仪中的管路、连接头的空间、检测器的空间〕。F0：流动相的体积流速保存体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所消耗的流动相的体积。调整保留体积：保留体积与死体积之差，即组分停留在固定相时所消耗流动相的体积相对保存值is：一定实验条件下组分i与另一标准组分S的调整保存时间之比。相对保存值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，色谱定性分析的重要参数。4.色谱峰区域分析峰高h：色谱峰顶到基线的垂直距离。半峰宽W1/2：色谱峰高一半处的宽度。峰底宽W：从色谱峰两侧拐点上的切线与基线交点之间的距离，也称基线宽度。标准偏差

：峰高(h)的0.607倍处色谱峰宽度的一半。

与半峰宽及峰底宽的关系为：W1/2=2.354

W=4

区域宽度：峰面积〔A〕：由色谱峰与基线之间所围成的面积称为峰面积。定量分析的根本依据。对理想的对称峰：A=1.065hW1/2在相同的色谱操作条件下获得的色谱峰的区域宽度值越小，说明色谱柱的别离效能越好，柱效越高。5.描述分配过程的参数分配系数K：组分在固定相和流动相之间的分配处于平衡状态时，在两相中的浓度之比。K

只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。

分配比k：：

在一定的温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。

=Vm/Vs，表示相比率，是柱型特点参数，对于填充柱，

值一般为6~35，对于毛细管柱，

值一般为60~600。选择性因子：指相邻两组分调整保存值之比。值的大小反映了色谱柱对难别离组分对的别离选择性，值越大，相邻两组分色谱峰相距越远，色谱柱的别离选择性越高。当等于或接近1时，说明相邻两组分不能别离。色谱流出曲线的意义色谱峰数=样品中单组份的最少个数；色谱保存值——定性依据；色谱峰高或面积——定量依据；色谱保存值或区域宽度——色谱柱别离效能评价指标；色谱峰间距——固定相或流动相选择是否适宜的依据。第三节色谱分析根本理论两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的热力学性质决定。每个组分峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程的动力学性质决定。热力学理论：塔板理论——平衡理论动力学理论：速率理论——Vander方程根本理论一、塔板理论

塔板模型：将一根色谱柱视为一个精馏塔，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度。塔板理论假设：在每一块塔板上，溶质在两相间很快到达分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移。对一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数n称为理论塔板数。塔板理论要点当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于50时，可得到根本对称的峰形曲线。当试样进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复屡次的分配平衡后，仍可获得良好的别离。n与半峰宽度及峰底宽的关系式为：有效塔板数和有效塔板高度单位柱长的塔板数越多，说明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。常用有效塔板数n有效表示柱效：例题1：在柱长为2m的5%的阿皮松柱、柱温为1000C，记录纸速度为2.0cm/min的色谱条件下，测定苯的保存时间为1.5min，半峰宽为0.20cm，求理论塔板数。解(1)：解(2)：二、速率理论

速率方程〔也称范.弟姆特方程式〕u为流动相线速度；A，B，C为常数A—分别表示涡流扩散系数；B—分子扩散系数；C—传质阻力系数〔包括液相和固相传质阻力系数〕减小A、B、C三项可提高柱效1．涡流扩散项

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。2．分子纵向扩散项

B=2νDgν：弯曲因子，填充柱色谱，ν<1。Dg：组分分子在气相中的扩散系数〔cm2·s-1〕扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，别离变差液相色谱中的分子纵向扩散可以忽略。对气相色谱，采用相对分子质量较大的N2、Ar为流动相并适当加大流动相流速，可降低分子纵向扩散项的影响.3．传质阻力项

k为容量因子；Dg、Ds为扩散系数。固定相液膜越薄，扩散系数越大，固定相传质阻力就越小，但固定相液膜不宜过薄，否那么会减少样品容量，降低柱的寿命。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。三、别离度1．色谱柱的总别离效能(a)两色谱峰距离近且峰形宽，彼此严重相重叠，柱效和选择性都差；(b)虽能很好别离，但峰形很宽，说明选择性好，但柱效低；(c)别离情况最为理想，既有良好的选择性，又有高的柱效。2.别离度(R)的表达式R值越大，说明两组分的别离程度越高;R=1.0时，别离程度可达98％;R<1.0时两峰有局部重叠;R=1.5时，别离程度到达99.7％;所以，通常用R=1.5作为相邻两色谱峰完全别离的指标。R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间t,min3.色谱别离方程别离度R与塔板数有关;别离度R与保存因子有关系；越大，柱选择性越好，对别离有利。例2：两物质A和B在30cm长的色谱柱上的保存时间分别为16.4和17.63min，有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保存时间为1.30min。物质A和B的峰底宽分别为1.11和1.21min。试问：1〕柱别离度R；2〕柱平均理论塔板数nav3〕平均塔板高度Hav4〕假设要求R到达1.5，那么柱长至少应为多少？4)完全别离,R=1.5【例3】有一根1.5m长的柱子，别离组分1和2，得到如图6-5所示的色谱图。图中横坐标为记录纸走纸距离。(1)求此两种组分在该色谱柱上的别离度和该色谱柱的有效塔板数。(2)如要使1、2完全别离，色谱柱应该要加到多长？求出别离度：

有效塔板数：

【解】〔1〕先求出组分2对组分1的相对保存值2,1(即值)〔2〕该柱有效塔板高度：完全别离的条件是别离度R=1.5此时色谱柱的有效塔板数：要使有效塔板数为4356块，柱长第四节定性和定量分析

色谱法是别离复杂混合物的重要方法,同时还能将别离后的物质直接进行定性和定量分析。一、定性分析色谱定性分析:确定色谱图上每一个峰所代表的物质。依据:在色谱条件一定时，任何一种物质都有确定的保存时间。方法:在相同色谱条件下，通过比较物和未知物的保存值或在固定相上的位置，即可确定未知物是何种物质。方法的开展:色谱与质谱或其它光谱法联用，是目前解决复杂混合物中未知物定性分析的最有效的技术。二、定量分析

色谱定量分析:在一定的色谱条件下，组分i的质量(mi)或其在流动相中的浓度，依据:组分i的质量(mi)或其在流动相中的浓度，与检测器响应信号(峰面积Ai或峰高hi)呈正比。分别为峰面积和峰高的校正因子。

1．响应信号的测量

峰高：峰顶与基线之间的距离，测量比较简单，特别适于较窄的色谱峰峰面积：〔1〕自动测量：色谱工作站。〔2〕手工法测量：手工测量对称的峰:近似计算公式为：A=1.064h·W1/2不对称峰:近似计算公式为:A=h·〔W0.15+W0.85〕/2W0.15和W0.85分别是峰高0.15和0.85处的峰宽值2．定量校正因子

(1)绝对校正因子:组分i的峰面积和峰高的绝对校正因子分别为：绝对校正因子是指某组分i通过检测器的量与检测器对该组分的响应信号之比。mi的单位用克、摩尔或体积表示时相应的校正因子，分别称为质量校正因子(fm)，摩尔校正因子(fM)和体积校正因子(fv)

(2)相对校正因子

相对校正因子：指组分i与基准组分s的绝对校正因子之比.

由于绝对校正因子很少使用，因此，一般文献上提到的校正因子，就是相对校正因子。

表6-1一些化合物的相对校正因子化合物沸点/

C相对分子质量热导池检测器氢焰检测器fMfvfm甲烷-160162.800.451.03乙烷-89301.960.591.03丙烷-42441.550.681.02丁烷-0.5581.180.680.91乙烯-104282.080.590.98丙烯-48421.550.633.定量方法

分类：〔1〕外标法〔2〕内标法〔3〕归一化法〔1〕外标法把待测组分的纯物质配成不同浓度的标准系列；在一定操作条件下分别向色谱柱中注入相同体积的标准样品，测得各峰的峰面积或峰高，绘制A—c或h-c的标准曲线；在完全相同的条件下注入相同体积的待测样品，根据所得的峰面积或峰高从曲线上查得含量。外标法也称为标准曲线法

外标法不使用校正因子，准确性较高；操作条件变化对结果准确性影响较大；对进样量的准确性控制要求较高；适用于日常控制分子或大量同类量试样的快速分析。特点及要求：〔2〕内标法应用前提：当只需测定试样中某几个组分，或试样中所有组分不可能全部出峰时，可采用内标法；准确称取试样，参加一定量某种纯物质作为内标物，然后进行色谱分析;由被测物和内标物在色谱图上相应的峰面积(或峰高)和相对校正因子，求出某组分的含量。