SNT5487-2023 十足目虹彩病毒1感染检疫技术规范

S中华人民共和国出入境检验检疫行业标T十足目虹彩病毒1感染检疫技术规9发 1实中华人民共和国海关总 发中华人民共和国出入境检验检行业标准十足目虹彩病毒1感染检疫技术规*中国海关出版社有限公司出版发北京市朝阳区东四环南路甲1号)编辑部中国标准出版社秦皇岛印刷厂印*521千字年1月第一版年1月第一次印刷1—*书号0T 本文件按照标准化工作导则第1部分标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位中华人民共和国深圳海关深圳市检验检疫科学研究院深圳质标科技有限公司、深圳技术大学中华人民共和国武汉海关中国水产科学研究院黄海水产研究所中华人民共和国湛江海关广西壮族自治区水产科学研究院。本文件主要起草人贾鹏温智清吴江刘荭张娜王津津郑晓聪刘莹邱亮陈孝宇童桂香、杨冰。ⅠT十足目虹彩病毒1感染检疫技术规范围本文件规定了十足目虹彩病毒感染的临床症状规定的套PCR检测方法实时荧光PCR检测方法和综合判定。本文件适用感染的检测和诊断规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。 分析实验室用水规格和实验方法出入境动物检疫采样实验室生物安全通用要求术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义缩略语下列缩略语适用于本文件磷酸腺苷酶CTAB十六烷基三甲基溴化胺m)t循环阈值)十足目虹彩病毒)DNA脱氧核糖核酸)dNTPs三磷酸脱氧核糖核苷酸)EB溴化乙锭)MCP主要衣壳蛋白仪器和设备冷冻离心机微量移液器1T水平电泳仪凝胶成像仪超净工作台二级生物安全柜试剂和材料水2中一级水的规格阳性对照感染的甲壳类动物组织由海关总署指定单位提供阴性对照的甲壳类动物组织空白对照DNA酶的水A1无水乙醇分析纯使用前预冷至-20%0乙酸铵0s饱和酚分析纯。三氯甲烷/异戊醇A2A3酶20℃保存避免反复冻融或温度剧烈变化A4A52×实时荧光PCR预混液套式PCR引物浓度序列如下1e基因p的片段1e基因p的片段实时荧光PCR引物和探针浓度序列如下:MCP基因p的片段采样采样对象和数量采样对象包括凡纳滨对虾罗氏沼日本沼M2T脊尾白虾氏原螯红螯螯虾x斑节对虾P中国对虾P日本对虾Ps和三疣梭子蟹应采集有临床症状的样品参见附。采样数量和样品运送及保存按照8规定执行。样品前处理实验室取样检测时仔虾采集除眼球和眼柄外的完整个体幼虾至成虾阶段可采集鳃肝胰腺造血组织附肢或血淋巴亲虾的非致死检测采集血淋巴附肢或粪便。所取样品组织置于离心管中立即进行A提取或暂存于0℃冰箱。实验室检测条件应符合9的规定。诊断方法设立对照从提取DNA开始每个步骤均需设立阳性对照阴性对照空白对照核酸提取7K25L等体s饱和酚颠倒混合10于n离心3。取上层水相移至新的离心管中加入等体积酚/三氯甲烷/异戊醇颠倒混合10于n离心1。取上层水相移至新的离心管中加入等体积三氯甲烷/异戊醇颠倒混合10于n离心1。取上层水相移至新的离心管中加入0L乙酸铵混匀后再加入两倍体积预冷无水n%每次n离心5倾去上清沉淀于室温干燥30DNA沉淀中加入50μLTE缓冲液20℃保存备用。可使用同等效果的商品化核酸提取试剂盒代替以上方法使用引物F1R1PCR反应体系。在反应管中加10×PCR扩增缓冲液01上游引物01下游引物01q酶5APCR反应条件如下5℃预变性35℃变性9℃退火2℃延伸共5环2℃再延伸24℃保存第一步反应结束后可先将PCR产物进行电泳分析若出现大小目的条带可直接进行测序分析否则需进行第二步PCR反应。使用引物F2R2PCR反应体系。在反应管中加10×PCR扩增缓冲液01上游引物01下游引物01q酶5第一PCR扩增产物2μL,双蒸水补充总体积至25μL。瞬时离心后置PCR扩增仪。3TPCR反应条件如下5℃预变性35℃变性9℃退火2℃延伸共5个循环2℃再延伸24℃保存。琼脂糖凝胶电泳用TBE电泳缓冲液配制5%琼脂糖含L溴乙啶或其替代物凝胶板。将其放入水平电泳槽使电泳缓冲液盖过胶面。取5μLPCR产物和1μL6×上样缓冲液混匀后加入样品孔5m电泳约40n后置于凝胶成像仪观察结果。可采用同等效果的其他方法替代测序对p或p特异PCR扩增产物进行基因测序并将测序结果与参考序列参见附C)k数据基因序列进行同源性比较分析。结果判定阳性对照电泳可见和特异性目的条带阴性对照和空白对照无p特异性目的条带则阳性对照空白对照和阴性对照成立。若对照组不成立则实验无效应重新提取核酸并更换试剂和对照样品重新实验。7p9pk基因序列相符判定为套式PCR检测结果为阳性被检样品经套式PCR检测均未扩增出p或p特异性目的条带或虽有目的条带但测序结果与参考序列或k基因序列不相符则判定套式PCR检测结果为阴性。设立对照见核酸提取见反应体系反应总体积为包含2×实时荧光PCR预混液上游引物下游引物5探针05X参比染料1μL,DNA5双蒸水可使用其他等效的荧光PCR试剂盒代替以上方法反应条件955℃8℃0PCRPCR反应条件做适当调整。结果判定当阳性对照出现典型Ct值阴性对照和空白对照无Ct值且无扩增曲线则阳性对照阴性对照和空白对照成立。若对照组不成立则实验无效应重新提取核酸更换试剂4T和对照样品重新实验Ct值且无扩增曲线可判定为实时荧光PCR方法检测结果为阴性。若被检样品Ct值≤6且有典型型扩增曲线可判定实时荧光PCR方法检测结果为阳性若被检样品36<Ct值应重新提取核酸调整实时荧光PCR反应的模板浓度后重新实验。重新实验后Ct值>6则判定实时荧光PCR方法检测结果为阴性Ct值≤6则判定实时荧光PCR方法检测结果为阳性。综合判定符合下列条件之一判定为疑似感染有典型临床症状套式PCR检测结果阳性实时荧光PCR检测结果阳性符合下列条件之一判定为感染有典型临床症状且套式PCR或实时荧光PCR方法检测结果为阳性无临床症状且套式PCR和实时荧光PCR方法检测结果均为阳性5T附录A规范性)试剂及配方抽提缓冲液1LsH 5LH 2加水定容 高压蒸汽灭菌4保存LlH)5LH 2加入约mL的去离子水均匀混合。溶液定容至10001℃高压灭菌20冷却至室温后4℃保存。0H) 硼 2AH2O 29g加水定容 L H室温 明 6×上样缓冲液溴酚蓝mg加双蒸水5在室温下过夜待溶解后再称取蔗糖25g加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中摇匀后定容至50NaOH溶液1滴调至蓝色。为商业试剂。主要成分qdA聚合酶UNG酶,含有dUTP的实时荧可采用同等效果的其他试剂6T附录资料性十足目虹彩病毒1感染疾病名称十足目虹彩病毒1感染是由十足目虹彩病毒d感染引起的新发甲壳类急性传染病。目前世界动物卫生组织已将该病列疫病名录。病原包含V5CQIV两个分离株两者基因组同源性达%。年7月在中国福建养殖的红鳌螯虾首次鉴定红鳌螯虾虹彩病毒-。4年2月从中国浙江发病的南美白对虾中鉴定出CQIV类似病原虾血细胞虹彩病毒。年基于CQIV和SHIV基因组分析国际病毒分类委员会认定两者为同一种病毒正式将其命名为十足目虹彩病毒1。该病毒是虹彩病毒科十足目虹彩病毒属唯一已知b临床症状该病最适发病水温约为5℃2℃患病虾表现为空肠空胃肝胰腺萎缩颜色变浅停止摄食、活力下降等症状。其中患病罗氏沼虾因额剑基部甲壳下的造血组织被病毒侵染而呈现明显白色病变区域即产业上所说的白头或者白点部分患病凡纳滨对虾会出现体色发红症状。自然条件下凡纳滨对虾和罗氏沼虾感染后累计死亡率为%以上。实验条件下凡纳滨对虾克氏原螯虾和红螯螯虾感染后累计死亡率约%。易感宿主现已确认1易感宿主包括凡纳滨对虾罗氏沼虾日本沼虾脊尾白虾克氏原螯虾红螯螯虾、斑节对虾和三