【Syx】基因工程的基本操作程序第2课时课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

5.表达载体上有哪些元件/部件？6.对目的基因和载体使用双酶切是为了：2.原核生物与真核生物基因的区别：4.与基因组文库相比，cDNA文库中的基因序列缺少：8.复制原点、启动子、起始密码子分别起始哪些过程？化学本质分别是？7.通常用同种酶切割目的基因和载体是为了：复制原点、启动子、目的基因、终止子、标记基因防止目的基因和质粒自身环化，防止目的基因反向连接产生相同的末端有无内含子/编码区是否连续非编码区和内含子复制、转录、翻译；DNA、DNA、RNA1.基因工程的操作步骤包括哪几步？核心步骤是？3.获取目的基因的方法？基因组文库、cDNA文库、化学合成法、PCR9.选择限制酶的注意事项：123465451234121.选择产生不同末端的酶2.酶切位点在启动子下游和终止子上游；不能切割载体的启动子、终止子、复制原点、标记基因3.不能切割目的基因内部选酶1和酶3将目的基因导入受体细胞将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入植物细胞转化的概念:目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞内维持稳定并表达的过程，称为转化。Ca2+处理-感受态显微注射法花粉管通道法、农杆菌转化法、基因枪法将目的基因导入受体细胞植物细胞（2）农杆菌转化法大型环状DNA（可转移的DNA）农杆菌生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达将目的基因导入受体细胞植物细胞（2）农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞植物细胞（2）农杆菌转化法1.构建重组Ti质粒需要的工具酶？2.为什么一定要插入T-DNA上？3.将基因表达载体导入农杆菌时应怎样处理农杆菌？4.受体细胞是普通的体细胞能否得到转基因植株？5.说明两次拼接和两次导入的对象和过程①转基因植物用

；②转基因动物用

(一般不能用体细胞)；

原因是：

。③微生物作为受体细胞的优点是

。④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等则受体细胞为

，原因是

；⑤一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是

。真核细胞分泌蛋白等需内质网、高尔基体等的加工受精卵有发育的全能性无核，无器，不能合成蛋白质体细胞或受精卵受精卵单细胞，繁殖快；遗传物质相对较少，易于培养操作将目的基因导入受体细胞总结-受体细胞的选择目的基因的检测与鉴定将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？首先：其次：接着：最后：还要：标记基因检测目的基因是否导入受体细胞检测转基因生物的DNA是否插入目的基因目的基因的检测与鉴定检测转基因生物的DNA是否插入目的基因变性基因探针：放射性同位素或荧光标记的单链DNA分子待测DNA杂交DNA分子互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链DNA分子的过程称为杂交。方法：DNA分子杂交技术目的基因的检测与鉴定检测转基因生物的DNA是否插入目的基因方法：DNA分子杂交技术醋酸纤维素膜目的基因的检测与鉴定将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？首先：其次：接着：最后：还要：标记基因DNA分子杂交技术检测目的基因是否导入受体细胞检测转基因生物的DNA是否插入目的基因检测目的基因是否转录出mRNA目的基因的检测与鉴定检测目的基因是否转录出mRNA探针转基因生物的mRNA杂交分子（可检测）方法：分子杂交技术目的基因的检测与鉴定将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？首先：其次：接着：最后：还要：标记基因DNA分子杂交技术分子杂交技术抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否导入受体细胞检测转基因生物的DNA是否插入目的基因检测目的基因是否转录出mRNA检测是否翻译出蛋白质目的基因的检测与鉴定检测是否翻译出蛋白质方法：抗原-抗体杂交技术原理：抗原抗体的特异性结合苏云金杆菌提取Bt抗虫蛋白标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交抗原转基因生物目的基因的检测与鉴定将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？首先：其次：接着：最后：还要：标记基因DNA分子杂交技术分子杂交技术抗原-抗体杂交技术功能活性鉴定检测目的基因是否导入受体细胞检测转基因生物的DNA是否插入目的基因检测目的基因是否转录出mRNA检测是否翻译出蛋白质个体生物水平鉴定目的基因的检测与鉴定个体生物水平鉴定方法：功能活性鉴定转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常目的基因的检测与鉴定Bt基因mRNABt抗虫蛋白抗虫棉DNA分子杂交技术抗原-抗体杂交技术分子水平抗虫鉴定个体水平分子杂交技术利用PCR获取和扩增目的基因第三章基因工程全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）可以在短时间内大量扩增目的基因原理操作环境优点PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）的缩写。即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR的概念和原理DNA的基本单位？共有几种？每一分子基本单位由哪些部分构成？回顾DNA复制体内DNA复制的特点？半保留复制、边解旋边复制、半不连续复制子链延伸的方向？5’→3’回顾DNA复制体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链DNA聚合酶只有延伸DNA链的能力，没有起始合成DNA链的能力，怎么办？解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物体内DNA复制的条件使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸

引物：是一小段与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸（20-30个核苷酸）。PCR原理PCR中参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物PCR条件使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸资料：DNA在80-100℃时，双螺旋结构变性解旋，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。高温DNA热变性原理：PCR和DNA的体内复制过程是否完全相同？不完全相同；PCR是双链全部解开后再延伸子链DNA双链单链变性（加热94℃）复性（冷却55℃）加热会影响DNA聚合酶的活性，如何解决？PCR中参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链PCR条件高温先解旋后复制PCR原理PCR中参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物PCR条件使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸高温DNA（目的基因）模板dNTPTaq酶耐高温的DNA聚合酶PCR原理dATP

腺嘌呤脱氧核苷酸dADP腺苷（A)腺嘌呤脱氧核糖PPP~~OHH在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。PCR条件PCR原理PCR中参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物PCR条件使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸高温DNA（目的基因）模板dNTP耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物对（通常为小的单链DNA）PCR原理

引物：是一小段与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸（20-30个核苷酸）。3’5’DNA母链3’5’DNA母链3’5’引物3’5’引物PCR原理使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。

第1组：

；

第2组：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效PCR原理PCR条件-设计引物的原则PCR原理PCR条件-设计引物的原则1.长度适宜2.CG含量适宜3.引物自身及引物之间不应存在互补序列4.引物5’端可以修饰(无需碱基互补配对)，3’端不可修饰5.确保引物序列只在扩增的基因中出现，与其他基因不具有互补性否则自身形成发夹结构或二聚体，影响引物与模板复性结合。若要通过PCR获取目的基因，如何选择引物？PCR原理PCR条件-设计引物的原则目的基因引物A引物B引物C引物D1.是否需要已知目的基因的全部序列？不需要全部序列，但要已知目的基因两端的序列2.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？引物E在两种引物的5’端分别添加上限制酶的识别序列PCR中参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物PCR条件使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸高温DNA（目的基因）模板dNTP耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物对（通常为小的单链DNA）PCR原理缓冲液维持稳定的pH，含有激活Taq酶的Mg2+PCR循环耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（dNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性退火(复性)延伸温度上升到94