氨基酸总量测定作业指导书

氨基酸总量测定作业指导书蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的蛋白质成分，如水解后的产物经月示、胨、肽等最后变成为氨基酸，氨基酸是构成蛋白质最基本的物质。水解后的蛋白质和水解前的蛋白质在物理特性、化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以评价食品的营养价值。氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸仪器价格昂贵，不能普便使用），很多氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量。它们不能以氨基酸的百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氨（氨基酸态氮）的百分率来表示。当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从氮量计算出氨基酸的含量。在评价蛋白质的营养价值时，除了测定蛋白质的含量，氨基酸氮量，还需要对各种氨基酸进行分离、鉴定，尤其对8种人体必需氨基酸进行定性定量分析。1.1单指示剂甲醛滴定法原理氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有一COOH基显示酸性，又含有一NH2基显示碱性。由于这两个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就用碱来滴定一COOH基，以间接方法测定氨基酸的量。反应式以下面三种形式存在：试剂40%中性甲醛溶液，以麝香草酚酞为指示剂，以mol/LNaOH溶液中和0.1%麝香草酚酞乙醇溶液；0.1mol/L氢氧化钠标准溶液。操作步骤称取一定量样品（约含20毫克左右的氨基酸）于烧杯中如为固体加水50毫升），加2〜3滴指示剂，用0.1mol/LNaOH液滴定至淡蓝色。加入中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。再用0.1mol/LNaOH溶液滴定至淡蓝色，记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算氨基酸氮的含量。计算氨基酸态氮（%）=MVX0.014X1/W式中：M一氢氧化钠标准溶液摩尔浓度V—氢氧化内标准溶液消耗的总量（毫升）W—样品溶液相当样品重量（克）0.014—氮的毫摩尔质量g/mmol1.2双指示剂甲醛滴定法原理与单色法相同，只是在此法中使用两种指示剂。从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法此法操作复杂，但准确，不作介绍）相近。单色滴定法稍偏低，主要因为单指剂甲醛滴定法以氨基酸pH值作为麝香酚酞的终点，pH值在9.3而双指示剂法是以氨基酸溶液的pH值作为中性红的终点，pH值为7.0从理论计算看，双色滴定法较为准确。试剂三种试剂同单指示剂法0.1%中性红（50%乙醇溶液）操作步骤取相同的两份样品，分别注入1毫升三角瓶当中，一份加入中性红指示剂2〜3滴，用0・1mol/LNaOH溶液滴定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加麝香草酚酞3滴和中性甲醛20毫升，摇匀，以0・1mol/LNaOH标准溶液滴定至淡蓝色。按下述公式计算计算氨基态氮（%）=M（V2-V1）x0.014/Wx1式中：V2一用麝香草酚酞为指示剂时消耗标准碱液量（毫升）V1一用中性红作指示剂时碱液的消耗量（毫升）M一标准碱摩尔浓度W—样品的重量（克）0.014—氮的量毫摩尔质量（g/mmol）注意事项单色指示剂甲醛滴定法，用碱完全中和一COOH基时pH为8.5〜9.5。测定时样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定。1.3茚三酮比色法原理氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成蓝紫色化合物，可以比色定量。反应式如下：这种反应不是特异反应，主要根据氨基酸的性质而定。根据目前的报道，认为在一些事例中，都能观察到形成紫色的双一1,3—二酮茚。试剂磷酸缓冲液（pH8.04）制备方法如下：先配M/15磷酸二氢钾液：取磷酸二氢钾4.5350克溶于水中，定容至5毫升。M/15磷酸氢二钠液：称取Na2HPO4-12H2O11.9380克，溶于水中，定容至5毫升。取M/15磷酸二氢钾10毫升与M/15磷酸氢二钠190毫升混合即为pH8.04的磷酸缓冲液。2%茚三酮液：称取茚三酮1克，溶于35ml热水中，加入40毫克氯化亚锡（SnCl2・H2O）,搅拌过滤（作防腐剂）。置冷暗处过夜，定容至50毫升。氨基酸标准液：称取试剂纯干燥氨基酸（如异亮氨酸）0.20克，先用少许水溶解并定容至1毫升，摇匀。从容量瓶中取出10毫升于1毫升容量瓶中，加水至刻度。每毫升含氨基酸为2微克/毫升。操作步骤标准曲线制备：精确吸取氨基酸标准液（2微克/毫升）.5,1.01.5,2.02.5,3.0......毫升相当于0,1,2,3,4,5,6......微克氨基酸），分别注入几个25毫升容量瓶中，加水补足为4毫升，再加入茚三酮和磷酸盐缓冲液各1毫升，混合均匀。于水浴上加热15分钟，取出迅速冷至室温，加水至刻度，摇匀。静置15分钟，在570纳米波长下测定消光值并绘制标准曲线。样品的处理同单指示剂法，取澄清的样品溶液2〜4毫升,以下同标准曲线操作。以水代替样液同时作一空白，在570纳米波长下，测定消光值。从标准曲线上查得氨基酸微克量，按下列公式计算出样品中氨基酸含量：氨基酸总量毫克%)=C/(Wx10)x1式中：C一从标准曲线上查得氨基酸数量微克)W一测定的样品溶液相当于样品的重量克)10一把微克换算成毫克注意事项茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响