应用基因敲除技术揭示卵巢早衰分子机制的研究进展

2022应用基因敲除技术揭示卵巢早衰分子机制的研究进展摘要卵巢早衰(prematureovarianfailurePOF)是一种以40岁前功能性卵泡衰竭为特征的复杂疾病。大多数POF病例的病因尚不清楚。近年来，一些突变小鼠模型表现出与人类POF相似的表型。本文综述了与原始生殖细胞形成、减数分裂、卵泡发育及原始卵泡激活相关的基因缺失导致POF的分子机制。【关键词】卵巢早衰；基因敲除；原始生殖细胞；减数分裂；卵泡发育卵巢早衰(prematureovarianfailurePOF)指40岁前由于卵巢内卵泡耗竭或被破坏而发生的卵巢功能衰竭，表现为妇女40岁前非生理性的月经停止，伴有潮热、生殖器萎缩、原发或继发不孕等。按年龄统计POF发病率分别为小于20岁0.01%，20~30岁0.1%，30~40岁1%［1］。病因暂不明确。大多数POF病例的病因是特发性的，可能与自身免疫、遗传、代谢、感染、环境、损伤或医源性原因有关。理论上，POF的发生可能有两个主要原因：①未能获得足够数量的原始卵泡(通常发生在胎儿期)；②原始卵泡过度激活，或抑制了原始卵泡的激活和进一步发育。研究POF病因的主要策略包括：筛选POF患者的候选基因突变、受影响家庭的系谱研究、群体遗传学和转基因小鼠模型的使用［2］。本文回顾了应用基因敲除技术构建的各类小鼠POF模型，以便更好地理解人类POF的分子机制。原始生殖细胞(primordialgermcellsPGCs)发育缺陷导致POF的小鼠基因敲除模型哺乳动物卵母细胞是由PGCs发育而来的。PGCs始于外中胚层经后肠及肠系膜背侧迁移到生殖嵴。PGCs在迁移过程中进行有丝分裂，在生殖嵴胚胎卵巢中形成生殖细胞簇(合胞体)。合胞体经历程序性分解，卵巢中的体细胞侵入生殖细胞簇，逐渐形成原始卵泡。PGCs的发生、发育受一系列关键基因的调控。PGCs发育的缺陷最终会导致生殖细胞和卵母细胞发育的缺陷，或功能性卵泡和卵母细胞的缺乏，从而导致POF。人类的卵子发生、卵泡形成、卵泡发育和排卵过程与小鼠相似，只是发育时间不同。故可以用小鼠特定基因敲除的方式来研究POF的分子机制。目前研究显示，与PGCs迁移及定植相关的基因有：Kit配体(KitligandKL)及Kit、骨形成蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMPs)及间隙连接蛋白(gapjunctionalpha-1protein，GJA)。在小鼠胚胎中，KL在PGCs迁移途中的体细胞组织中表达，在生殖嵴中表达水平最高。Kit则在迁移期及增殖期的PGCs上表达，随着PGCs增殖停止而逐渐消失。小鼠的Steel(Sl)基因位点编码KL，W基因座编码Kit受体，研究人员应用基因敲除技术构建Sl和W位点突变的小鼠，发现了PGCs的不适当迁移，导致生殖细胞缺乏，引起生育力丧失或POF［3］。BMP4-/-、BMP2-/-、BMP8b-/-小鼠胚胎均出现PGCs迁移及发育受限，出现PGCs大量减少或缺如，最终导致生育力下降或原始卵泡丢失完全不孕。BMP信号转导由Smad5蛋白和Smadl蛋白介导。Smad5-/-和Smadl-/-胚胎都显示出PGCs的数量大大减少或根本没有PGCs［4-5］，这表明这一信号通路在原始生殖细胞发育中有重要作用。间隙连接蛋白家族对于PGCs在生殖嵴的定植及存活非常重要。缺少连接蛋白43表达(GJA1-/-)的小鼠第11.5日胚胎(E11.5d)PGCs数量减少，卵巢体积变小［6］。与PGCs增殖相关的基因有：T细胞相关抗原(T-cellintracellularantigen-1-related，TIAR)、锌指转录因子(Zincfingertranscriptionfactor，Zfx)、果蝇RNA绑定蛋白同源物(Nanos)、生殖细胞增殖基因(proliferationofgermcellsPog)及肽基脯氨酸异构酶1基因(peptidyl-prolylisomerase，Pin1)。TIAR属于核糖核蛋白家族，是一种RNA结合蛋白，已证实是凋亡调节因子°Tiar-/-)、鼠，E11.5dPGCs增殖受限，凋亡增加，E13.5d没有卵原细胞，完全丧失生育能力［7-8］。Zfx位于X染色体上，Zfx-/-、鼠E11.5d，PGCs数量减少50%，成年小鼠生育率降低，生殖寿命缩短［9］。果蝇RNA结合蛋白Nanos的同源物被认为是PGCs增殖的调节因子。研究显示Nanos3-/-小鼠存在PGC向生殖迁移途中出现增殖和存活的缺陷［10］。Nanos3-/-雌性小鼠在E12.5d时性腺中仍缺乏PGCs［10］。Pog是为维持生殖细胞增殖的重要基因。Pog-/-小鼠卵巢在出生生殖细胞数量显著减少，成年期缺乏生殖细胞，小鼠不孕［11］。Pin1是一种参与细胞周期进程的肽基脯氨酰异构酶。在Pin1-/-＞胎中，由于细胞周期进程受损，PGC的数量增长非常缓慢。细胞周期进展缓慢导致出生时卵母细胞数量减少［12-13］。与PGCs分化和凋亡相关的基因有：转录因子Oct4、抗凋亡基因Bcl-x、Dazla和Fancg等。Oct4是胚胎发育的关键基因，在生殖细胞特异性敲除Oct4的小鼠中观察到大量PGCs凋亡，POF，原发不孕［14-15］oBcl-x是Bcl-2家族的抗凋亡因子，是胚胎期生殖细胞凋亡的重要调节因子。在Bcl-x功能降低的小鼠模型中PGCs在E15.5d已耗尽［16］。Dazla基因已被证明是生殖细胞分化相关。破坏Dazla基因导致胚胎中生殖细胞数量减少，成年卵巢中完全没有功能性卵泡［17］。范科尼贫血(Fanconianemia，FA)是一种多器官发育异常异质性常染色体隐性遗传病。Fancg-/-小鼠出生时生殖细胞减少了50%，出生后36周卵巢卵泡消失，导致POF［18］。Fanca-/-和Fancc-/-缺陷模型也有类似的表现［19］。卵泡抑制素是卵巢发育的另一个重要因素，它在Wnt家族成员4(Wntfamilymember4，Wnt4)信号下游发挥作用°Wnt-/-和Follistatin-/-小鼠在出生时由于生殖细胞丢失而不育［20-21］，这表明Wnt4信号对维持雌性生殖系至关重要。上述用基因敲除或条件基因敲除技术构建的小鼠模型证明了PGCs对维持雌性小鼠的孕前生殖能力和正常生殖寿命的重要性。减数分裂特异性基因突变导致POF的小鼠模型原始卵泡的卵母细胞停滞在第一次减数分裂的双线期。DNA错配修复蛋白对修正已进入减数分裂的卵母细胞DNA复制和染色体间的相互作用至关重要。这些蛋白质被归类为错配修复系统MutS或MutL的同源物。主要有：孢子形成蛋白11(sporulationprotein11,SPO11)[22]、破坏减数分裂cDNA1同源物(disruptedmeioticcDNA1homolog,DMC1)[23]、mutS同源物(mutShomolog,MSH)4、MSH5[24]和共济失调毛细血管扩张突变同源物(ataxiatelangiectasia-mutatedhomolog,ATM)[25],这些蛋白对原始卵泡的形成很重要°Spo11-/-雌性大鼠原始卵泡的数量减少，成年Spo11-/-雌性大鼠则缺乏成熟卵泡而完全不育[26-27]oDmc1-/-由于卵原细胞在第一次减数分裂早期停止，出生后第17日(postnatalday17,PD17)卵巢没有卵泡。MSH4和MSH5是减数分裂特异性蛋白，可能作为异二聚体蛋白复合物发挥作用。Msh4-/-和Msh5-/-则分别表现为PD4及出生后2个月左右卵巢卵母细胞消失。另一个重要的减数分裂特异基因共济失调毛细血管扩张突变同源物(ataxiatelangiectasia-mutatedhomolog，Atm)在DNA双链断裂时被激活，参与DNA损伤检查点控制。Atm-/-雌性小鼠也由于胚胎期卵母细胞减数分裂错误而发生凋亡增加，在PD11时卵母细胞基本已消失。REC8是减数分裂黏合蛋白复合物的关键组成部分。由于减数分裂失败导致PD5完全缺乏卵母细胞，Rec8-/-小鼠是不育的［28-29］。淋巴特异性螺旋酶(lymphoid-specifichelicase,Lsh)参与小鼠基因组DNA甲基化和重复序列转录沉默的调控。敲除Lsh基因会导致减数分裂过程中产生非交换染色体，减数分裂早期障碍，卵母细胞凋亡。Lsh-/-卵巢在出生后缺乏卵母细胞［30］。细胞质多糖基化元件结合蛋白(cytoplasmicpolyadenylationelementbindingprotein,Cpeb-/-)雌性小鼠在E18.5d时没有卵母细胞，原因是卵原细胞向卵母细胞转化的过程中，突触复合体的形成和生殖细胞分化受损［31］。细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependentkinase2，Cdk2)在细胞周期中与细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E结合后激活，并促进细胞从G1期到S期和从S期到M期，对卵母细胞的减数分裂过程非常重要。Cdk2-/-小鼠在卵母细胞减数分裂I期间，由于着丝粒和突触复合蛋白3(synapticcomplexproteins，SYCP3)的定位不当而不育，PD2小鼠已无卵泡［32］。上述突变小鼠模型的研究提示：减数分裂相关基因突变引起的卵母细胞早期减数分裂缺陷会导致原始卵泡形成障碍。进一步表明：减数分裂事件在卵泡形成中起重要作用，卵泡形成是建立卵泡初始池的关键生物学事件。卵泡发育缺陷及原始激活异常的突变小鼠模型卵泡发育缺陷将导致功能性卵泡缺失和无排卵。本节总结了卵泡发育缺陷的突变小鼠模型。生长分化因子9(growthdifferentiationfactor，9GDF9)和BMP15是转化生长因子家族成员。Gdf9-/-雌性小鼠由于初级卵泡期卵泡发育停止而不育。Bmp15-/-小鼠属于生育率低下，产仔数减少，排卵减少，受精率降低，与POF相关［33］。连接蛋白37是连接蛋白家族的一个重要成员，它介导卵母细胞和颗粒细胞之间的通讯，这是卵泡发育所必需的。缺乏连接蛋白37的小鼠由于缺乏成熟卵泡而不育［34］。卵泡刺激素(follicle-stimulatinghormoneFSH)对卵泡发育至关重要。FSH或FSH受体的破坏导致卵泡发育受损，小鼠不育。在芬兰家族中也发现了FSH受体突变导致遗传性高促性腺激素卵巢功能衰竭。但也有大量研究表明FSH受体的多态性变异，并不是POF的原因［35］。雌激素通过其雌激素受体发挥作用，雌激素受体多态性与POF相关。卵巢中雄激素受体缺失小鼠颗粒细胞凋亡增加，卵泡数量减少，生育能力低下［36-37］。精子发生和卵子发生特异性碱性螺旋环螺旋(spermatogenesisandoogenesisspecificbasichelix-loop-helix1SOHLH1)是一种与人类同源的螺旋环螺旋转录因子。Sohlh1-/-雌性小鼠由于卵泡发育缺陷而不育；在PD21时，Sohlh1-/-卵巢没有卵母细胞°Lhx8编码LIM同源结构域蛋白在Sohlh1-/-卵巢中表达下调，Lhx8-/-小鼠也因在PD7时缺乏卵母细胞而不育［38］。转录因子的亚单位Taf4b在卵泡的颗粒细胞中表达。Taf4b-/-小鼠卵巢很小，原始卵泡和生长卵泡的数量减少，缺乏成熟卵泡，凋亡卵泡的比例增加。Taf4b-/-卵泡对雌激素、FSH等多种激素不敏感，大量的颗粒细胞凋亡［39-40］。胰岛素样肽3(insulin-likepeptide，3INSL3)是新激素松弛素家族的一员，基因沉默实验表明INSL3是合成雄烯二酮所必需的［41］。雄烯二酮是窦状卵泡颗粒细胞产生雌激素的主要类固醇前体。在小鼠中进行的基因敲除研究证实，雌性小鼠INSL3或其受体的缺失导致部分不孕，卵泡数、排卵和产仔数减少。多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome，PCOS)的易感基因RPS26，它是一种核糖体蛋白编码基因，在卵巢中高度表达。特异性敲除小鼠卵母细胞中Rps26基因会导致窦前卵泡向窦卵泡发育迟缓，而卵母细胞的染色质结构在非包围核仁(non-surroundednucleolus，NSN)向质构型由NSN向SN的转变对卵母细胞的基因表达调控和获得减数分裂和发育能力起着关键作用。近年的研究显示，核仁蛋白DCAF13是核糖体包围核仁（surroundednucleolus包围核仁（surroundednucleolusSN)型的转变中受阻［42］。染色RNA（ribosomalRNA，rRNA）加工复合物的重要组成部分，对小鼠卵母细胞NSN-SN转化至关重要［43］。在卵母细胞中有条件地敲除Dcaf13导致NSN构型中的卵母细胞发育停滞、卵泡闭锁、POF和女性不育［43］。减数分裂解旋酶（helicaseformeiosis，1HFM1）被广泛认为是ATP依赖的DNA解旋酶，主要在生殖细胞中表达［44］。在小鼠原始卵泡期卵母细胞中，特异性敲除Hfm1可导致小鼠卵泡储备减少和低生育能力。在特异性敲除Hfm1卵母细胞中，可以很容易地观察到异常纺锤体、染色体错位、皮质肌动蛋白帽丢失和极体挤出失败。在人类中，为了确保适当的生育力，部分原始卵泡必须在卵巢中以静止状态存活数十年。只有有限数量的原始卵泡被不断激活，进入生长卵泡池中。同时，由于卵母细胞凋亡，大量的原始卵泡逐渐闭锁［45］。卵母细胞特异性基因Figla对原始卵泡的形成至关重要在Figla-/卵巢中，胚胎性腺发育似乎是正常的，但出生时没有形成原始卵泡。大量的卵母细胞耗竭导致雌性小鼠卵巢萎缩和不孕［46］。Sl等位基因的突变导致新生儿卵巢原始卵泡减少20%，卵泡发育阻滞在初级卵泡期，在PD45时大部分卵泡消失［47］。另一种卵母细胞特异性因子新生儿卵巢同源盒编码基因（newbornovaryhomeoboxencodinggene,NOBOX)对原始卵泡向初级卵泡的转变具有重要意义。在Nobox-/-小鼠中，卵母细胞减数分裂时间延长和原始卵泡向初级卵泡的转化受损导致出生后卵母细胞加速丢失。