实验四 麦清蛋白的初步提取(预习报告)

生物化学实验预习报告实验四麦清蛋白的初步提取一、研究背景无论是在科学研究还是商业化产品的开发中，生物大分子的分离纯化似乎都是一个永恒的话题。针对某一类物质的分离，人们通过寻求它们之间的共性特征而发明并利用了诸多的分离纯化技术。然而随着人们对某一特定目标产物活性与纯度的需求逐渐增大，而同类物质之间彼此性质的相似性使得精确的分级难度随之加大，二者之间的矛盾刺激人们不断探索新的技术以提高纯化水平。与此同时，人们也开始将注意力从共性转移到目标物自身的独特性质上来，导致了众多分离纯化新技术的产生与应用。在所有的分离纯化技术中，层析技术以其独特的优势始终占据着生物大分子纯化的主导地位。层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术，从本质上来讲它就是将目标分离产物与杂质的显著差异转化为迁移距离上的差异，从而达到分离提取的目的。层析法具有明显的优势：（1）从理论上来讲，只要迁移距离足够长，任何物质都可以从其所在的混合体系中被分离出来；（2）除了定性能力较差以外，层析法几乎囊括了物质分析纯化中的所有优点，比如分离效率高、速度快，样品用量少、检测灵敏度高、分析速度快、易于自动化管理等；（3）基于不同的原理，层析法衍生出诸多的操作技术，在实际应用中可以根据待分离物质的特定性质选择适合的操作技术。基于以上原因，层析法在分离高纯度、高活性的生物大分子中有着不可替代的作用。二、研究目标1.以凝胶过滤层析法完成麦清蛋白的脱盐以验证该技术的可行性；2.掌握层析技术的基本操作技巧；3.体会相关技术的发明思路和历程，领悟新技术的发明对边缘性实验学科的重要作用。三、研究策略凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（SizeExclusionChromatography）、分子筛层析（MolecularSieveChromatography）或凝胶渗透层析（GelPermeationChromatography）。凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱；中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，由于分子量大小不同的物质被洗脱的时间是一定的，经过层析柱后，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。在凝胶过滤层析中，选择适宜的凝胶是取得良好分离效果最根本的保证。蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等，一般常用排阻极限较小的凝胶类型。选择时要依据分离的具体情况而定，例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。四、研究方案及可行性分析本次实验我们以新鲜的小麦种子为材料，分离纯化麦清蛋白。（1）使用硫酸铵的中性盐沉淀法对麦清蛋白进行粗分离，分离后的蛋白质中含有无机盐等小分子杂质。（2）采用凝胶过滤层析法脱盐，连续收集洗脱液。（3）用紫外分光光度计测定各阶段收集液的OD280值以检测蛋白含量，确定蛋白质峰值管并保存（后续的实验六中SDS测定分子量及纯化效果）。（4）采用比浊法以BaCl2检测纯化产物中硫酸根离子的存在情况从而判断凝胶过滤层析的脱盐效果。实验方案合理，简便易行，实验材料及器具基础生物化学实验室均可提供，时间上也允许，故本方案具有较高的可行性。五、具体实验设计1.实验仪器及试剂仪器：离心机、托盘天平、紫外分光光度计、层析柱、恒流泵、部分收集器；；器具：微量可调手动移液器、研钵；试剂：饱和（NH4）2SO4溶液、1%的BaCl2溶液、洗脱液、蒸馏水；材料：新鲜小麦种子、葡聚糖凝胶G-25。

2.实验步骤（1）溶胀凝胶（教师完成）称取适量葡聚糖凝胶G-25→加入足量蒸馏水或洗脱液→沸水浴溶胀5h→搅拌使其悬浮→静置，使大部分凝胶沉降→用倾斜法除去含细碎颗粒的上层液→反复多次，直至无细颗粒为止→将凝胶在真空干燥器中减压除气，准备装柱（2）装柱（3.5h）层析柱下端止水→装入约1/4柱长的洗脱液→倒入凝胶，开启洗脱→装柱至3/4左右，注意使柱中凝胶一直处在溶液中（注意装柱完成后层析柱下端需适时止水以保证洗脱液面高于凝胶页面3~5cm）→凝胶沉降完成，旋上柱帽并连接洗脱系统，平衡洗脱3h→连接恒流泵和收集检测系统，调节好流速和收集系统以备下用（控制流速为每滴10秒，收集量为每管3毫升）（3）盐析法分离提取麦清蛋白（2h）粉碎2g小麦种子→置于三角瓶中，加20ml蒸馏水→连续震荡0.5h，再间歇震荡0.5h→3000r/min离心20min，取上清液（澄清透明，否则再过滤）→用醋酸调pH至4.7→边搅拌边加入等体积的饱和硫酸铵溶液，有白色絮状沉淀产生，冰箱冷藏室过夜→3000r/min离心20min，弃上清液，加2ml去离子水充分溶解沉淀，得混合液，准备上样脱盐。（4）上样（1h）在柱内放入滤纸片→用恒流泵加速按钮使洗脱液面和胶床表面相齐，停止洗脱→将1ml样品提取液注入凝胶床面中央，开启洗脱和收集器收集→待样液与凝胶床面相齐时用滴管加入略高于刚才上样高度的洗脱液（重复两次）→用滴管加入3~5厘米高的洗脱液层→戴上柱帽，连续洗脱收集（5）洗脱、收集和鉴定（1.5h）每3ml收集一管→用紫外分光光度计在280nm处测消光值→以管号为横坐标，消光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，确定蛋白峰值管（保留蛋白峰值管，实验六SDS测定其分子量并检测纯化效果）→分别向各管加入两滴1%的BaCl2溶液（蛋白峰值管中不要加入BaCl2），比浊法比较脱盐效果。（6）原始数据记录处管号1234567OD280管号891011121314OD280管号15161718192021OD2803.实验所需时间预计本实验共需时间约8h。4.误差分析（1）装柱时应保证层析柱的均一性，否则会严重影响分离的结果。合格的凝胶柱应该上下均一，无界面、气泡和裂隙。（2）实验过程中应严格控制流速（6滴/分）与收集量（3毫升/管）。（3）调等电点（pH4.7）时应该严格控制pH，保证麦清蛋白能够充分沉淀。（4）上样洗脱时加入洗脱液的体积要略高于（过高会使样品稀释，影响分离效果）上样高度，以便将残留在柱子内壁上的样品集中洗入胶柱（避免样品损失）。六、质疑及相关思考1.盐析后含有蛋白质沉淀的体系需要在冰箱内冷藏过夜，本实验由于时间的限制这一点显然无法做到，因此需要缩短时间。2.本实验在加入中性盐硫酸铵之前需调节pH4.7，而在实验三已经了解到实验室并未配备pH计，但仅靠pH试纸无法达到如此高的精确度。另外了解到麦清蛋白的等电点为4.5~4.7，故个人建议在保留使用pH试纸的条件下调节pH4.5。3.层析柱的大小、长短也会对分离结果产生一定的影响，本实验是如何选择与考虑的？七、思考题1.生物大分子有哪些可利用的性质来完成其自身的纯化？（1）利用酸碱性质与等电点的差异，如等电沉淀、等电聚焦电泳等；（2）利用电荷性质，如电泳、离子交换柱层析；（3）利用溶解度差异，如盐溶与盐析、有机溶剂沉淀、变性沉淀等；（4）利用分子大小与形状差异，如透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤层析等；（5）利用吸附特性，如吸附层析；（6）利用特异性亲和力，如亲和层析。2以至少两种纯化生物大分子的层析技术为例，探讨它的发明思路。（1）凝胶过滤层析：在蛋白质的粗分级中常用的分离手段是中性盐沉淀以及等电点沉淀，而两种方法所面临的一个问题就是如何除去粗分离后蛋白质中残留的无机小分子。透析法的出现基本上解决了这个问题，但是操作十分繁琐，不仅需要多次更换大量的透析液，同时不断的搅拌经常会破坏蛋白质空间结构，且最终小分子杂质的去除并不彻底；随后人们对透析法稍作改进便发明了超滤法，使得操作过程简便了许多，该法通过加压、离心等处理方式，使水分子穿过半透膜快速离开而大分子蛋白质被截留浓缩，在此过程中同样会产生较强的机械力，蛋白质结构的破坏在所难免，最终其活性回收率并不高。因此，人们迫切需要一种简便、快速且蛋白质活性回收率高的脱盐手段。就在这时，尺寸排阻效应的理论基础已经建立，且蛋白质等生物大分子与无机小分子具有显著的大小差异，凝胶过滤层析法便应运而生。随后，在该技术的应用过程中，人们也用它来分离相对分子质量相差较大的生物大分子、溶液浓缩及分子量测定等。（2）亲和层析：进行生物大分子的分离纯化就是要除杂，因此人们利用它们各种各样的特性来发明了诸多的分离纯化技术。但是，当混合体系中存在与我们所要分离的目标物性质十分相似的生物大分子杂质时，一些方法就显得苍白无力。以蛋白质为例，我们要从体系中分离出一种目标蛋白，而杂质中偏偏存在与该蛋白酸碱性、电荷性质、分子大小和形状、溶解度等诸多性质非常相似的物质，普通方法却无法将该杂质除去。此外，在分离纯化目标物时，其活性与纯度往往是比较看重的一个因素，而一些方法往往是顾此失彼。这时人们就将注意力从寻找共性转移到寻找目标物的特性上，而目标物本身就存在可与某些特异性配基专一、可逆性结合的特性，如酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体、外源凝集素与多糖类、核蛋白与核酸等之间均存在专一的相互作用。再加上色谱法的在生物大分子的分离纯化中广泛应用，人们自然想到使这些相互作用物质其中一方与不溶性担体（如葡聚糖等惰性凝胶）形成共价结合化合物，用来作为层析介质，当含有目标物（另一方）的混合物流经该介质时就能与配体特异性结合，用特定的洗脱液洗脱便可除去目标物以外的杂质，最后改变洗脱条件使目标物从配体上分离，达到了纯化的目的。快速、高效，目标物纯度高、活性好，亲和层析法就这样产生应用到了生物学研究中。3.试着探讨一下一项新技术发明的思维及实施过程。一项新技术的发明大概需要以下几步：（1）原有技术在某个方面明显表现出不足，而人们在研究过程中却需要用到这方面的特性，落后的技术不能满足科技的发展需求，二者之间产生矛盾，这样就会刺激人们去探寻新的技术来解决这一问题；（2）在发明新技术时，首先要对需要达到的目标有一个定位，然后在当前已经建立的知识体系中找出可能实现该目标的理论基础；（3）随后将理论基础经过加工改造而设计出新的技术，这应该是比较难也是很耗费时间的一步，是新技术产生的核心；（4）新技术在大规模投入使用之前（实验室阶段）需要对其进行检验，一来确定是否达到预期目标，二来检测技术本身的稳定性、重现性等是否符合要求；（5）在检测其合格之后，新技术开始大范围使用；（6）在实际使用的过程中，可能会遇到一些小问题，需要对技术进行调整与改进使其逐步趋于完善。4.中性盐沉淀中硫铵分级沉淀是蛋白质粗分级中最常用的手段，为什么？中性盐沉淀的原理是大量中性盐加入使水活度降低，它们在争夺溶剂水的同时破坏蛋白质表面的水化层，使疏水氨基酸暴露，从而发生聚集沉淀下来。不同蛋白质分子表面的疏水氨基酸含量不同，溶解度也存在差异，因而沉淀所需中性盐浓度也不一致。因此使用特定浓度的中性盐可使目标蛋白从混合体系中得到初级分离。硫酸铵分级沉淀之所以被常用于蛋白质的粗分级，原因是：（1）硫酸铵属于惰性物质，不易与其他生物活性物质发生反应，在纯化过程中能最大程度的保护蛋白质活性，不易使蛋白质变性；（2）硫酸铵为二价离子，等浓度时离子强度高，能更有效的降低蛋白质溶解度；（3）硫酸铵在水中的溶解度大、温度系数小，在低温时仍可以高浓度存在，既能够满足低温沉淀某些蛋白质的需要，又能有效争夺溶剂水和破坏蛋白质水化层，使蛋白质有效沉淀；（4）硫酸铵溶解性好也为后续的高盐纯化做准备，便于洗涤去除。5.本次实验中，洗脱液应该是什么？选择的依据是什么？选择洗脱液时应该考虑以下几点：（1）由于分离目标物为蛋白质，在等电点时溶解度最小，故洗脱液应该具有一定的pH且原则上应远离目标蛋白的等电点，避免蛋白质沉淀堵塞层析柱，影响分离效果；（2）对于分子量较大的物质，溶液的粘度随浓度（一般不超过4%）增加而增大，会使分子运动受限，故洗脱液与样品的相对粘度不得超过1.5-2；（3）洗脱液应与溶胀剂一致，否则改换溶剂会使凝胶体积产生改变，影响分离效果；（4）要考虑填料对分离物的吸附作用，本实验填料为交联葡聚糖凝胶，它为弱酸性物质，