生物人教版选修3学案1-1DNA重组技术的基本工具

专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具知识点一基因工程的概念与原理1．基因工程的概念(1)基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。(2)对基因工程概念的深度理解别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达目的定向改造生物的遗传性状注意：加热杀死的S型细菌和活的R型细菌一起培养能得到活的S型细菌，此实验的原理是基因重组，是外源基因在自然状态下导入细胞内，因此不属于基因工程的范畴。2．基因工程的原理基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因(目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。具体地说，基因工程就是在DNA分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。说明：对于基因突变而言，变异是不定向的，但基因工程使生物产生新的性状变异，却是定向的，是按照人们的实际需要进行的有目的的改造。基因重组的三种主要类型1．基因的交叉互换：减数第一次分裂四分体时期，同源染色体上的非姐妹染色单体间的交叉互换。2．基因的自由组合：减数第一次分裂后期，非同源染色体上的非等位基因随着非同源染色体的自由组合而组合。3．基因工程：转基因生物因外源基因导入而获得的新性状是可以遗传的。【典题精练1】20世纪70年代，科学家创立了一种新的生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是()A．定向提取生物体的DNA分子B．定向地对DNA分子进行人工剪切C．在生物体外对DNA分子进行改造D．定向地改造生物的遗传性状【解析】基因工程是在生物体外通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”等过程，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性生殖，使重组基因在受体细胞内表达，创造出人类所需的基因产物，也就是定向地改造生物的遗传性状。【答案】D解题归纳基因工程最突出的优点是打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物之间、动植物之间、原核生物与真核生物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。基因工程所依据的原理是异源DNA(基因)重组。【典题精练2】下列叙述符合基因工程概念的是()A．在细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，赋予生物新的遗传特性B．将人的干扰素基因重组到质粒上后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上【解析】基因工程是在生物体外将DNA进行重组，赋予生物以新的遗传特性，A错误；B项符合基因工程的概念；C项属于诱变育种；D项外源基因导入细菌不是人为操作的，不属于基因工程的范畴。【答案】B知识点二限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1．限制性核酸内切酶的概念、来源及作用概念限制性核酸内切酶是能够识别和切割DNA分子的酶，又称为限制酶来源多数来自原核生物作用特点对双链DNA分子上某种特定的核苷酸序列进行识别与切割，具有专一性作用实质使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开作用结果切断DNA，形成的DNA片段末端有两种形式——黏性末端和平末端1．限制酶是一类酶，而不是一种酶。2．限制酶的成分均为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。3．限制酶作为酶类，其催化作用具有高效性、专一性和作用条件温和等特点。其专一性表现为每种限制酶只能识别双链DNA分子中特定的脱氧核苷酸序列，并从特定的位点切割双链DNA分子。当识别序列发生基因突变后，原限制酶将无法进行切割。4．限制酶主要来源于原核生物，如细菌。在原核细胞内，限制酶起切割外源DNA，防止寄生生物侵染的作用。含有某种限制酶的微生物的DNA分子中通常不具备该酶的识别序列，或通过甲基化酶将甲基转移到识别序列的碱基上，从而使自身的DNA相安无事。2．黏性末端和平末端(1)黏性末端：是限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开形成的，如下图所示。(2)平末端：是限制酶在识别序列的中心轴线处将DNA的两条链分别切开形成的，如下图所示。说明：黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有相同碱基序列而且碱基互补配对的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对重新结合，而具有平末端的两个DNA片段不容易结合。3．限制酶的识别序列的特点在限制酶所识别的序列上，都可以找到一条中心轴线，如图所示，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如：eq\b\lc\\rc\|(\a\vs4\al\co1(\o(\s\up17(GC),\s\do15(CG))))eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(\o(\s\up17(GC),\s\do15(CG))))以中心线为轴，两侧碱基互补对称；eq\o(\s\up17(CCAGG),\s\do15(GGTCC))为eq\o(\s\up17(A),\s\do15(T))为轴，两侧碱基互补对称。对限制酶切割DNA分子后的情况分析1．限制酶切割DNA分子后产生的具有平末端的两个DNA片段不容易结合。2．若用限制酶切割后的DNA分子长度不变，则该DNA分子是环状的。3．不同限制酶可以切出相同的黏性末端，切割后的DNA分子的碱基可以互补配对，只是这种情况较少。如限制酶1识别序列及切点：—↓GATC—，限制酶3识别序列及切点：—G↓GATCC—，它们切割后的黏性末端相同。4．限制酶切割后的DNA分子自行断开，不需要解旋酶。【典题精练3】下列关于限制性核酸内切酶的叙述中，错误的是()A．它能在特殊位点切割DNA分子B．同一种酶切割不同的DNA分子产生的黏性末端能够很好地进行碱基配对C．它能任意切割DNA，从而产生大量DNA片段D．每一种限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列【解析】限制性核酸内切酶是基因工程中所需的重要工具之一。每种限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。同一种酶切割不同的DNA产生的黏性末端的碱基能够互补配对。【答案】C解题归纳限制酶具有专一性，一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并且在特定切点切割，切割后得到相同的黏性末端或平末端，而且两个黏性末端的碱基能够互补配对。【典题精练4】下图表示两种限制性核酸内切酶识别DNA分子的特定序列，并在特定位点对DNA进行切割的示意图，请回答以下问题：(1)图中甲和乙代表____________________________________。(2)EcoRⅠ、HpaⅠ代表________________________________。(3)图中甲和乙经过相应操作均形成两个片段，切口的类型分别为________、________。甲中限制酶的切点是________之间，乙中限制酶的切点是________之间。(4)由图解可以看出，限制酶的作用特点是____________________________________________________________________________。(5)如果甲中碱基G发生基因突变，可能发生的情况是____________________________________________________。【解析】解题关键是弄清楚限制酶作用的特点。若基因突变刚好发生在限制酶切点部位，则该酶就不能识别变异后的碱基序列。从图解可以看出，甲和乙代表的是不同的DNA片段，在相应的限制酶(EcoRⅠ、HpaⅠ)的作用下，在特定的位点被剪切成两部分。前者是在识别序列的中心轴线两侧分别切开，形成的末端是黏性末端；后者是在识别序列的中心轴线处切开，形成的末端是平末端。【答案】(1)有特殊脱氧核苷酸序列的DNA片段(2)两种不同的限制酶(3)黏性末端平末端G、AA、T(4)能识别双链DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列，并从特定的位点将双链DNA分子切开(5)限制酶不能识别切割位点知识点三DNA连接酶——“分子缝合针”1．DNA连接酶的概念能催化双链DNA片段紧靠在一起的3′羟基末端和5′磷酸末端之间形成磷酸二酯键，使两条DNA链连接起来的酶。2．DNA连接酶的种类根据酶的来源不同可分为：种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只能连接黏性末端可以连接黏性末端或平末端，但连接平末端的效率较低几种工具酶的作用比较1．限制性核酸内切酶与DNA连接酶的比较：(1)区别：作用应用限制性核酸内切酶使特定部位的磷酸二酯键断开用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于基因表达载体的构建(2)两者的关系可表示为：2．限制性核酸内切酶与解旋酶的比较：(1)相同点：都是作用于DNA分子中的化学键。(2)不同点：作用部位不同，前者作用于磷酸二酯键，后者作用于氢键。3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：4.四种酶的作用部位图解：(1)作用于a(磷酸二酯键)的酶：限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶。(2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶。【典题精练5】现有一长度为1000个碱基对(bp)的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，用KpnⅠ单独酶切得到400bp和600bp两种长度的DNA分子，用EcoRⅠ、KpnⅠ同时酶切后得到200bp和600bp两种长度的DNA分子。该DNA分子的酶切图谱正确的是()【解析】从题干中“用限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1000bp”，再结合选项中DNA分子的可能酶切图谱分析可知，此DNA分子是环状，故A、B排除。同理，从“用KpnⅠ单独酶切得到400bp和600bp两种长度的DNA分子”，又可推知图谱中应有两个KpnⅠ酶切位点，故选D。【答案】D【典题精练6】下面几种是限制性核酸内切酶切割DNA分子后形成的部分片段。请回答下列问题：①eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…CTGCA,…G))②eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…G,…CTTAA))③eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…TG,…AC))④eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…G,…CTGCA))⑤eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…GC,…CG))(1)以上DNA片段是由________种限制性核酸内切酶切割后产生的。(2)若要把相应片段连接起来，应选用________(填“DNA聚合酶”或“DNA连接酶”)。(3)找出能连接的对应片段并写出连接后形成的DNA分子：_________________________________________________________。【解析】一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割。题中①④的黏性末端相同，是由同一种限制酶切割形成的，其他三种片段的末端都不相同，所以这些片段是4种限制性核酸内切酶切割后产生的。DNA连接酶与DNA聚合酶作用不同，DNA连接酶是在两个DNA片段间形成磷酸二酯键，将两条链上的两个缺口同时连接起来。【答案】(1)4(2)DNA连接酶(3)eq\o(\s\up17(…CTGCAG…),\s\do15(…GACGTC…))知识点四基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1．载体的作用基因工程中载体又称为运载体，主要作用是与含有外源基因(即目的基因)的DNA片段结合，将外源基因送入受体细胞中。基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别项目基因工程中的载体细胞膜上的载体蛋白化学本质双链DNA分子蛋白质基本单位脱氧核苷酸氨基酸2.载体必须具备的条件(1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，供外源基因插入。(3)具有标记基因：具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。(4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。3．载体的种类(1)质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒是目前最常用的载体。(2)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。注意：天然质粒要经过人工改造后才能用作载体。1．获取目的基因和切割载体时使用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端或平末端。2．获取一个目的基因需用限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。3．选择限制酶切割位点必须保证标记基因的完整性，以便于检测。4．为了防止目的基因自身环化，使目的基因和质粒定向连接，切割目的基因两边的酶可以是不一样的。5．切点所处位置必须在载体本身需要的基因片段之外，以避免载体因目的基因的插入而失活。【典题精练7】作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是()A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便于提供大量的目的基因B．具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的表达C．具有某些标记基因，以便于为目的基因的表达提供条件D．能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选【解析】作为载体要携带目的基因进入受体细胞并使之表达，必须能够在宿主细胞内稳定地保存并大量复制，以便于通过复制提供大量的目的基因。同时要具有某些标记基因，以通过标记基因是否表达来判断目的基因是否进入受体细胞，从而筛选受体细胞。载体要具有多个限制酶切割位点，以便于与外源基因连接。【答案】A解题归纳细胞膜上的载体与基因工程中的载体的区别(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。【典题精练8】将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是()A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子【解析】本题考查基因工程的相关知识。大肠杆菌成功表达腺苷酸脱氨酶，说明每个大肠杆菌细胞至少含有一个重组质粒，且每个ada至少指导合成一个腺苷酸脱氨酶分子。重组质粒的形成需先用限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒形成相同的黏性末端，再在DNA连接酶的作用下将二者连接起来，形成重组质粒，其中含有限制性核酸内切酶的识别位点。不同的限制性核酸内切酶识别位点不同，不是每个限制性核酸内切酶的识别位点都需要插入ada，C错误。故选C。【答案】C一、选择题1．质粒常用作基因工程中的载体，下列关于质粒的描述不正确的是(A)A．质粒只存在于细菌等原核生物中B．质粒是很小的环状DNA分子C．质粒能够自我复制D．质粒上有一个或多个限制酶切割位点解析：质粒存在于细菌和酵母菌等生物中。2．下列关于载体的叙述，错误的是(D)A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子B．对某种限制酶而言，载体上最好只有一个切点，但还要有其他多种限制酶的切点C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒D．载体要具有某些标记基因，便于对其进行切割解析：载体上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。3．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。下列选项分别表示四种质粒，其中，箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为下图所示目的基因载体的质粒是(A)解析：由题图可知，质粒B上无标记基因，不适合作为载体；质粒C和质粒D的标记基因上都有限制酶的识别位点；只有质粒A上既有标记基因，且限制酶MunⅠ的切割位点不在标记基因上。4．下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的说法，错误的是(C)A．一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B．限制性核酸内切酶的活性受温度影响C．限制性核酸内切酶能识别和切割RNAD．限制性核酸内切酶可从原核生物中提取解析：限制性核酸内切酶的化学成分是蛋白质，它的活性受到温度和pH的影响；限制性核酸内切酶的特点是能识别双链DNA中特定的核苷酸序列，并在特定的位点进行切割，但不能识别和切割RNA；限制性核酸内切酶主要是从原核生物体内分离出来的。5．下列有关基因工程的工具的叙述，正确的是(B)A．基因工程的载体只有质粒B．限制酶和其他酶一样具有专一性，只能识别特定的核苷酸序列C．λ噬菌体的衍生物可以作为动物基因工程的载体D．天然质粒均可以直接用作载体将目的基因送入受体细胞解析：基因工程中最常用的载体是质粒，此外还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等；λ噬菌体的衍生物不可作为动物基因工程的载体；天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造。6．用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别作用于一个1000bp(1bp即1个碱基对)的DNA分子，同时对酶切产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，酶切产物分开，凝胶电泳结果如图所示。该DNA分子的酶切图谱(单位：bp)正确的是(C)解析：A选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切后会得到600bp和200bp两种长度的DNA分子，与题意不符，A错误；B选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切后会得到600bp和400bp两种长度的DNA分子，与题意不符，B错误；C选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切后得到的DNA分子长度是1000bp，用EcoRⅠ单独酶切后会得到200bp和800bp两种长度的DNA分子，用EcoRⅠ、KpnⅠ同时酶切后会得到200bp和400bp两种长度的DNA分子，与题意相符，C正确；D选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切后会得到400bp和600bp两种长度的DNA分子，与题意不符，D错误。7．利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性核酸内切酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点分别如图所示(已知这三种限制酶切割产生的黏性末端不同)。下列分析错误的是(D)A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA解析：构建重组DNA时，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A正确；分析甲图，HindⅢ的酶切位点在第二个EcoRⅠ的酶切位点的左侧，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B正确；P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为链状DNA分子，因每条链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C正确；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可任意连接，不止产生一种重组DNA，D错误。8．下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是(C)A．甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的B．甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能C．DNA连接酶的作用位点是b处D．切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段解析：据图可知，切割形成甲、乙、丙黏性末端的限制酶识别序列与切割位点分别是—GAATTC—(在G与A之间切割)、—CAATTG—(在C与A之间切割)、—CTTAAG—(在C与T之间切割)，即甲、乙、丙是由不同的限制酶切割产生的，A正确。甲、乙的黏性末端互补，所以甲、乙可以形成重组DNA分子；甲、丙的黏性末端不互补，所以甲、丙无法形成重组DNA分子，B正确。DNA连接酶可以恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，而b处是氢键，C错误。甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段为eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(—CAATTC—,—GTTAAG—))，其中没有切割产生甲的限制酶的识别序列及酶切位点，所以切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段，D正确。二、非选择题9．下图为体外对DNA分子进行切割和拼接的示意图，请据图回答以下问题：(1)EcoRⅠ是一种限制性核酸内切酶，其识别序列是GAATTC，切割位点是鸟嘌呤脱氧核苷酸(或G)与腺嘌呤脱氧核苷酸(或A)之间的磷酸二酯键，切割产生的DNA片段末端形式为黏性末端。(2)将不同来源的DNA片段“缝合”起来，需要E·coli_DNA连接酶或T4DNA连接酶，它们均属于DNA连接酶，作用是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键，将两个双链DNA片段“缝合”起来，其中能“缝合”两个双链DNA片段的平末端的酶是T4DNA连接酶。解析：图解表示EcoRⅠ将两个DNA分子在特定序列的特定位点切开并通过DNA连接酶进行拼接的过程。E·coliDNA连接酶只能“缝合”两个互补的黏性末端，而T4DNA连接酶既可以“缝合”两个互补的黏性末端，也可以“缝合”平末端。10．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，下图(1)、图(2)中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：(1)一个图(1)所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有0、2个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越高。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时，不能使用SmaⅠ切割，原因是Sma_Ⅰ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因。(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化。(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是鉴别和筛选含有目的基因的细胞。解析：(1)质粒为小型环状的DNA分子，环状DNA分子中没有游离的磷酸基团；经SmaⅠ切割后在切口处每端各含1个游离的磷酸基团。(2)因SmaⅠ的识别序列中全部是G—C碱基对，而G—C碱基对间氢键数目比A—T碱基对间多，故插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越强。(3)若用SmaⅠ切割质粒和外源DNA，则质粒中作为标记基因的抗性基因的结构被破坏，外源DNA中目的基因的结构也会被破坏。(4)若只使用EcoRⅠ切割目的基因和外源DNA，则除了含目的基因的片段和质粒连接外，质粒和含目的基因的片段可能会自身连接而环化。(5)含目的基因的片段与质粒连接形成重组质粒，需DNA连接酶将两个DNA片段的末端“缝合”起来。(6)重组质粒中的抗性基因是作为标记基因，以便于鉴别和筛选含有目的基因的细胞。[寻根问底]P4根据你所掌握的知识，你能推测这类酶存在于原核生物中的作用是什么吗？[提示]原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，限制酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。[寻根问底]P6DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？[提示]不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coliDNA连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4DNA连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都能形成磷酸二酯键(在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成)，那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？(1)DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。[旁栏思考题]P6想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？[提示]能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等。[模拟制作]思考与讨论P71．你模拟插入的DNA片段能称得上一个基因吗？[提示]不能。因为一般基因有上千个碱基对。2．如果你操作失误，碱基不能配对，可能是什么原因造成的？[提示]可能是剪切位点或连接位点选得不对(也可能是其他原因)。[思考与探究]P71．限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：(1)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…CTGCA,…G))(2)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…AC,…TG))(3)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(GC…,CG…))(4)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…G,…CTTAA))(5)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1