多西紫杉醇诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究

AbstractStudyontheeffectofdocetaxelontumorcellproliferationinhibitionandintumorchemotherapy,takethecellcount,morphologicobservation,flowcytometrymethodforthedetectionandobservationrespectivelyandcombinedwithdocetaxelonproliferationofhumantumorcelllinesinnudemicebearinghumantumorinhibition;toestablishanimalmodel,totreatseparatelyandcombinedwithdocetaxel,andblankcontrol.Observationofgrowthandpathologicalcharacteristicsofthetumorbody.ThroughtheexperimentsofMTTdetectiontestofdocetaxelontumorcellproliferationinhibition.Usingdifferentconcentrationsoftumorcellsuppressiontest,theinfluenceoftheconcentrationonthesurvivaloftumorcells.Theexperimentisdividedintotwoparts,respectively,andMTTdetectionofcellculture.Keywords:DocetaxelStemcellsResearchApplication前言紫杉类药物属于红豆杉的树皮或针叶中提取或半合成的新抗肿瘤药物，作用在微管以及微管蛋白系统，紫杉类药物与其他植物碱不同，紫杉类药物通过促进微管双聚体装配成微管通过防止去多聚化过程而使微管稳定，阻滞细胞于G和M期，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增殖。目前该类药物临床上有紫杉醇和多西紫杉醇docetaxe1等。采用多西紫杉醇治疗法具有来源广泛、容易获取、可迅速扩增、自体移植无免疫排斥等诸多优势，使其在细胞治疗及组织工程方面具有重要的研究价值及广阔的应用前景。第1章仪器与试剂1.1材料和试剂多西紫杉醇；A549细胞（肺肿瘤细胞）M-231（乳腺肿瘤细胞）hepg2（肝肿瘤细胞）PC3（前列腺肿瘤细胞）；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、PBS,购自于索莱宝；完全RPMI1640培养基、新生牛血清(NBS)，购自于南京凯基生物技术有限公司；TUNEL细胞原位凋亡测定试剂盒、活性氧试剂盒及细胞周期检测试剂盒（购自于南京凯基生物技术有限公司）、ELISA试剂盒、Westernblot检测试剂盒。其它试剂均为分析纯。1.2仪器二氧化碳孵箱（Thermo）；单人双面超净工作台（SW-CJ）；倒置式生物显微镜（XDS-1B）；酶标仪（Infinitef200）；流式细胞仪（FACSCalibur）；高速离心机（TGL-16G）；数控超声波清洗器（KQ-600DB）；旋转蒸发仪（RE-52A上海亚荣生化仪器厂）、恒温干燥箱（施都宝Bao-80A）、恒温水浴锅(HW.SY21-K)、超低温冰箱（thermo）。第2章实验方法2.1细胞培养A549细胞的培养A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1：2～1：3传代培养都是可行的。一、[所需溶液]细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)——无Ca、Mg名称用量NACL8.00gKCL0.20KH2PO40.20Na2HPO4.。12H2O1.15加水至1000mL,将PH调至7.4，高压灭菌。消化液胰酶-PBS名称用量结晶胰酶2.5g高压灭菌后的PBS1000ml用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。胰酶—EDTA:名称用量结晶胰酶0.5gEDTA盐溶液0.2g无Ca、MgPBS1000ml用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。细胞培养液：RPMI1640培养液配制方法：将一袋干粉型RPMI1640培养基溶于900ml三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。加入丙酮酸钠0.1g，NaHCO22g以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为100U/ML青霉素和100U/ML链霉素。(一般市售的青霉素为80万U/瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml；市售的链霉素为100万U/瓶，将其溶解于5ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml)。调整培养液的ＰＨ值，用ＰＨ精密试纸观察ＰＨ７.２～７.４即可。过滤法除菌，所使用的滤器为Ｏ２加压过滤，０.２２μｍ滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置—20℃保存。2.2细胞的维持和培养2.2.1细胞的复苏（1）准备37℃恒温水浴锅，从液氮罐中取出存有Ａ５４９细胞的冻存管，迅速放于37℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。（2）800r，10min离心。（3）在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。（4）用1ml枪头将上清液去除，加入1ml预热的细胞培养液将细胞吹散开，转移至25cm2培养瓶中。（5）补充4ml的RPMI1640培养基，并且添加10%的胎牛血清。(培养基中含有牛血清则不用添加）（6）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。（7）24h后，更换新的培养液。（8）常规传代培养。2.2.2A549细胞更换新的培养液（1）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。（2）用PBS反复冲洗细胞2～3遍。（3）加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。各种液体需要量（ml）表面积25cm275cm2150cm2洗涤3510胰酶1～21～32～5培养液51020倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。2.2.3A549细胞的传代无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。向已经长满的细胞中加入消化液1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面2～３遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。加入1ml消化液，在37℃培养箱中孵育5～８min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。加入5ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。吸取一半的细胞悬液，接种到新的25cm2培养瓶中，补足培养液，并且添加10%～20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为5～10ml。倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。2.3分组给药在37℃，恒湿的5%CO2细胞培养箱内培养A549细胞，完全培养基为高糖DMEM培养基中含10%新生小牛血清，加入100μg/ml链霉素和100μg/ml氨苄青霉素。细胞为上皮样贴壁生长，每2～3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。将细胞分为五组：空白对照组、模型组、多西紫杉醇高、中、低剂量组。加药前先将多西紫杉醇溶于DMSO中，再用完全培养基稀释，使药物终浓度为200mg/L、100mg/L、50mg/L，DMSO终体积为1‰，空白对照组及模型组加入含1‰DMSO完全培养基。药物预处理4h后，24h后检测各项指标。2.4MTT溶液的配置与检测MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。2.4.1配制称取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。2.4.2贴壁细胞

1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5、终止培养，小心吸去孔内培养液。

6、每孔加入150ul二甲基亚砜，低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）第3章实验计算以及结果3.1计算IC50(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率3.2实验结果PC3人前列腺细胞原料药脂质体N10微克/毫升10.10.01lipo0.01微克/毫升lipo0.1lipo1lipo100.720.2240.2670.3570.3740.3810.4330.3340.2310.5980.2510.2680.3520.3870.580.3380.2720.2230.5380.2310.2860.3270.3460.5210.3830.2740.2430.5470.3020.2670.3050.3810.410.4260.310.2710.5230.3160.2920.3040.3930.4090.40.3120.2020.5820.3140.3510.3110.3850.4750.330.3370.2320.58460.273028850.3260.377660.4626666670.3850.30650.233666667666766670.5330672750.5065564420.4424173320.3540478910.2086659060.3415051310.4757696690.600342075IC50=1.82微克/毫升IC50=3.2微克/毫升由于多西紫杉醇脂质体的载药量为10%，故脂质体的IC50折合成原料药的话，应在现有IC50的基础上*10%.原料药脂质体0.010.1110lipo10lipo1lipo0.1lipo0.010.9210.7940.6080.5980.6070.5880.6180.630.6020.7650.6440.6490.5660.5950.4720.5810.6450.5510.6480.6630.6360.6080.6030.5940.5780.6220.7540.6140.6770.6680.6520.6130.5420.5190.6410.6990.6890.6480.6660.6560.5860.5780.6520.6140.7290.7530.7180.6940.6710.5480.5770.6360.6510.7590.7316666670.6906666670.65350.6251666670.5920.55850.5973333330.6338333330.6823333330.0560364460.1068337130.1455580870.1908883830.236674260.1835990890.1337129840.067425968IC50=41.3微克/毫升IC50=3.7微克/毫升A549肺肿瘤细胞结语综合全文内容可总结出多西紫杉醇可能通过两种方式杀伤肿瘤细胞：（1）直接杀伤作用：多西紫杉醇通过靶细胞受体，或不同于TCR复合体的识别机构，识别靶细胞。并与其结合，多西紫杉醇与靶细胞的结合。启动细胞溶解反应，释放一些细胞毒颗粒或因子，从而溶解靶细胞；（2）间接杀伤作用：多西紫杉醇除自身直接溶解靶细胞外，还能分泌IL-2，肿瘤坏死因子(TNF)，r-干扰素(r-TFN)等多种细胞因子对肿瘤细胞产生间接杀伤作用，此类因子对肿瘤细胞均有直接的细胞毒活性或抑制作用。多西紫杉醇和LAK细胞一样具有广谱的非MHC限制的杀伤肿瘤细胞的作用，但两者的杀瘤谱有所不同