酶的分子修饰

什么是酶分子修饰？通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。第2页,共136页，2024年2月25日，星期天第一节酶的化学修饰广义：凡涉及共价部分或部分共价的形成或破坏的转变。狭义：较温和的条件下，以可控的方式是一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸或其功能基团发生共价的化学改变。第3页,共136页，2024年2月25日，星期天酶的化学修饰的功能1）催化机理的研究通过对特定基团侧链的化学修饰，可比较方便的获得有关必需基团的性质，配合以保护手段还可以了解活性部位的信息。2）有目的对目标基团进行基团改造或保护，可有目的的改变酶的活性。3）改变酶的生理生化性质，如稳定性、最适pH、抗原性、实现特定目的的研究或应用目的。第4页,共136页，2024年2月25日，星期天一、酶化学修饰方法及修饰剂修饰剂的要求反应条件的选择酶修饰方法酶学性质第5页,共136页，2024年2月25日，星期天1、影响酶化学修饰的主要因素（1）影响酶蛋白功能基团反应性的因素①微区的极性②蛋白质中酚基和羧基相互作用中，羧基pKa低于正常值，而酚基的pKa高于正常值。③静电效应④位阻效应第6页,共136页，2024年2月25日，星期天2、修饰剂的反应性选择吸附静电相互作用位阻因素催化因素第7页,共136页，2024年2月25日，星期天二、修饰反应专一性的控制（1）试剂的选择实验目的不同，对专一性的要求也不同。（2）反应条件的选择：不造成蛋白质的不可逆变性。有利于专一性修饰蛋白质第8页,共136页，2024年2月25日，星期天（3）反应的专一性①利用蛋白质分子中某些基团的特殊性②选择不同的反应pH③利用某些产物的不稳定性④亲和标记⑤差别标记⑥利用蛋白质状态的差异第9页,共136页，2024年2月25日，星期天三、修饰程度和修饰部位的测定（1）光谱法（2）化学修饰数据的分析①化学修饰的时间进程分析②确定必要基团的性质和数目第10页,共136页，2024年2月25日，星期天设计酶化学反应时应注意酶性质的了解酶活性部位情况

酶催化活性主要依赖于酶的活性中心。因此，对酶活性中心的组成，例如：酶蛋白中哪些氨基酸残基或其侧链基团参与了酶的活性中心．是否需要辅因子，为何种辅因子等情况，需要了解，此外，还需要了解酶的分子大小、形状、寡聚酶的亚基组成等。

第11页,共136页，2024年2月25日，星期天酶的稳定条件、酶反应最适条件

酶的稳定性被修饰酶对热、对酸碱的稳定性，作用温度及pH范围以及最适温度、最适pH的情况，酶蛋白解离时的电学性质，酶蛋白水解部位，抑制剂的性质等应有所了解。酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性

酶侧链基团的性质及反应性选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。第12页,共136页，2024年2月25日，星期天反应体系中酶与修饰剂的分子比例。反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件。反应温度及时间。不造成蛋白的不可逆变性有利于专一性修饰要求3．反应条件的选择第13页,共136页，2024年2月25日，星期天二、酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。第14页,共136页，2024年2月25日，星期天1、几种重要的修饰反应（1）酰化及其相关反应试剂特点：含有酰基结构，C上带有部分正电荷。这类试剂作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化，酰基接到亲核原子上。可作用基团包括：氨基，作用后形成酰胺；巯基：作用后形成巯酯；醇羟基（丝氨酸、苏氨酸）：作用后形成酯；酚羟基（酪氨酸）：作用后形成酚酯。第15页,共136页，2024年2月25日，星期天酰基化反应中的X既可以是卤素，也可以是某些吸电基团，如咪唑基。第16页,共136页，2024年2月25日，星期天（2）烷基化反应试剂特点：烷基上带有活泼卤素，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷。该类试剂作用于侧链基团的亲核基团，使之烷基化，烷基连接在亲核原子上。可作用基团包括：氨基（赖氨酸、精氨酸），巯基（半胱氨酸）、羧基（天冬氨酸、谷氨酸），甲硫基（甲硫氨酸），咪唑基（组氨酸）第17页,共136页，2024年2月25日，星期天第18页,共136页，2024年2月25日，星期天试剂特点：具有氧化性或还原性这类试剂作用于侧链基团，可被氧化的基团包括巯基，甲硫基，吲哚基（色氨酸）、咪唑基、二硫键等。而被还原的基团主要是二硫键。（3）氧化和还原反应第19页,共136页，2024年2月25日，星期天连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，可用于保护巯基。第20页,共136页，2024年2月25日，星期天（4）芳香环取代反应试剂：卤（碘）化、硝化试剂。该类试剂作用于酪氨酸的OH邻位。第21页,共136页，2024年2月25日，星期天2、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰通过选择性的试剂或者亲核试剂与酶上特定的侧链基团进行化学修饰是酶分子化学研究的重要方法，也是改造酶的性质和功能的重要手段。20种氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链容易被修饰，它们一般具有亲核性。从酶动力学的角度，酶必需基团的化学修饰的过程是不可逆抑制（激活）过程。第22页,共136页，2024年2月25日，星期天（1）巯基的化学修饰

巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能。巯基修饰可以分为以下几种：二硫键交换、重金属化合物作用、烷基化、酰基化。第23页,共136页，2024年2月25日，星期天二硫键交换E-SH+R-S-S-R----E-S-S-R+R-SHE-SH+E-S-S-R----E-S-S-E+R-SH与-SH进行二硫键交换后，-SH被修饰，试剂的另一半以单体放出。

二硫键交换产生的单体在一定波长下有很大的光吸收，可用分光光度计进行连续监测。第24页,共136页，2024年2月25日，星期天二硫键交换常用试剂DTNB5,5-二硫-2-硝基苯甲酸N-乙基马来酰肼第25页,共136页，2024年2月25日，星期天（2）氨基的化学修饰氨基具有很高的亲核性，可用多种酰基化或者烷基化试剂进行修饰。①烷基化第26页,共136页，2024年2月25日，星期天②酰基化乙酸酐丹磺酰氯（DNS）第27页,共136页，2024年2月25日，星期天③还原烷基化一个常用的特异性修饰赖氨酸氨基的试剂磷酸吡哆醛第28页,共136页，2024年2月25日，星期天（3）羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性差，一般选用合适的R和R’的水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸，属烷基化反应。①水溶性碳化二亚胺第29页,共136页，2024年2月25日，星期天②酯化氟硼化三甲基金羊盐（CH3)3OBF4第30页,共136页，2024年2月25日，星期天（4）咪唑基的化学修饰通过对咪唑基上氮原子酰基化或烷基化修饰组氨酸咪唑基。焦炭酸二乙酯（DPC）是最常用的试剂。第31页,共136页，2024年2月25日，星期天碘代乙酸也可以对咪唑基上的碳进行亲核取代第32页,共136页，2024年2月25日，星期天（5）胍基的化学修饰①二酮②环乙二酮③苯酰甲醛该反应本质上是羰基对氨基酰基化。该反应一般可逆，需加硼酸盐使产物与之反应而稳定下来。但苯酰甲醛时反应不可逆，不需加硼酸盐。第33页,共136页，2024年2月25日，星期天第34页,共136页，2024年2月25日，星期天（6）二硫键的化学修饰①氧化：过甲酸②还原：巯基乙醇第35页,共136页，2024年2月25日，星期天③DTT二硫苏糖醇DTT是目前最常用的二硫键修饰剂和巯基保护剂。第36页,共136页，2024年2月25日，星期天三、酶的亲和修饰亲和标记是最有意义的一种化学修饰，这是因为它可以是很专一性的作用于酶的活性部位。亲和标记是分步反应，修饰剂先可逆的结合在酶的活性部位，再不可逆的修饰该部位特定基团，一般是必需基团，而造成不可逆失活，亲和标记修饰剂一般是底物类似物，和底物含有共同的结合于酶的基团，亲和标记的作用符合饱和动力学特征，可以把亲和标记过程看作是一次自杀性酶反应。第37页,共136页，2024年2月25日，星期天亲和试剂一般是具有化学反应性的蛋白质分子的底物或配体的类似物。亲和标记试剂在酶上有特定的结合部位，其解离常数也易于测定，可以提供酶的结构信息，是理论研究中一类常用的修饰剂。亲和标记试剂一般在较低浓度下有效修饰酶，改变酶的活性，特别是专一性较强，是药物等的优良候选者，有广泛的应用价值。第38页,共136页，2024年2月25日，星期天1、光亲和标记特点：具有光反应基团。这种试剂先与酶活性部位在暗条件下发生特异性结合，然后被光照激活后，产生一个非常活泼的功能基团，其能与他们附近的几乎所有基团反应，形成一个共价的标记物。第39页,共136页，2024年2月25日，星期天2、专一性的不可逆抑制剂

亲和试剂可以专一性地标记于酶的活性部位，使酶不可逆失活，因此，称为专一性的不可逆抑制。第40页,共136页，2024年2月25日，星期天（1）Ks型抑制剂：根据底物的结构设计，具有和底物的结构相似的结合基团，同时也可以和酶的活性部位发生特异性结合，并且能够对活性部位侧链基团进行修饰，导致酶不可逆失活。（2）Kcat型抑制剂：根据酶催化过程设计，它具有酶的底物性质，还有一个潜在的反应基团在酶的催化活化后不可逆抑制酶的活性部位，因此也称为“自杀性抑制剂”。第41页,共136页，2024年2月25日，星期天四、有机大分子对酶的化学修饰利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结合法。第42页,共136页，2024年2月25日，星期天1、聚乙二醇聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。第43页,共136页，2024年2月25日，星期天天然SOD：半衰期6min右旋糖酐修饰后：半衰期7hPEG修饰：半衰期35h第44页,共136页，2024年2月25日，星期天过程：活化：修饰剂中含有的基团需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶第45页,共136页，2024年2月25日，星期天（1）三氯均嗪法三氯均嗪环上的氯原子很活泼，容易产生亲核取代反应。当环上的一个氯原子被取代后，能够稳定其他的碳-氯键（第一个氯原子在4℃就能反应，第二个氯原子在25℃反应，第三个氯原子在80℃反应）。第46页,共136页，2024年2月25日，星期天（2）叠氮法将PEG链端羟基转化成叠氮基，然后与酶反应。PEG甲氧甲酰甲酯制备：PEG与氯醋酸酐及重氮甲烷发生反应生成PEG甲氧甲酰甲酯。PEG酰肼的制备：反应产物与肼反应生成相应的酰肼化合物。PEG羧甲基叠氮化物制备：PEG酰肼化合物经亚硝酸作用生成活化PEG。第47页,共136页，2024年2月25日，星期天（3）琥珀酸酐法二溴琥珀酸作为PEG的活化剂。PEG活化反应修饰反应第48页,共136页，2024年2月25日，星期天（4）重氮法将修饰剂上有关基团转变为重氮基团，然后在弱碱条件下与酶分子上的酚基、咪唑基等反应，生成修饰酶。PEG活化反应修饰反应第49页,共136页，2024年2月25日，星期天2、右旋糖酐及右旋糖酐酯右旋糖酐属于菌多糖，是由α-葡萄糖通过α-1,6糖苷键形成的高分子糖，具有较好的水溶性和生物相容性，可用作代血浆。（1）溴化氢法（2）高碘酸氧化法第50页,共136页，2024年2月25日，星期天3、糖肽糖肽一般是通过纤维蛋白酶或蛋白水解酶降解人纤维蛋白或γ-球蛋白而得。糖肽结构上有氨基，经活化后能与酶分子上氨基反应而产生共价结合。（1）异氰酸法（2）戊二醛法第51页,共136页，2024年2月25日，星期天4、具有生物活性的大分子物质肝素是一种含硫酸酯的黏多糖，由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量2000左右。肝素共价交联酶后可增加酶的稳定性，同时由于肝素在生物体内还具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性。羧二亚胺法溴化氢法三均嗪法第52页,共136页，2024年2月25日，星期天5、蛋白质类及其他血浆蛋白是血浆中的天然成分，它们和其他蛋白（包括酶类）的复合物在血液中可能被视为“自体蛋白”而被接受。第53页,共136页，2024年2月25日，星期天6、酶的化学交联交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。同型双功能试剂异性双功能试剂可被光活化试剂第54页,共136页，2024年2月25日，星期天五、修饰酶的性质及特点1、热稳定性热稳定性增加修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强了酶的热稳定性。增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活。

但PEG修饰后热稳定性没有明显提高，原因：PEG与酶是单点交联，相对难以产生固定的酶分子结构。

第55页,共136页，2024年2月25日，星期天

2、抗原性部分可消除。比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。3、最适pH值部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。第56页,共136页，2024年2月25日，星期天4、酶学性质的变化绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没有改变，但有些酶在修饰后，米氏常数会增大。5、对组织的分布能力变化对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收。第57页,共136页，2024年2月25日，星期天第二节酶的分子定向进化

蛋白质工程：利用基因工程手段对酶的蛋白质分子改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。酶分子的合理设计(rationaldesign)：利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或其突变体进行研究，从而获得酶分子特征、空间结构、结构和功能之间关系以及氨基酸残基功能等方面的信息，以此为依据对酶分子进行改造。如：化学突变、定点突变等酶分子的非合理设计：不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因重组、定向筛选等方法进行改造。如:定向进化、杂合进化。第58页,共136页，2024年2月25日，星期天定向进化示意图随机突变+定向选择＝目标突变体细菌诱发突变的因素50

0C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C最适生长温度提高了！第59页,共136页，2024年2月25日，星期天自然进化是在整个有机体繁殖和存活的过程中自发出现的一个非常缓慢的过程。自然选择使进化向有利于生物适应生存环境的方向发展。环境的多样性和适应方式的多样性决定了进化方向的多样性。我们可以在实验室中模仿自然进化的关键步骤—突变、重组和筛选,在较短时间内完成漫长的自然进化过程,有效地改造蛋白质,使之适于人类的需要。第60页,共136页，2024年2月25日，星期天第61页,共136页，2024年2月25日，星期天酶具有进化潜力的原因：生物体环境与实际运用环境不同希望具有更高的活性和稳定性非生物体内涉及的蛋白性质第62页,共136页，2024年2月25日，星期天PCR的基本原理DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第63页,共136页，2024年2月25日，星期天PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃第64页,共136页，2024年2月25日，星期天PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物第65页,共136页，2024年2月25日，星期天PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第66页,共136页，2024年2月25日，星期天PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始第67页,共136页，2024年2月25日，星期天PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第68页,共136页，2024年2月25日，星期天PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束第69页,共136页，2024年2月25日，星期天PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

第70页,共136页，2024年2月25日，星期天二、定向进化的策略1、以易错PCR技术为代表的无性进化易错PCR(errorpronePCR)是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配,导致目的基因随机突变。然而,经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。遗传变化只发生在单一分子内部，故属于无性进化。第71页,共136页，2024年2月25日，星期天化学诱变剂介导的随机诱变体外随机诱变也可在65℃下直接用羟胺处理带有目的基因片段的质粒，然后用限制性内切酶切下突变了的基因片段，再克隆到表达载体中进行功能的筛选。第72页,共136页，2024年2月25日，星期天由致突变菌株产生随机突变美国Strategen公司构建了一株DNA修复途径缺陷的大肠杆菌突变株XL1RED,它体内的DNA突变率比野生型高五千倍。将带有要突变基因的质粒转化到XL1RED菌株内复制过夜,在此过程中会产生随机突变。每两千个碱基中通常约有一个碱基置换。将带有突变过的基因的质粒转化到表达系统中进行筛选。第73页,共136页，2024年2月25日，星期天2、以DNA改组技术为代表的有性进化（1）DNA改组1994年,Stemmer等首先使用DNA改组完成体外重组。DNA改组是将一群密切相关的序列(如多种同源而有差异的基因或一组突变基因文库)在DNaseI的作用下随机酶切成小片段,这些小片段之间有部分的碱基序列重叠,它们通过自身引导PCR延伸,并重新组装成全长的基因,这一过程被称为再组装PCR。该过程所产生的相关序列间的交换归因于模板的转换。DNA改组过程中也可能引入新的点突变。因此,仅DNA改组就可以有效地从单一基因序列开始进行蛋白质的定向进化。第74页,共136页，2024年2月25日，星期天DNAshuffling第75页,共136页，2024年2月25日，星期天体外定向进化第76页,共136页，2024年2月25日，星期天ＤＮＡ改组具有以下有用的特征:它可以利用现存的有利突变,快速积累不同的有利突变。重组可伴随点突变同时发生。可以删除个体中的有害突变和中性突变。第77页,共136页，2024年2月25日，星期天（2）体外随机引导重组1998年,Arnold提出了一种有效的新方法—随机引导重组(RPR)。

RPR的原理是:用随机序列的引物来产生互补于模板序列不同部分的大量的DNA小片段。由于碱基的错误掺入和错误引导,这些DNA的小片段中也因之而含有少量的点突变。DNA小片段之间可以相互同源引导和重组。在DNA聚合酶作用下,经反复的热循环可重新组装成全长的基因,克隆到表达载体上,随后筛选。

第78页,共136页，2024年2月25日，星期天第79页,共136页，2024年2月25日，星期天与DNA改组相比，RPR技术具有以下优点:RPR可直接利用单链DNA或ｍＲNA作模板，所需亲代DNA比DNA改组所需的量少10—20倍。DNA改组利用DNaseI随机切割双链DNA模板,在DNA片段重新组装成全长序列之前,DNaseI必须去除干净。一般说来,RPR技术使基因的重新组装更容易。合成的随机引物长度一致并缺乏序列的偏向性,保证了点突变和交换在全长的后代基因中的随机性。随机引导的DNA合成不受DNA模板长度的影响,这给小肽的改造提供了机会。第80页,共136页，2024年2月25日，星期天（3）交错延伸技术1998年，Arnold等人又建立了一种新的体外重组方法—交错延伸技术:用PCR同时扩增多个拟重组的模板序列时,在热循环中大大缩短退火与聚合酶催化延伸的时间。在每一循环中,不断延长的片段根据序列的互补性与不同模板退火,并进一步延伸。反复重复直到全长序列形成。由于模板的转换,大多数多核苷酸含有不同亲本的序列信息。该技术已成功地重组了由易错PCR产生的5个热稳定的枯草杆菌蛋白酶Ｅ的突变体,得到了热稳定性进一步提高的重组酶。第81页,共136页，2024年2月25日，星期天第82页,共136页，2024年2月25日，星期天（4）SCRATCH技术SCRATCH技术是将DNA改组技术与增加片段化杂合酶法（ITCHY）相结合的技术。Stefan等用E.coli的甘氨酰胺核苷酸甲醛转移酶基因和人甘氨酰胺核苷酸甲醛转移酶基因分别构建pDIMGPX质粒，接着采用能增加断点的核苷酸类似物的方法进行PCR扩增，构建其文库，然后转化到E.coliDH5α进行PCR扩增和改组，再转化到营养缺陷型E.coliTX680F’进行活性杂合子筛选，并对其DNA序列进行分析，主要特点：不依赖基因序列的同源性而产生多个DNA杂交位点。第83页,共136页，2024年2月25日，星期天（5）临时模板随机嵌合生长RACHITT技术是与DNAshuffling概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术.它不包括热循环、链转移或交错延伸反应,而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时DNA模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接.其中的悬垂切割步骤使短片段(比DNase消化片段还短)得以重组,明显提高了重组频率；如果在片段重组前后采用错误倾向PCR还可引入额外点突变。第84页,共136页，2024年2月25日，星期天第85页,共136页，2024年2月25日，星期天CoCo等首次报道此法改造二苯并噻吩单加氧酶,产生的嵌合文库平均每个基因含14个交叉,重组水平比DNAshuffling类方法(1～4个交叉)高出几倍；并且可在短至5bp的序列同一区内产生交叉。这种高频率、高密度的交叉水平是DNAshuffling所难以达到的。第86页,共136页，2024年2月25日，星期天（6）酵母增强组合文库CLERY是一个真核基因家族shuffling策略.其原理是将体外DNAshuffling程序与接下来的酵母体内重组缔合起来,构建高丰度低亲本水平的重组文库:直接以含目的基因的质粒作为体外shuffling的模板;shuffling后基因产物与线性化的酵母表达载体共转化酵母细胞启动体内重组事件，同时表达功能性重组子直接用于筛选。第87页,共136页，2024年2月25日，星期天3、通过基因嵌合获得改性的杂合酶杂合酶是把来自不同酶分子中的结构单元（二级结构、三级结构、功能域）或整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化酶杂合体。第88页,共136页，2024年2月25日，星期天4、核苷酸类似物在分子定向进化中的应用许多核苷酸类似物可与天然DNA/RNA中的相应碱基配对，并且由于这种特有的性质被称为通用碱基。第89页,共136页，2024年2月25日，星期天渐增切割法产生杂和酶Benkovic研究组建立了渐增切割法产生杂和酶(incrementaltruncationforthecreationofhybridenzymes)及ThioITCHY(α-硫代磷酸核苷酸介导的ITCHY)方法来产生不依赖于ＤＮＡ序列同源性的重组文库。

ITCHY的基本原理是：控制核酸外切酶Ⅲ的切割速度不大于10碱基/min，然后间隔很短时间连续取样终止反应,以获得一组依次有一个碱基缺失的片段库；然后将基因Ａ的一组随机长度的5′端片段与基因Ｂ的一组随机长度的3′端片段随机融合产生杂合基因文库。第90页,共136页，2024年2月25日，星期天第91页,共136页，2024年2月25日，星期天但由于该方案冗长繁琐，Lutz等又提出了ThioITCHY方法：首先将待重组的两基因串联在同一载体上,然后通过PCR反应或单链模板引伸反应将α-硫代磷酸核苷酸随机引入产物中,由于其抗核酸外切酶Ⅲ的切割,接下来的切割反应会在此处随机终止,连接切割产物即产生随机交叉文库.该法操作便利,同时也可引入随机点突变。此外，ITCHY/ThioITCHY不依赖ＤＮＡ序列同源性,可在非序列同一区内产生活性融合子，迭代ITCHY或对其文库进行shuffling还可以创造多个交叉。第92页,共136页，2024年2月25日，星期天三、基因文库的构建与筛选1、构建理想的基因文库要考虑的因素（1）基因文库的质量具体反映在文库的代表性和突变基因片段的序列的完整性。①文库的代表性：指文库中包含的DNA分子是否能完整地反映出源基因的全部可能的变化和改变，它是体现文库质量的最重要指标。②突变基因片段的序列完整性（2）文库筛选可选择的方法第93页,共136页，2024年2月25日，星期天2、突变体基因的构建策略（1）DNA随机酶切片段拼接（2）单链DNA随机拼接（3）限制性酶切片段随机拼接第94页,共136页，2024年2月25日，星期天(1)DNA随机酶切片段连接将两个高度同源的基因经DNAaseI酶随机剪切得到大量的酶切片段，接着采取“无引物”PCR扩增法将同源片段随机重组，然后通过特异性引物PCR扩增全长基因。重组---扩增---筛选第95页,共136页，2024年2月25日，星期天（2）单链DNA随机拼接单链DNA为模板链，以此制备片断化得DNA片段，然后进行同源片段随机拼接重组。第96页,共136页，2024年2月25日，星期天（3）限制性酶切片段随机拼接采用特定的限制性酶切片段对DNA进行切割，产生的都是特异的限制性酶切片段，不存在亲代基因自身同源酶切片段随机拼接现象。第97页,共136页，2024年2月25日，星期天3、构建突变基因文库的载体系统λ噬菌体载体系统：片段装载量大，适合长期保存，筛选方法有限。质粒载体系统：适合大部分基因突变，可进行功能性筛选，但容量小，转化效率偏低。第98页,共136页，2024年2月25日，星期天4、文库的筛选

建立有效的搜索蛋白质文库的方法是影响定向进化成功与否的关键。突变体基因文库中包含性能改进的酶基因，必须构建大容量，多样化的至少106以上库容量的突变文库。当突变体酶可赋予宿主细胞生长或存活的优势时,很容易搜寻含有106以上个蛋白质突变体的文库。然而,这类情况并不多见。当感兴趣的功能可产生可见的信号时,简单的肉眼可见的筛选方法被广泛地应用。例如,菌落分泌出有活性的蛋白酶可在含有酪蛋白的琼脂平板上产生清晰的水解圈,其大小与水解活性成正比。第99页,共136页，2024年2月25日，星期天另外,易被观察的菌落表型也可用于快速筛选。尽管根据颜色或水解圈形成的筛选方法快速高效,但也有明显的局限性。它是非定量的,而且经常对性状的微小变化不灵敏。高通量96孔板适合自动定量筛选,能鉴定出酶对底物的特异性、热稳定性、对映体选择性及其他特定性状等。第100页,共136页，2024年2月25日，星期天第101页,共136页，2024年2月25日，星期天（1）筛选与优选策略

screeningSelection：典型的策略是构建代谢缺失型的宿主菌株第102页,共136页，2024年2月25日，星期天（2）基于表型观察的筛选

目前，阳性克隆的筛选一般都依赖于克隆的表型（营养缺陷型或抗生素抗性）筛选，这是一种定性的筛选方法，而DNA随机拼接需要在突变体基因文库中筛选出性状更优的突变酶，因此很多情况下实际上是一种定量的筛选过程，需要将基因表达产物的活性和转化子的表型定量联系起来。第103页,共136页，2024年2月25日，星期天（3）基于基因编码蛋白质的检测筛选

①噬菌体表面展示技术②酵母双杂交系统③酵母单杂交系统第104页,共136页，2024年2月25日，星期天①噬菌体表面展示技术

噬菌体表面展示技术：是将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合,并在其表面展示,同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中。这个技术的最大优点是直接将可现的表达型与其基因型联系在一起,再利用其配体的特异性亲和力,将所感兴趣的蛋白质或多肽挑选出来。第105页,共136页，2024年2月25日，星期天第106页,共136页，2024年2月25日，星期天第107页,共136页，2024年2月25日，星期天优点特异、有效地从庞大的重组噬菌体群体中富集到极稀少的表面展示蛋白与配基结合的重组噬菌体克隆。筛选时，获得编码这一表型的目的基因。可塑性。第108页,共136页，2024年2月25日，星期天②酵母双杂交系统

将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。第109页,共136页，2024年2月25日，星期天酵母双杂交模型DNA-BindingDomainBaitProteinPreyProteinTranscriptionActivatingRegionReporterGeneDNA-BindingSite第110页,共136页，2024年2月25日，星期天第111页,共136页，2024年2月25日，星期天模型第112页,共136页，2024年2月25日，星期天文库筛选的步骤将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母再将文库质粒转化到酵母中通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白第113页,共136页，2024年2月25日，星期天第114页,共136页，2024年2月25日，星期天第115页,共136页，2024年2月25日，星期天第116页,共136页，2024年2月25日，星期天第117页,共136页，2024年2月25日，星期天第118页,共136页，2024年2月25日，星期天第119页,共136页，2024年2月25日，星期天③酵母单杂交系统真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。第120页,共136页，2024年2月25日，星期天第121页,共136页，2024年2月25日，星期天酵母单杂交的基本操作过程

(1)设计含目的基因(称为诱饵)和下游报告基因的质粒，并将其转入酵母细胞。

(2)将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化人同一酵母中。(3)若文库蛋白与目的基因相互作用，可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来。在这里作为诱饵的目的基因就是启动子DNA片段，文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白。第122页,共136页，2024年2月25日，星期天第123页,共136页，2024年2月25日，星期天（4）高通量筛选技术

核糖体展示技术与mRNA筛选技术同属于体外筛选技术。第124页,共136页，2024年2月25日，星期天包括:模板的构建、体外转录和翻译亲和筛选第125页,共136页，2024年2月25日，星期天第126页,共136页，2024年2月25日