谷实夜蛾唾液ATP水解酶介导番茄防御机制的研究

谷实夜蛾唾液ATP水解酶介导番茄防御机制的研究谷实夜蛾Helicoverpazea,属鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,是美洲地区重要的作物害虫。在美国、加拿大、墨西哥等国均有分布。主要危害玉米、水稻、小麦、棉花、大豆等经济作物,其寄主范围广,每年均可造成严重的经济损失。番茄,属茄科一年生草本植物。目前,全球的番茄年产量可达一亿五千万吨以上。然而,每年因为番茄病虫危害造成的产量损失就高达34.4%。在美国,危害番茄的主要昆虫种类就包括谷实夜蛾、茶翅蝽Halyomorphapicus、番茄天蛾Manducaquinquemaculata等。目前,国内外对谷实夜蛾的研究主要集中于形态学、生物学、生态学和化学防治等方面,少有研究从根本上明确谷实夜蛾与宿主植物之间的互作关系。昆虫唾液和口腔分泌物等效应子作为重要的入侵信号,可以被植物识别和利用,并介导植物产生相应的防御反应。为了更好地利用植物自身的防御机制和抗虫性,建立环境友好的有害昆虫控制策略。本学位论文在美国农业部农业与食品研究计划(2010-65105-20639)的资助下,综合运用分子克隆、原核表达、蛋白质纯化等技术,以谷实夜蛾及其危害较为严重的宿主植物番茄为研究对象,探讨了谷实夜蛾唾液ATP水解酶介导番茄植株防御反应的作用机理。以期从理论上深化对植物防御反应信号传导途径、昆虫源效应子的理解和认识,解析昆虫源效应子介导植物防御反应的分子生物学机理,充实昆虫与宿主植物互作关系的研究内容。通过研究,取得以下研究结果：1谷实夜蛾唾液和其余组织内ATP水解酶的活性鉴定采用玻璃毛细管于每10头谷实夜蛾收集到的唾液总蛋白浓度为0.2±0.0μg·μl-1,其ATP水解比活力为93.9±3.4nmol·min-1·mg-1。荧光反应显示,5μ1该浓度谷实夜蛾唾液5min内对番茄叶片胞外ATP的降解量为0.4±0.0nmol·L-1.运用native技术,对谷实夜蛾各组织内具有ATP水解活性的蛋白质分布情况进行了检测。结果显示,ATP水解酶普遍存在于谷实夜蛾体内的各个组织器官中,但其分布在唾液腺的量较其余组织高。2谷实夜蛾体内3个ATP水解酶基因克隆及表达2.1谷实夜蛾体内3个ATP水解酶基因克隆应用RT-PCR和RACE技术,从谷实夜蛾唾液腺成功克隆得到3个ATP水解酶基因apyrase、ATPsynthase及ATPase13A1的cDNA全长序列,其cDNA全长分别为2,102、1,789和4,171bp,包含1,,641、1,,551和3,483bp的开放阅读框,编码546、516和1160个氨基酸。成熟蛋白的理论分子量分别为61.2、55.2和130.2kDa。GenBank登录号分别为：HM569605、HM156739和HQ184468。此外,基于N端信号肽在蛋白质跨膜运输过程中的重要作用,对目的蛋白氨基酸序列进行了分析,以期从理论上推测谷实夜蛾apyrase、ATPsynthase和ATPase13A1从唾液腺分泌至唾液中的可能性。序列分析结果表明,仅apyrase含有信号肽。非经典分泌蛋白预测软件检测结果亦表明,谷实夜蛾apyrase属于分泌蛋白,且ATPase13A1的NN-score为0.767。然而,ATPsynthase的NN-score为0.492,临近非经典分泌蛋白检测阈值(NN-score、0.5的蛋白质为非经典分泌蛋白)。该结果从理论上推测了谷实夜蛾apyrase、ATPsynthase和ATPase13A1从唾液腺分泌至唾液中的可能性。2.2谷实夜蛾体内3个ATP水解酶基因的表达水平采用qRT、PCR技术,检测到ATPsynthase和ATPase13A1基因在谷实夜蛾唾液腺内的表达量最高,且与其余组织内表达量的差异达到显著水平(P<0.05)。Apyrase基因在马氏管内的表达量最高,是唾液腺内表达量的1.5倍。说明ATPsynthase和ATPase13A1主要的作用位点在谷实夜蛾唾液腺,apyrase则主要作用于谷实夜蛾体内的排泄和渗透调节系统。在已知谷实夜蛾唾液蛋白的合成和分泌会随着取食饲料和宿主植物的不同而发生变化的基础上,对取食不同饲料和植物后,谷实夜蛾唾液腺内ATPase13A1基因的相对表达量进行了检测。结果显示,诱导防御反应后的番茄叶片会抑制谷实夜蛾幼虫唾液腺ATPase13A1基因的表达,而番茄抗虫基因缺失型突变种defl和添加3μg·g-1茉莉酸的饲料不会抑制该基因的表达。说明经过茉莉酮酸甲酯诱导防御反应后的植株叶片内必定含有某种或者某些除茉莉酸以外的其余组分抑制了ATPase13A1基因的表达,且该组分肯定与茉莉酸信号传导途径有关。3谷实夜蛾体内3个ATP水解酶基因原核表达及鉴定应用双酶切和DNA重组技术,成功构建了谷实夜蛾apyrase、ATPsynthase和ATPase13A1与pET-43.1b(+)的原核表达载体。经IPTG诱导和SDS鉴定,证实该表达系统的可操作性,实现了目的基因的体外表达。此外,研究结果还表明,apyrase和ATPsynthase融合蛋白的表达量会随诱导时间的延长而增加,过夜培养后,表达量也仍然呈现上升趋势。然而,经过诱导表达5h后,ATPase13A1融合蛋白的表达量会逐步下降,说明一定浓度的ATPase13A1融合蛋白会抑制宿主菌的生长。因此,在表达ATPase13A1时,不宜长时间诱导。4重组蛋白的分离纯化及活性鉴定采用亲和纯化技术,对表达出的apyrase、ATPsynthase和ATPase13A1融合蛋白进行了分离纯化,得到分子量分别为60.0、54.5和51.7kDa的目的蛋白。运用apyrase肽抗体(DGGDGFSMFRDGKQ)和Westernblot技术,于谷实夜蛾唾液、唾液腺,以及纯化产物中,检测到目的蛋白apyrase的存在。Native检测结果显示,经过两次纯化后,各目的蛋白仍然具有活性。荧光反应试验证实,最后得到apyrase、ATPsynthase和ATPase13A1的比活力分别为196.5、219.8和83.7nmol·min-1·mg-1,酶活回收率分别为111.9、231.5和70.4%。5谷实夜蛾ATP水解酶对番茄防御反应相关基因的影响应用纯化后具有相等ATP水解活性的apyrase、ATPsynthase和ATPase13A1处理番茄植株(24h),以检测涉及不同防御反应信号途径的7个基因(PIN2、ARG、PPO、TD、PAL、PR-10和OSM)在各处理组植株体内的相对表达量。结果显示,创伤处理显著诱导了每个基因的表达量(P<0.05)。然而,创伤面再经过目的蛋白处理后,植株体内PIN2、ARG、PPO和TD基因的表达均被显著抑制(P<0.05)。说明谷实夜蛾ATP水解酶显著抑制了番茄植株体内的茉莉酸信号传导途径(P<0.05),并且,较高比活力ATP水解酶的抑制作用更为明显。此外,经过较高蛋白质浓度、低比活力的单个酶处理,茉莉酸信号传导途径介导的下游防御反应相关基因的相对表达量越来越接近创伤处理组。说明蛋白质比活力的下降削弱了谷实夜蛾ATP水解酶对番茄植株茉莉酸信号传导途径的抑制作用。其次,3个谷实夜蛾ATP水解酶对水杨酸信号传导途径相关的两个基因(PAL和PR-10)的影响却截然相反。PAL基因的表达水平被较低比活力的apyrase和ATPase13A1,以及较高比活力的ATPsynthase抑制：PR-10基因对不同浓度和比活力的3个谷实夜蛾ATP水解酶的反应则完全不同。据此推测,谷实夜蛾ATPsynthase和其余两种酶对各基因表达水平存在不同影响的原因可能在于,ATPsynthase本身兼具ATP水解酶和合成酶活性。由于本试验采用的活性检测方法本身存在局限性,不能明确在反应过程中是否有ATP被合成。因此,今后可以对谷实夜蛾ATPsynthase的合成酶活性进行必要的鉴定。从各处理组PR-10基因的相对表达量可以看出,较高比活力的ATPsynthase和最低比活力的ATPase13A1对番茄植株水杨酸信号传导途径产生了显著的诱导作用(P<0.05)。此外,较高比活力的3个谷实夜蛾ATP水解酶均对OSM基因表现为抑制作用。说明该3个ATP水解酶会对番茄植株乙烯信号传导途径产生抑制作用。6谷实夜蛾ATP水解酶对番茄腺毛产量的影响植物腺毛产量可因植食性昆虫的取食或机械伤害的刺激而增加,属于被诱导的延迟性植物防御反应。采用最高蛋白质浓度的3个谷实夜蛾ATP水解酶分别处理番茄植株,以检测处理10d后番茄植株叶片腺毛产量是否发生变化。结果显示,创伤处理能够显著诱导番茄新生叶片的腺毛数量(P<0.05)。然而,创伤面再经过各种谷实夜蛾ATP水解酶处理后,番茄新生叶片腺毛数量与未处理组(空白对照组)植株腺毛数量之间没有显著性差异(P>0.05)。说明谷实夜蛾ATP水解酶处理抑制了创伤对番茄植株新生叶片的影响。综合对植物防御反应相关基因的qRT-PCR检测结果,可以看出植物信号传导途径,尤其是茉莉酸信号传导途径在调控番茄植株腺毛生长过程中所起的重要作用。7Apyrase在谷实夜蛾躲避宿主防御反应过程中的作用谷实夜蛾唾液腺apyrase与蚊类唾液腺apyrase同属5’-核苷酸酶家族,两者存在较高的相似度。鉴于嗜血性昆虫唾液