新教材同步备课2024春高中生物第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序课件新人教版选择性必修3

第2节基因工程的基本操作程序目标素养1.结合生产实例,运用归纳与概括、模型与建模等方法,举例说出基因工程操作的四个步骤。2.通过对基因工程案例的分析,概述基因工程基本操作程序的常用方法和基本原理,培养科学思维和科学探究能力。3.说明利用PCR技术扩增目的基因的基本过程。尝试用PCR技术扩增目的基因,并通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物,培养动手能力。知识概览一、目的基因的筛选与获取1.目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞

性状

或获得

预期表达产物

等的基因,主要是指

编码蛋白质

的基因。

2.筛选合适的目的基因:从相关的已知

结构

和

功能

清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。

3.利用PCR获取和扩增目的基因。(1)原理:根据

DNA半保留复制

的原理,在体外提供参与DNA复制的

各种组分与反应条件

,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。

(2)组分和条件:缓冲液、

DNA模板

、2种

引物

、4种

脱氧核苷酸

、耐高温的

DNA聚合

酶,同时控制温度。(3)过程。4.在获得转基因产品的过程中,还可以通过构建基因

文库

来获取目的基因。

微点拨

用PCR技术扩增DNA不需要解旋酶;PCR技术需要的DNA聚合酶能耐高温,具有热稳定性。二、基因表达载体的构建1.构建基因表达载体的目的。(1)让目的基因在受体细胞中

稳定存在

,并且遗传给下一代。

(2)使目的基因能够

表达

和发挥作用。

2.基因表达载体的组成。

3.基因表达载体的构建过程首先用一定的

限制酶

切割载体,使它出现一个切口;然后用同种限制酶或能产生

相同末端

的限制酶切割含有

目的基因

的DNA片段;再利用

DNA连接酶

将目的基因片段拼接到载体的切口处,形成一个

重组DNA

分子。

微思考1目的基因的插入位点是随意的吗?为什么?提示:不是。基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入启动子与终止子之间,若目的基因插入启动子内部,启动子将失去原有的功能。微判断11.基因表达载体的复制和目的基因的表达均启动于复制原点。(

)2.外源DNA必须位于重组质粒的启动子上游或终止子的下游才能进行表达。(

)3.借助抗生素抗性基因可将含目的基因的受体细胞筛选出来。(

)××√三、将目的基因导入受体细胞1.导入植物细胞。(1)常用:

农杆菌转化

法。

(2)我国独创:

花粉管通道

法。

2.导入动物细胞。(1)方法:

显微注射

技术。

(2)常用受体细胞:

受精卵

。

3.导入微生物细胞。(1)常用方法:先用

Ca2+

处理受体细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。

(2)常用受体细胞:原核细胞,最广泛的是

大肠杆菌

细胞。四、目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测。(1)通过

PCR

等技术检测生物体的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了

mRNA

。(2)从转基因生物体中提取蛋白质,用相应的抗体进行

抗原—抗体杂交

,检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质等。2.个体生物学水平的鉴定。例如,通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。微思考2基因工程的四个操作步骤中,哪些步骤没有发生碱基互补配对?提示:只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有发生碱基互补配对。第一步,碱基互补配对发生在PCR扩增目的基因的过程中。第二步,碱基互补配对发生在目的基因片段与载体相互拼接的过程中。第四步,碱基互补配对发生在目的基因的导入检测和转录检测过程中。五、DNA片段的扩增及电泳鉴定1.原理。(1)PCR利用了DNA的

热变性

原理,通过调节温度来控制DNA双链的

解聚与结合

。PCR仪实质上就是一台能够自动

调控温度

的仪器。一次PCR一般要经历

30

次循环。

(2)DNA分子具有

可解离的基团

,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。(3)PCR的产物一般通过

琼脂糖凝胶电泳

来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的

浓度

、

DNA分子的大小

和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过

染色

,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。

2.方法步骤。

微判断21.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。(

)2.PCR利用了DNA的热变性原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。(

)3.凝胶中的DNA分子可以直接在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。(

)×√×一

目的基因的筛选与获取问题探究探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段。在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针,用于检测目标核苷酸序列是否存在。为了获得某DNA单链作探针,可应用PCR进行扩增。比较项目DNA复制PCR场所细胞内体外能量需ATP提供能量不需ATP提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶特点边解旋边复制,半保留复制体外迅速扩增(1)PCR与生物体内DNA复制有区别吗?请列表格进行比较。提示:比较项目DNA复制PCR循环次数受生物体自身控制30次缓冲液不需要需要设备无严格控制温度变化的温控设备(2)PCR反应过程中复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关,假设引物的长度相同,当G—C含量高时,对复性温度的设定有什么要求?说明理由。提示:当引物中的G—C含量高时,设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键,A—T之间有两个氢键。归纳总结1.目的基因的筛选是根据基因的有关信息,包括基因的核苷酸序列、基因的位置、基因的表达产物等,借助测序技术以及序列数据库、序列比对工具的辅助进行筛选。2.PCR反应过程。

3.PCR反应中应注意的问题。(1)PCR设计的引物长度通常为20~30个核苷酸,若引物太长会使扩增效率降低,而引物太短又容易导致异常DNA的产生。(2)PCR技术通过高温加热使双链DNA解旋,该过程不需要解旋酶的参与。双链DNA在高温下解链的现象称为DNA的变性,在降温时,双链可以重新形成,所以DNA的热变性是可逆的。(3)PCR扩增时,复性温度的设定是成败的关键。复性温度的设定主要与引物的长度和碱基组成中G—C比例呈正相关。若复性温度太高,则引物无法与模板链结合,无法进行DNA复制,PCR反应得不到扩增产物。(4)耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端开始连接单个的脱氧核苷酸进行PCR扩增。典例剖析【例1】下列关于PCR反应体系中所加物质作用的描述,错误的是(

)A.耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成B.引物使TaqDNA聚合酶从引物的5'端开始延伸DNA链C.目标DNA母链用作DNA复制的模板D.4种脱氧核苷酸为PCR提供原料答案:B解析:通过PCR技术扩增目的基因时,需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链,A项正确。在复制时,引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,TaqDNA聚合酶从引物的3'端开始延伸DNA链,因此DNA的合成总是从子链的5'端向3'端延伸,B项错误。PCR技术的原理是DNA双链复制,DNA复制时两条链均作为模板,C项正确。DNA合成的原料是4种脱氧核苷酸,D项正确。学以致用1.下列有关体内DNA复制与PCR比较的叙述,错误的是(

)A.二者子链的延伸方向相同,均为5'端→3'端B.二者均需要通过解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量,PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对方式相同答案:B解析:PCR反应中双链DNA解开不需要解旋酶,氢键在高温条件下断裂。二

基因表达载体的构建问题探究科学家构建了含有大洋鳕鱼抗冻蛋白基因启动子和大鳞鲑鱼生长激素基因的表达载体,并将其导入了大西洋鲑的细胞中,获得了生长速度加快的转基因大西洋鲑。(1)在构建基因表达载体时,用限制酶切割载体和获取目的基因时需注意哪些问题?提示:①切割载体和获取目的基因时,使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶),目的是产生相同的黏性末端或平末端。②选择限制酶切割位点时,必须保证标记基因的完整性。限制酶切割位点应位于标记基因之外,不能破坏标记基因,以便于筛选。③获取一个目的基因需要限制酶切割两次,共产生四个黏性末端或平末端。(2)培育转基因生物的核心工作是什么?构建基因表达载体的目的是什么?提示:培育转基因生物的核心工作是基因表达载体的构建。构建基因表达载体的目的:①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代;②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。归纳总结1.基因表达载体的构建过程。2.需要注意的问题。(1)基因表达载体不等于载体:基因表达载体在载体的基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。(2)启动子不等于起始密码子,终止子不等于终止密码子:启动子和终止子位于DNA片段上,分别调控转录的启动和终止;起始密码子和终止密码子位于mRNA上,分别调控翻译的启动和终止。(3)目的基因的插入位点不是随意的:基因的表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插到启动子与终止子之间的部位,且目的基因的插入不能破坏标记基因。典例剖析【例2】下图是利用基因工程技术培育转基因植物,进而生产可食用疫苗的部分过程示意图,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列相关叙述错误的是(

)A.图示过程是基因工程的核心步骤B.基因表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠC.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D.除图示组成外,基因表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构答案:B解析:题图为基因表达载体的构建过程,是基因工程中的核心步骤,A项正确。构建基因表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来,此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ,B项错误。卡那霉素抗性基因是标记基因,目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞,C项正确。基因表达载体应包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等结构,D项正确。学以致用2.下图为基因表达载体的模式图。若结构X是基因表达载体所必需的,则X最可能是(

)A.氨苄青霉素抗性基因 B.启动子C.限制酶

D.DNA连接酶答案:B解析:启动子是该基因表达载体所必需的,其功能是驱动基因的转录过程。三

将目的基因导入受体细胞问题探究

某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒介导转入大肠杆菌细胞内,使其表达产生大量生长激素,应用于侏儒症的早期治疗。而α1-抗胰蛋白酶缺乏症是一种单基因遗传病,患者成年后会出现肺气肿及其他疾病,严重者甚至死亡。利用基因工程技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵,最终培育出能在乳腺细胞表达人α1-抗胰蛋白酶的转基因羊,从而更容易获得这种酶。(1)研究人员是如何将目的基因导入大肠杆菌的?提示:先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。(2)将目的基因导入动物细胞通常采用的方法是什么?除了受精卵外,还可将目的基因导入动物的什么细胞?提示:显微注射法。还可将目的基因导入动物的胚胎干细胞,因为胚胎干细胞也能发育成动物体。归纳总结1.目的基因导入受体细胞的过程。2.将目的基因导入受体细胞的方法。(1)常用方法。受体类型植物动物大肠杆菌转化过程将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA中提纯含目的基因的表达载体→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的转基因动物先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中(2)农杆菌转化法分析。①完成基因表达载体的构建,需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶。②由棉株细胞形成抗虫棉需要运用植物组织培养技术。特别提醒农杆菌转化法适用于向双子叶植物和裸子植物导入目的基因。向单子叶植物导入目的基因可用基因枪法。典例剖析【例3】采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基因的做法正确的是(

)①将Bt抗虫蛋白注射到棉花受精卵中②将编码Bt抗虫蛋白的DNA序列注入棉花受精卵中③将编码Bt抗虫蛋白的DNA序列与质粒重组导入细菌,用该细菌感染棉花体细胞,再进行组织培养④将编码Bt抗虫蛋白的DNA序列与质粒重组,注入棉花子房,并进入受精卵A.①②

B.②③

C.③④

D.①④

C解析:将Bt抗虫蛋白注射到棉花受精卵中,受精卵没有获得目的基因,子代细胞不会有抗虫性状,①错误。将编码Bt抗虫蛋白的DNA序列注入棉花受精卵中,而没有将目的基因与载体结合,目的基因容易被水解掉,②错误。在植物基因工程中,利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞,然后通过植物组织培养技术将植物细胞培养成完整植株,③正确。在植物基因工程中,可以利用花粉管通道法将目的基因导入棉花受精卵中,然后发育为转基因植株,④正确。学以致用3.下列有关将目的基因导入受体细胞的叙述,错误的是(

)A.将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法B.将目的基因导入小鼠受精卵内常用显微注射技术C.将目的基因导入大肠杆菌内常用Ca2+处理法D.将目的基因导入小麦细胞内常用农杆菌转化法答案:D解析:小麦是单子叶植物,农杆菌对它没有侵染能力。四

目的基因的检测与鉴定问题探究1997年,我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年,我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个,减少农药用量约40万吨,增收节支社会经济效益约450亿元。(1)检测棉花中导入的抗虫基因是否表达,最简便的方法是什么?提示:用棉花叶片饲养棉铃虫,观察棉铃虫是否死亡。

(2)用什么方法检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA?提示:PCR等技术。(3)如果棉花中插入的Bt基因转录成功,是否就一定能够翻译出相应的蛋白质呢?如何从分子水平进行检测?提示:不一定翻译出相应的蛋白质。可从转基因棉花中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。归纳总结1.目的基因的检测与鉴定。2.不同分子检测原理的异同。(1)检测目的基因是否插入受体DNA中、目的基因是否转录时,用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则,只是被检测的物质不同,一个是转基因生物的基因组DNA,一个是转基因生物细胞内的mRNA。(2)检测目的基因是否翻译时,通常以目的基因的表达产物(蛋白质)作抗原,制备相应抗体,利用抗原与抗体特异性结合的原理检测转基因生物的蛋白质。(3)无论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测,都是在体外进行的。典例剖析【例4】下列不能用于检测目的基因是否成功导入或表达的方法是(

)A.显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因B.在含某种抗生素的培养基中培养导入了重组质粒的大肠杆菌C.利用相应的DNA探针与受体细胞DNA分子进行杂交D.提取受体细胞的蛋白质,利用抗原—抗体杂交法进行检测答案:A解析:在显微镜下无法观察到基因,因此该方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达。学以致用4.将苏云金杆菌的Bt基因导入棉花植株后,从个体生物学水平进行鉴定时应鉴定其(

)A.是否有抗药性B.是否有相应的抗虫性状C.是否能检测到标记基因D.是否能分离到目的基因答案:B1.PCR利用了DNA热变性的原理,PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器。下列对PCR过程中“温度的控制”的说法,错误的是(

)A.变性需要高的温度,是为了使双链DNA解聚为单链B.延伸的温度必须大于复性温度,而小于变性温度C.DNA聚合酶具有耐高温的能力D.DNA解旋酶具有耐高温的能力答案:D解析:PCR是体外扩增DNA技术,DNA双链的解开并不需要解旋酶,而是靠90

℃以上高温使其变性,双链DNA解聚为单链;当温度下降到50

℃左右时,DNA复性,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合;当温度上升到72

℃左右时,4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA,因此延伸的温度要大于复性温度而小于变性温度。2.下列基因工程的操作步骤中,未发生碱基互补配对的是(

)A.人工条件下以mRNA为模板逆转录合成目的基因B.目的基因与质粒结合C.重组质粒导入受体细胞D.目的基因的表达答案:C3.下列关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述,错误的是(