应用蛋白质基因组学技术系统发现普洱茶渥堆优势微生物食腺嘌呤节孢酵母新基因的研究

应用蛋白质基因组学技术系统发现普洱茶渥堆优势微生物食腺嘌呤节孢酵母新基因的研究普洱茶是以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青茶为原料,采用渥堆发酵等一序列加工工艺制成,具有独特品质的茶叶。在普洱茶的发酵过程中,主要微生物决定了其主要品质。微生物是普洱茶生产工艺的核心,但由于这些物种分子生物学信息等知识的缺乏,对这些发酵过程中占优势的微生物资源特性、基因组组成及其在发酵过程中的作用和机制研究尚不多见。蛋白质是生物功能的直接执行者,对其品质形成起主要作用的微生物进行深入的蛋白质基因组学研究不仅可以发现系列新基因,实现基因组的重注释,为这些关键优势微生物的生物学和发酵机制研究创造条件,而发现的普洱茶微生物发酵和物种相关特异基因的鉴定还可为普洱茶产品重构和资源保护提供依据和技术手段,因而显得迫切和至关重要。本文对普洱茶发酵过程中的1株主要微生物食腺嘌呤节孢酵母采用系列蛋白质基因组学方法进行探究：(1)先对其进行全基因组测序,在基因组水平揭示其遗传密码,完成基因组的初步注释；(2)利用高覆盖蛋白质组学技术实现该菌株的蛋白质组深度覆盖,建立蛋白质组数据库,比较、验证已注释基因；(3)利用新近发展的精准蛋白质基因组学技术鉴定传统基因组学研究未能注释的基因：(4)利用肽段合成、目标引导质谱分析和谱图比对技术验证新鉴定基因,确定基因编码框,修正已注释基因边界,补充新基因,注销过度注释或错误注释基因,实现基因组的重注释；(5)利用新鉴定基因的特征修改基因组注释程序,试图发现更多的新基因,提升基因组学研究技术；(6)鉴别物种特异新基因,建立菌种鉴别和溯源技术；(7)开展茶与非茶底物作为培养基的差异蛋白质组研究,鉴定茶发酵相关基因、通路和网络,揭示其中的关键基因,为内含物质转变及其分子机制研究奠定基础。研究表明：(1)该物种基因组大小为12.14Mbp,GC%含量为48.20%,预测基因数目5,894个,编码区占基因组总长的71.37%；(2)YPD与TAE两种培养条件下共鉴定了4,900个基因,为预测基因数目的83.14%,有994个注释基因未检测到蛋白,相对于YPD培养基,有386个蛋白仅在在TAE条件下被鉴定到,这些蛋白涉及到氨基酸代谢、脂类代谢、胞内转运与分解代谢、多糖合成与代谢与次生代谢产物合成等代谢途径；(3)利用精准蛋白质基因组学技术,合成肽段398进行目标引导质谱分析,与原先谱图进行对比验证后,发现新基因52个,修正注释基因边界119个,其中发现有蛋白质N端延伸现象的基因51个,有61个基因的外显子编码区域发生了延伸,发现7个基因可能存在移框读码现象,实现了基因组重注释。本文对该微生物基因组和蛋白组水平进行了系统调查,对其基因组进行了注释,并大规模地鉴定了基因的表达产物蛋白质,建立了高覆盖蛋白质组数据库。证实了83.14%的注释基因的表达,蛋白质组学研究为基因组学研究提供了一个验证的方法和标准。YPD培养条件下鉴定了73.89%的注释基因产物,说明大部分注释基因在常规培养条件下是稳定高覆盖表达的。利用精准蛋白质基因组学技术,发现和验证了52个新基因,为注释基因的0.88%,纠正了119个注释基因边界,为注释基因的2.02%。筛选了茶叶水提取物培养条件下特异表达的涉及多种代谢途径的多个基因,为揭示普洱茶渥堆过程中食腺嘌呤节孢酵母与普洱茶内含成分转变提供了全新的视角,也彰显了比较蛋白质组学在探究生命体在不同生理条件下蛋白质表达差异的高灵敏性。本研究也证实了精准蛋白质基因组学在揭示基因表达规律、验证和纠正基因组注释、筛选功能基因等方面的实用性和创新性。本研究的新颖性