33单元八 微生物的常规检验技术 项目一 微生物的常规检验技术（三、霉菌、酵母菌菌数的测定）

微生物学基础单元十一微生物的常规检验技术

１霉菌、酵母菌菌数测定的概念和意义三、霉菌、酵母菌菌数的测定

项目一微生物的常规检验技术霉菌、酵母菌菌数测定的概念：霉菌和酵母菌分布广泛,在食品和药物上可作为正常菌群的一部分,或随空气传播，在消毒不适当的设备上发现，故可测定出霉菌、酵母菌的菌数；霉菌、酵母菌菌数测定的卫生学意义:食品和药物若遭受霉菌和酵母菌的侵染,则发生霉坏变质，而引起急性和慢性中毒；因此,对食品和药物中的霉菌和酵母菌进行检测,具有重要的卫生学意义。

２霉菌、酵母菌菌数测定的目的要求和基本原理三、霉菌、酵母菌菌数的测定

目的要求：掌握霉菌和酵母菌总数的测定方法；基本原理:霉菌和酵母菌菌数是指食品（药物）检样经过处理,在一定条件下培养后，所得

1g或1mL检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数。霉菌和酵母菌菌数主要作为食品、药物被真菌污染的标志，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

３实训用品三、霉菌、酵母菌菌数的测定

培养基和试剂：马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基、盂加拉红培养基；仪器和材料:恒温培养箱(28℃±1℃)、冰箱(2℃~5℃)、恒温水浴箱(46℃±1℃)、天平(感量

为0.1g)、均质器、振荡器、显微镜(10×~100×)；

吸管(1mL和10ml)、锥形瓶(容量250mL、500ml)、广口瓶(500mL)、培养皿(直径

90mm)、试管(10mm×75mm)、牛皮纸袋、塑料袋。

4检验程序三、霉菌、酵母菌菌数的测定

5操作步骤--样品的稀释三、霉菌、酵母菌菌数的测定

样品稀释步骤：第一步：固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，制成1:10的样品匀液；第二步：液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀,制成1:10的样品匀液；第三步：取1mL1:10稀释液注入含有9ml无菌水的试管中，另换一支1mL无菌吸管反复吹吸，此液为1:100稀释液；第四步：按上项操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管；第五步：根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1ml样品稀释液加人2个无菌平皿作空白对照；第六步：及时将15-20mL冷却至46℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混匀。

5操作步骤--培养、菌落计数三、霉菌、酵母菌菌数的测定

培养：待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养５d,观察并记录；菌落计数：

✔肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数，以菌落形成单位(cfu)表示；

✔选取菌落数在10~150cfu的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数；霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。

６结果与报告三、霉菌、酵母菌菌数的测定

结果计算方法：计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算；

✔若所有平板上菌落数均大于150cfu,，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算；

✔若所有平板上菌落数均小于10cfu,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；

✔若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数；结果报告方法：

✔菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告；

✔菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字；

✔称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。

７实训结果三、霉菌、酵母菌菌数的测定

将各稀释度的霉菌和酵母菌菌落数填入下表：培养皿号稀释度培养皿１培养皿２平均数该样品的霉菌和酵母菌总数是：___________cfu/g（mL）。

８霉菌直接镜检计数法（郝氏霉菌计测法)cfu/g(mL)三、霉菌、酵母菌菌数的测定

仪器与材料：折光仪、显微镜、郝氏计测玻片(具有标准计测室的特制玻片)、盖玻片、测微器(具标准刻度的玻片)；操作步骤：第一步：检样的制备：取定量检样。加蒸馏水稀释至折光指数为1.3447~1.3460(即浓度为7.9%~8.89%),备用；第二步：显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90~125倍调节标准视野,使其直径为1.382mm；第三步：涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀地摊布于计测室,以备观察；第四步：观测：将制好的载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样观察50个视野,同一检样应由两人进行观察；第五步：结果与计算：在标准视野下,发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野(1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的I/6（即测微器的一格)时即为阳性（+），否则为阴性（-），按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。

９注意事项三、霉菌、酵母菌菌数的测定

目前国外测定霉菌和酵母菌数常用的培养基有酸性马铃薯葡葡糖琼脂、平板计数琼脂、嗜真菌性琼脂和麦芽汁琼脂等，测定霉菌和酵母菌数的效果一致。在嗜真菌性琼脂上，霉菌生长迅速易使菌落连在一起，因此采用此培养基计数时，必须在2d之内开始计数；本方法两种计数培养基加入的抗生素，可以抑制细菌的生长，有利于霉菌和酵母菌的计数,但对某此霉菌的