动物细胞大规模培养技术

动物细胞大规模培养技术

1精选PPT动物细胞大规模培养技术

1精选PPT动物细胞大规模培养技术

动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养法和悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、中空纤维法等。如今这一技术已广泛应用于现代生物制药的研究和生产中。它的应用大大减少了用于疾病预防、治疗和诊断的实验动物，为生产疫苗、细胞因子、生物产品乃至人造组织等产品提供了强有力的工具。

2精选PPT动物细胞大规模培养技术

动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁1悬浮培养技术基本操作(1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液\过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。传代时按比例稀释即可继续培养。3精选PPT1悬浮培养技术基本操作3精选PPT4精选PPT4精选PPT对贴壁性细胞，最初采用在培养液中加人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的贴壁面积。此方法构造简单，成本低，重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的增加。但产率低，劳动强度大，占空间大。微载体系统培养贴壁细胞，一定程度上改变了以上这些不足。微载体是直径60—250um的微珠。2微载体培养技术5精选PPT对贴壁性细胞，最初采用在培养液中加人一定数量的小滚瓶，增加细理想的细胞支持物应该具备特征：(1)生物相容性．(2)简便的无毒害固定化过程。(3)良好的传质特性。(4)良好的机械稳定性。(5)最大的比表面积。(6)适合细胞生长的形状和大小。(7)粒径分布均一。6精选PPT理想的细胞支持物应该具备特征：(1)生物相容性．6精(8)能高压灭菌。(9)可重复利用，易于清洗。(10)能保护细胞免受机械损伤。(11)接种方便。(12)能固定大部分细胞。(13)适合大规模培养。(14)易使细胞、载体与培养基分离。(15)适合于贴壁细胞和悬浮细胞的培养。7精选PPT(8)能高压灭菌。7精选PPT微载体系统培养细胞的步骤是：(1)选择合适的微载体类型(2)浸泡水化及消毒(3)接种(4)培养观察与细胞记数(5)消化(通常用酶消化法)。8精选PPT微载体系统培养细胞的步骤是：(1)选择合适的微载体类型8精选采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获得更完整的细胞膜和更高的细胞活性。胶原酶专一性好，不损伤细胞膜，效果较好。9精选PPT采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获得更完整的细胞膜和更(6)分离细胞：对于回收率要求不高的细胞种类，分组沉降简单易行。脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液中分离收集细胞，400r／min，2min离心加速微载体沉淀。10精选PPT(6)分离细胞：对于回收率要求不高的细胞种类，分组沉降(7)传代培养：如果进行放大培养，可在细胞脱离微载体后，加入一些新的微载体以增大培养体积，提高培养液的利用率，不过此法比全部用新微载体的细胞得率要少。尽量减少培养液中Ca2+浓度可促进微载体之间的细胞转移。

11精选PPT(7)传代培养：如果进行放大培养，可在细胞脱离微载体后除了交联葡聚糖为基质的微载体,还可采用以下微载体：1)纤维素为基质微载体：2)蛋白质为基质微载体：变性胶原微载体，蛋黄色，表面特性好，易与细胞结合。3)高分子材料为基质微载体：4)无机玻璃基质微载体。

12精选PPT除了交联葡聚糖为基质的微载体,还可采用以下微载体：12精选P3多孔载体培养

一优点降低血清用量，增加细胞固定性。大的生长空间，免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量，强化传质。多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细胞的固定化连续灌流培养。多孔载体固定细胞过程简单，对细胞无毒害和损伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移到未长细胞的新载体上生长，接种方便，培养简单，特别适合于反应器大规模培养。13精选PPT3多孔载体培养

一优点13精选PPT多孔载体制备的材料选择主要考虑材料的生物相容性、机械稳定性和热稳(1）生物相容性：材料对细胞必须无毒害，对贴壁细胞有良好的黏附作用。(2)机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下不破碎；同时满足微载体清洗处理、回收利用的要求。(3)热稳定性：在121℃、蒸汽灭菌下不分解、不破碎、不软化。14精选PPT多孔载体制备的材料选择主要考虑材料的生物相容性、机械稳定性和4微囊化培养技术微囊是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可以自由透过，而各种酶、辅酶、离子交换剂、活性炭及蛋白等大分子物质可包裹在其中不能逸出，利用它们催化反应底物。微囊化培养是借鉴固定化技术将细胞包裹在微囊中，在培养液中悬浮培养。细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护，细胞总的生长体积有了一定的增加，而且减少了搅拌对细胞产生的剪切力。微囊化培养为单克隆抗体、干扰素等生产提供了有效途径。15精选PPT4微囊化培养技术微囊是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体，5中空纤维法中空纤维细胞培养技术是理查德·克瑞克等在1972年发明的。最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。这样，水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也可在上面帖附生长。16精选PPT5中空纤维法16精选PPT中空纤维细胞培养技术就是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管”——中空纤维供给细胞生长的营养等条件。培养系统的核心部分由3-6层这样的空心纤维组成，培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔。培养一段时间后，逐渐用无血培养基代替含血培养基。此时虽然细胞不再增殖，但能正常生活并分泌所需的代谢产物。由手这种培养方法在分离和纯化分泌物时比较方便，因而在生产激素和单抗时经常采用。17精选PPT中空纤维细胞培养技术就是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人九动物细胞生物反应器培养9．1生物反应器的特点分析由于动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切敏感以及对体外培养环境有严格的要求，传统的微生物发酵反应器不适用于动物细胞的大量培养，因而对动物细胞培养用反应器的设计和过程控制提出了特殊的要求。细胞培养用生物反应器的种类越来越多，规模也越来越大，反应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固定床为主。18精选PPT九动物细胞生物反应器培养9．1生物反应器的特点分析18用于动物细胞与组织培养的

生物反应器应具备的基本要求：(1)混合系统设计应能提供均匀、温和的混合状态，剪切力小，保证良好的传质效果。(2)反应器内空间利用率高，选用合适的载体系统和材料。(3)能严格保证无菌环境。(4)能精确地控制温度、酸碱度、溶解氧和C02浓度等条件。(5)能够方便地实现培养液的连续添加、样品的采样和观察。19精选PPT用于动物细胞与组织培养的

生物反应器应具备的基本要求：9．2生物反应器应用概况

采用生物反应器进行动物细胞培养是一种有效的途径。但是，由于动物细胞、组织的多样性，使得在培养材料、培养环境等方面千差万别，因此，如何根据培养对象体内生存环境的特点，开发合适的生物反应器模拟体内营养与环境进行高效离体培养，并对培养条件、工艺等进行优化将是重要的研究课题。动物细胞培养用生物反应器一般有微载体式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等，几种新型的反应器类型特点介绍如下：20精选PPT9．2生物反应器应用概况

采用生物反应器进行动物细胞培养(一)柱状中空纤维反应器中空纤维细胞反应器主体是由微孔中空纤维管束制成的，纤维束由外壳包裹，因此可分为壳体空间及管体空间两部分，每部分各有其进出口。一般讲，细胞生长在壳体部分，新鲜培养液从壳体部分导人，气体在管体部分通过，其中一部分则均匀地扩散至壳体部分。壳体部分的细胞如是附壁性的，则附着在纤维外侧，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化并冲出：若是非附壁性的应采用微滤材料将其截留在壳体内而让废培养液排出。21精选PPT(一)柱状中空纤维反应器中空纤维细胞反应器主体是由微(二)板框式中空纤维反应器因柱状中空纤维反应器中营养供应和代谢产物会存在浓度梯度，所以细胞分布受到影响而不均匀。人们开发出板框式中空纤维反应器。该反应器的中心是一束中空纤维浅床，置于两个不锈钢微孔滤板之间。22精选PPT(二)板框式中空纤维反应器因柱状中空纤维反应器中营养供应板框式中空纤维反应器

液营养

中空纤维板23精选PPT板框式中空纤维反应器液营养中空纤维板23精三、中心灌流式反应器24精选PPT三、中心灌流式反应器24精选PPT四、灌流微载体生物反应器25精选PPT四、灌流微载体生物反应器25精选PPT(五)旋转壁式反应器一般由水平放置的内外两个同心圆柱组成。静态的内柱由半透膜构成，使气体可以通过该膜进行交换。旋转的外柱由非通透性材料制成。26精选PPT(五)旋转壁式反应器一般由水平放置的内外两个同心圆柱组成。静10生物反应器动物细胞大规模培养1.病毒疫苗2.非抗体免疫调节剂3.多肽生长因子4.酶类5.激素6.肿瘤特异性抗原7.单克隆抗体8.病毒杀虫剂27精选PPT10生物反应器动物细胞大规模培养1.病毒疫苗27精选PPT注意几个问题：

(一)细胞培养环境(1)氨离子：细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。(2)乳酸：(3)二氧化碳：二氧化碳积聚，对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。(4)甲基乙二醛(Mc)：(5)渗透压：(6)载体：可考虑采用多孔敬载体替代容易使细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。28精选PPT注意几个问题：

(一)细胞培养环境28精选PPT(二)细胞死亡与凋亡

大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中死亡主要原因是细胞凋亡。

用基因工程方法将bcl—2基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞。bcl—2基因的过量表达能抑制细胞凋亡，提高细胞密度和目的蛋白产量。大规模动物细胞培养条件下，可通过“细胞静止”过程来降低营养成分消耗和代谢毒物产生。

29精选PPT(二)细胞死亡与凋亡

大规模细胞培养的后期，维持细胞高

(三)培养基与细胞系

动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于产品纯化等不良影响。在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。30精选PPT(三)培养基与细胞系

动物细胞培养基是细胞赖以生(四)过程监控测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间；用在线葡萄糖分析仪的测定调整灌流速度；测定氧消耗估计营养供应率的代谢负荷；测定氧吸收速率估测ATP的形成；测量在线氧化还原能力作为活细胞浓度的指标等均得以应用。31精选PPT(四)过程监控测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒到病测定在线氧吸收速率并用质谱仪分析废气中二氧化碳呼出率计算呼吸商。一般来说，呼吸商应接近1.0，这就要求细胞培养中尽量降低氧消耗和二氧化碳排出。用亲和层析与在线取样系统偶联进行在线蛋白质含量测定。另外，用在线蛋白分解与反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品的一致性。32精选PPT测定在线氧吸收速率并用质谱仪分析废气中二氧化碳呼出率计算呼吸计数法(细胞运输)

当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换和购买，也在国际交流，为此需要装运细胞的方法。

一种是用液氮或干冰贮存运输，需要特殊容器，较麻烦，且不适于长时间运行。另一方法为充液法，方便当行，是当前多采用的方法。

具体方法：选生长状态良好的细胞，待培养近单层后，去掉培养液充满新培养液。液量要达培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞一吸塞，保留微量空气。空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。

一般经4～5天运输对细胞活力无大影响。时间过长,细胞活力下降。到达后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液体量。置37摄氏度培养，

次日传代。33精选PPT计数法(细胞运输)当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换和十一动物细胞体外培养举例

肿瘤细胞的体外培养与建系过程体外培养肿瘤细胞的历史一定程度上代表了动物细胞体外培养的发展历史。1952年，盖尔(Gey)首先成功地建立世界上第一个细胞系——子宫颈癌细胞的细胞系，并且使恶性肿瘤细胞的培养从间叶组织源性的细胞转向上皮源性细胞。34精选PPT十一动物细胞体外培养举例

肿瘤细胞的体外培养与建系过程34

肿瘤细胞培养的发展成就主要体现在以下几个方面：(1)在培养的肿瘤细胞类型上，从间充质源性的细胞转向上皮源性细胞，再由神经外胚层源性到造血细胞源