细胞与免疫学技术与原理

关于细胞与免疫学技术与原理

细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞的遗传特性和生物学特性，以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术。第2页,共187页，2024年2月25日，星期天第一节

细胞融合技术第3页,共187页，2024年2月25日，星期天动物方面组装鼠美国耶鲁大学教授马格特和彼德斯利用黑毛鼠，白毛鼠，黄毛鼠三种颜色的老鼠的受精卵组装成披着黄百黑三种颜色的老鼠。绵山羊英国和美国还组装成功了绵羊和山羊的嵌合体，培育出具有绵羊的卷曲浓密的长毛，山羊式的仰角的绵山羊，毛肉兼用。第4页,共187页，2024年2月25日，星期天植物方面薯番茄和番茄薯

人们用马铃薯和番茄通过细胞融合获得杂种薯番茄和番茄薯甘蓝型欧洲油菜

用甘蓝和白菜的细胞融合使两个物种的染色体组相加，人工合成了甘蓝型欧洲油菜。第5页,共187页，2024年2月25日，星期天微生物方面苏云金杆菌能杀玉米螟，灭蚊球孢菌有杀蚊子的效能，科学家们将这两种菌的原生质体融合获得了既能灭蚊又能杀螟的新菌株。

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这些都是自然进化所不能出现的新品种，他主要是通过细胞融合技术来实现的。细胞融合是细胞工程最基本的核心技术。

第7页,共187页，2024年2月25日，星期天细胞融合（又称体细胞杂交）：

是指用自然或人工方法使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。

第8页,共187页，2024年2月25日，星期天融合材料植物或微生物原生质体动物单个细胞第9页,共187页，2024年2月25日，星期天第10页,共187页，2024年2月25日，星期天生物法——仙台病毒法

1958年日本冈田善雄紫外光灭活的仙台病毒可以诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合；也可使两种不同的动物细胞之间发生凝集，进而融合成一体。动物细胞融合中，仙台病毒为产生细胞杂种的标准融合剂。第11页,共187页，2024年2月25日，星期天病毒诱导的细胞融合的过程首先是细胞表面吸附许多病毒粒子。接着是细胞发生凝集。几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失。最后就在这个部位．邻接细胞的细胞膜融合，胞浆得以相互交流，最后形成融合细胞。第12页,共187页，2024年2月25日，星期天病毒诱导的动物细胞融合第13页,共187页，2024年2月25日，星期天病毒诱导的细胞融合的缺点制备困难；每批病毒融合效价差别比较大，实验的重复性差；灭活不完全时，有病毒感染的危险。

融合率较低第14页,共187页，2024年2月25日，星期天化学法——PEG

优点：聚乙二醇（PEG）来源方便，使用简便活性稳定诱导细胞融合的频率较仙台病毒高达数百倍诱导植物和动物细胞融合第15页,共187页，2024年2月25日，星期天聚乙二醇的作用机理PEG的水溶性极强，在液相介质中，它的许多醚键带有微弱负电荷；在Ca2+参与下，PEG将带正电荷的表面蛋白或带负电荷的糖蛋白，通过Ca2+桥连在—起，使细胞发生聚集、融合。第16页,共187页，2024年2月25日，星期天PEG的作用与细胞表面结构间形成离子键有关。PEG可与水分子借氢键结合，在高浓度(50％)的PEG溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，由此引起细胞融合。第17页,共187页，2024年2月25日，星期天化学诱导法的特点优点：具有细胞融合的通用性；与病毒比较，容易制备和控制；活性稳定；使用方便。缺点：对细胞毒性很大；诱导产生杂交细胞的频率仍在很低水平；不能在显微镜下观察细胞的融合过程。第18页,共187页，2024年2月25日，星期天物理法——电融合诱导法概述：

在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭合成完整的膜形成融合体。第19页,共187页，2024年2月25日，星期天细胞细胞膜变薄细胞膜出现微孔细胞膜重新闭合细胞膜不能闭合电脉冲电势不断上升达到临界膜电势微孔不大微孔太大第20页,共187页，2024年2月25日，星期天细胞电穿孔第21页,共187页，2024年2月25日，星期天细胞电融合

第22页,共187页，2024年2月25日，星期天电场诱导的细胞融合主要优点：①融合率高，融合率是PEG的l00倍，对细胞伤害小。②操作简便、快速，装置精巧，方便简单，诱导过程可控制性强，重复性强。③因为是物理刺激，无残余毒性，可免去洗涤过程。④具有普遍性，可用于动物、植物和微生物等各类细胞。⑤可用显微镜或录像观察融合过程，探讨融合机理。第23页,共187页，2024年2月25日，星期天缺点：

目前电融合技术存在的主要问题是融合细胞存活率低。第24页,共187页，2024年2月25日，星期天1、利用基因定位绘制人类基因图细胞融合技术的应用第25页,共187页，2024年2月25日，星期天

(1)小鼠×人杂交细胞，人染色体优先丢失，而只留下一条或少数几条人的染色体；

(2)染色体分带技术可以把人与鼠的染色体区分开，而且能区别每一根人的染色体；(3)电泳技术可以鉴别不同种动物的蛋白和酶。第26页,共187页，2024年2月25日，星期天2、利用杂交细胞生产活性物质

单克隆抗体工业的兴起就是利用B淋巴细胞被特异的抗原刺激后能应答而分泌特异的抗体的特点同骨髓瘤细胞的长命不死的特点两者融而为一。第27页,共187页，2024年2月25日，星期天推论：

可能利用胰脏细胞生产胰岛素，利用甲状腺细胞生产甲状腺素，利用垂体细胞生产生长激素、各种促性腺激素、催乳素以及各种神经激素等。还可以利用麝香腺细胞生产麝香。第28页,共187页，2024年2月25日，星期天3、生产实践方面的应用（1）在生物医药上的应用

如：单克隆抗体的生产（2）在微生物构建新菌株方面的应用

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原生质体融合也成了微生物育种的重要手段。乳糖发酵短杆菌和黄色短杆菌是两种重要的氨基酸生产菌，黄色短杆菌是赖氨酸高产菌株，但生长缓慢，发酵周期长，生产中易染菌，将它与生长快的乳糖发酵短杆菌融合，得到了新的赖氨酸生产菌，提高了对葡萄糖的转化率，发酵周期缩短4%。第30页,共187页，2024年2月25日，星期天

对酱油酿制来说，曲霉的蛋白酶对谷氨酸（味鲜）的产量有很大的影响。过去在改良和培育酱油曲霉菌种时，其主要目的是增加产酶能力，但由于产蛋白酶高的菌株产谷酰胺酶的能力低，而产谷酰胺酶高的菌株产蛋白酶的能力低。人们把高产谷酰胺酶和蛋白酶的两株菌原生质体融合，获得双高产的优良菌种。第31页,共187页，2024年2月25日，星期天（3）在水产动物遗传育种上的应用

科学家把大鳞副泥鳅同鳗尾泥鳅杂交培育了融合鱼。将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合，培育了融合鱼苗。这些融合鱼各具两对触须，形态类似鲤鱼。

第32页,共187页，2024年2月25日，星期天（4）在植物新品种育种上的应用萝卜和甘蓝、粉蓝烟草和郎氏烟草、番茄和马铃薯、烟草和大豆、甘蔗和高粱、芥菜和紫芸苦等，这些杂种植物采用有性杂交的方法是难以得到的。我国科学家已培育出普通烟草与黄花烟草、普通烟草与粉蓝烟草、烟草与矮牵牛、烟草与天仙子等种间和属间体细胞杂种植株。第33页,共187页，2024年2月25日，星期天（5）在发酵工程中的应用日本科学家把两个不同种类的酵母强行融合起来，并使融合成的细胞繁殖，制成新的酵母。这一技术为今后改良酵母开辟了新途径，把最尖端的生物工程中的细胞融合办法应用到传统的酿酒技术中，成为守旧的酿造技术体系革新的一个起点。第34页,共187页，2024年2月25日，星期天体细胞融合的技术，如今已在动物间实现了小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，甚至于小鼠和人等许多远缘和超远缘的体细胞杂交。第35页,共187页，2024年2月25日，星期天利用细胞杂交技术来制备工程细胞生产活性物质的优点：

（1）细胞融合率比较高；（2）操作也比基因工程简单；（3）所产生的蛋白都是已糖基化了的天然蛋白；（4）动物细胞大批量生产技术的发展和改进与细胞内高效表达体系的建立，为动物细胞工程的蛋白生产开辟新途径。第36页,共187页，2024年2月25日，星期天第二节动物细胞大规模培养技术

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指人工培养条件下，在动物细胞生物反应器中高密度大量地培养有用动物细胞以生产珍贵生物制品的技术。

第38页,共187页，2024年2月25日，星期天

体外大规模培养真核细胞要比原核细胞困难得多。无细胞壁，不耐受搅拌，易破碎，营养要求高，生长条件不易控制，增殖周期长，产品的产量低。第39页,共187页，2024年2月25日，星期天

原核细胞经基因工程技术所合成的生物制品，不是分泌型的而是同细胞相结合的，需要破碎细胞，释出产物，再经浓缩、纯化；因后加工过程复杂，而使产品的得率受到损失。第40页,共187页，2024年2月25日，星期天

真核细胞能对其分泌产物进行修饰，例如二硫键的形成、糖甲酰化等，使产物具有完整的生物学功能。第41页,共187页，2024年2月25日，星期天

真核细胞可以不断合成和分泌，不断收获，后加工过程也相对简单，细胞可以重复利用。因此，利用培养的动物细胞生产的生物制品，具有很高的市场价值。第42页,共187页，2024年2月25日，星期天

目前利用动物细胞大规模培养技术可以生产许多有价值的生物制品，包括重要的疫苗、高效的治疗药物和灵敏的诊断试剂等。第43页,共187页，2024年2月25日，星期天1、病毒疫苗：乙肝疫苗（HbsAg）、脊椎灰质炎疫苗（Polio）、狂犬疫苗（Rabies）等。2、非抗体疫苗调节剂：干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）、B细胞生长因子（BCGF）、巨噬细胞激活因子（MAN）、T细胞替代因子（TRF）等。第44页,共187页，2024年2月25日，星期天3、多肽生长因子：神经生长因子（NGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）、血清生长因子（SF）等。4、酶类：组织血纤维溶酶原激活剂（t-PA）等。第45页,共187页，2024年2月25日，星期天5、激素：红细胞生成素（EPO）、促黄体生成素（LH）、促滤胞素（FSH）等。6、肿瘤特异性抗原：癌胚抗原（CEA）等。7、单克隆抗体（MCAB）。8、病毒杀虫剂：杆状病毒等。第46页,共187页，2024年2月25日，星期天全球销售额最高的6大类生物技术药物：1、肿瘤治疗药物2、胰岛素3、anti-TNF-α药物4、促红细胞生成素（EPO）5、β-干扰素6、凝血因子这6大类中有5类都是经哺乳动物细胞表达生产的，只有β-干扰素是大肠杆菌和酵母表达的。第47页,共187页，2024年2月25日，星期天

动物细胞大规模培养和表达，对于生产抗体类蛋白质药物具有明显优势：

1、活性高、稳定性好，占生物技术药物生产方式的70%以上，能够保证产品中二硫键多等复杂结构蛋白的活性；

2、效率高、成本低，能够提升生物技术药物的创新能力和竞争力。

动物细胞大规模培养是当今生物技术药物生产的主流方式。第48页,共187页，2024年2月25日，星期天

目前通过动物细胞培养获得生物制品的研制，必须依赖3个关键技术的发展：（1）基因工程和细胞工程的发展；（2）大规模动物细胞培养技术和生物反应器开发；（3）产品的分离浓缩和提纯技术的提高。第49页,共187页，2024年2月25日，星期天大规模动物细胞培养的生物反应器

第50页,共187页，2024年2月25日，星期天1、滚瓶系统

第51页,共187页，2024年2月25日，星期天第52页,共187页，2024年2月25日，星期天第53页,共187页，2024年2月25日，星期天第54页,共187页，2024年2月25日，星期天第55页,共187页，2024年2月25日，星期天第56页,共187页，2024年2月25日，星期天优点：结构简单、投资少、技术成熟、重演性好，放大只是简单地增加滚瓶数。第57页,共187页，2024年2月25日，星期天缺点：

滚瓶系统劳动强度大，单位体积提供细胞生长的表面积小，占用空间大，按体积计算细胞产率低，监测和控制环境条件受到限制。第58页,共187页，2024年2月25日，星期天2、中空纤维管生物反应器

第59页,共187页，2024年2月25日，星期天中空纤维管生物反应器用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞密度最高可达10６/ml数量级。

中空纤维反应器示意图p-灌注液h-收获液i-管内e-管外

第60页,共187页，2024年2月25日，星期天中空纤维培养示意图第61页,共187页，2024年2月25日，星期天中空纤维管生物反应器已进入工业生产，主要用于培养杂交瘤细胞产生单克隆抗体。第62页,共187页，2024年2月25日，星期天中空纤维用聚砜或丙烯的聚合物制成。管壁的厚约50～75μm，海绵状，富含毛细管。管径200μm。管壁是极薄的半透膜。它能截留住分子量分别为1×104、5×104、10×104道尔顿三种。

第63页,共187页，2024年2月25日，星期天一个培养筒由数千根中空纤维所组成内室：每根纤维的管内成为“内室”；外室：管与管之间的间隙，可灌流无血清培养液供细胞生长，成为“外室”。第64页,共187页，2024年2月25日，星期天接种的细胞贴附“外室”的管壁上，并吸取从“内室”渗透出来养分，迅速生长繁殖。培养液中的血清输入到“外室”，由于血清和细胞分泌产物（如单克隆抗体）的分子量大而无法穿透到“内室”去，只能留在“外室”并且不断被浓缩。第65页,共187页，2024年2月25日，星期天细胞生长繁殖过程中的代谢废物都属小分子物质，可从管壁渗进“内室”。一般细胞在接种1～3周后，就可以完全充满管壁的空隙。细胞停止增殖后，仍可以维持其高水平代谢和分泌功能，长达几个星期甚至几个月。第66页,共187页，2024年2月25日，星期天优点：（1）培养器体积小，细胞高密度生长；（2）浓缩产品的功能；（3）产物纯度高；（4）自动化程度高，细胞生长周期长。（5）如果控制系统不受污染，能长期运转。

第67页,共187页，2024年2月25日，星期天缺点：

由于中空纤维每次生产的消耗器价格尚贵，如果使用不当会增加生产成本。

第68页,共187页，2024年2月25日，星期天3、细胞培养专用微载体

第69页,共187页，2024年2月25日，星期天微载体含义:微载体指直径在60～250μm、能够适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。第70页,共187页，2024年2月25日，星期天第71页,共187页，2024年2月25日，星期天微载体培养的优点：1.表面积/体积（S/V）大。2.

兼有悬浮培养和贴壁培养两种方法优点。3.

简便的显微镜观察。能监测出细胞在微珠生长情况。4.培养基利用率高。

第72页,共187页，2024年2月25日，星期天5.收获细胞过程不复杂。

6.放大容易。7.劳动强度小。8.培养系统占有空间小。微载体培养细胞是目前公认的最有发展前途的一种培养模式。第73页,共187页，2024年2月25日，星期天二、动物细胞在微载体上

贴壁生长机理

贴壁依赖动物细胞在微载体表面上增殖，可分为贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。

第74页,共187页，2024年2月25日，星期天细胞能否在微载体表面贴附，取决于：

1、细胞与微载体接触的机率

2、细胞与微载体的相融性

第75页,共187页，2024年2月25日，星期天一般操作方式

贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停，经数小数后，一旦细胞附着于微载体表面，则维持设定的低转速，进入培养阶段。第76页,共187页，2024年2月25日，星期天微载体表面的理化性质

动物细胞带负电荷。微载体表面带的是正电荷，由于静电相吸作用，使细胞容易贴在微载体表面上。表面光滑的微载体，细胞扩展成单层的速度快。第77页,共187页，2024年2月25日，星期天优良微载体具备特性：1.不含有能毒害细胞的成分。2.与细胞有良好的相容性，使细胞容易贴壁。3.密度应略大于培养基，一般要求在1.03～1.05之间，最大不宜超过1.1。为什么？第78页,共187页，2024年2月25日，星期天4.粒径在40～120μm（干态）范围，经生理盐水溶胀后增大到60～250μm，粒度分布要均匀，表面光滑以利于细胞铺展。5.具有良好的光学透明性，便于显微镜观察细胞生长情况。6.能在PBS中耐120～125℃、20～30min热压灭菌。第79页,共187页，2024年2月25日，星期天7.基质应是非刚性材料，避免在培养过程中相互碰撞而损伤细胞。8.不吸收培养基中的营养成分，特别是血清。9.收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白制品分离纯化。10.价廉，能重复使用。第80页,共187页，2024年2月25日，星期天4、动物细胞的微囊化

培养技术第81页,共187页，2024年2月25日，星期天动物细胞的微囊化

微囊化是固定化技术中的一种，它是用一层亲水性的半透膜将酶、辅酶、蛋白质等生物大分子或动植物细胞包围在珠状的微囊里，从而使得酶等生物大分子和细胞不能从微囊里逸出，而小分子的物质、培养基的营养物质可自由出入半透膜，达到催化或培养的目的。第82页,共187页，2024年2月25日，星期天

微囊化细胞的模式图第83页,共187页，2024年2月25日，星期天优点：

降低剪切力，形成小环境。动物细胞微囊化后，与游离细胞比较，降低了培养时对细胞的剪切力，微囊里实际上是一种微小的培养环境，与液体培养差不多，能使细胞生长良好。第84页,共187页，2024年2月25日，星期天

提高细胞密度、增加产物浓度和纯度。培养过程中，微囊化能提供很高的细胞密度，使得产物浓度增加，纯度提高。动物细胞微囊化克服了大规模细胞培养的一些缺点。第85页,共187页，2024年2月25日，星期天包埋生物大分子及细胞必备条件：1.不伤细胞。微囊化的过程温和，快速，不损伤细胞，尽可能在液体状态和生理条件下制备；2.无毒。微囊化所用的试剂和膜材料必须对细胞无毒害作用；

第86页,共187页，2024年2月25日，星期天3.保证物质交流。微囊化所形成的膜必须能使营养物和代谢产物自由通过，膜的孔径可以控制；4.足够强度。膜应具有足够的机械强度以抵抗培养过程中的搅拌，不至使微囊破裂。目前的方法用得最多的是聚赖氨酸/海藻酸（PLL/ALG）法。第87页,共187页，2024年2月25日，星期天聚赖氨酸/海藻酸（PLL/ALG）微囊化

原理：

海藻酸是以1，4键连接的聚醛酸，其主要成份是甘露糖醛酸和古罗糖醛酸。当它的水溶液以钙盐的形式存在时，则成凝胶状态；而用螯合剂将钙离子去除后，则海藻酸又回复到溶液状态；当海藻酸钙凝胶用聚赖氨酸处理后，其接触部分不再被螯合剂去钙而溶解。第88页,共187页，2024年2月25日，星期天微囊化装置及步骤：

微囊发生器

为得到一定大小、非常均一的微囊，制备微囊需要微囊发生器来完成。第89页,共187页，2024年2月25日，星期天制备微囊化动物的步骤：无菌收集动物细胞，离心后用生理盐水洗涤离心收集细胞，加海藻酸钠溶液混合均匀，成悬浮液；将悬浮液装入微囊发生器，制成微滴第90页,共187页，2024年2月25日，星期天凝胶珠悬浮于聚赖氨酸溶液中，使之形成膜；微滴加到CaCl2溶液中形成凝胶珠凝胶珠用生理盐水洗去残留的CaCl2生理盐水洗涤第91页,共187页，2024年2月25日，星期天得到动物细胞微囊凝胶珠加0.05mol/L柠檬酸溶液处理使半透膜的ALG成液态生理盐水洗涤悬浮于培养基中培养第92页,共187页，2024年2月25日，星期天微囊半透膜的孔径决定因素：主要由聚赖氨酸的分子量决定，一般来说用高分子量的聚赖氨酸（PLL）覆膜孔径大，PLL分子量低则孔径小，通常使用40000～80000分子量的PLL。PLL溶液的浓度及处理时间、溶液的pH值及使用温度也会影响膜的孔径。第93页,共187页，2024年2月25日，星期天微囊机械性能影响因素：海藻酸的纯度高、粘度高容易成囊；甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的比例会影响微囊的形成及机械性能。含古罗糖醛酸多的海藻酸容易成囊，机械性能好，不易破碎。第94页,共187页，2024年2月25日，星期天微囊化动物细胞的应用

1、生产药物（1）单克隆抗体的生产

微囊化哺乳动物细胞的主要应用是单克隆抗体的生产。微囊工艺已生产以克计的单克隆抗体。微囊膜的孔径可以控制在能截留10万以上分子量的蛋白质的水平上，能截留单克隆抗体在微囊中。

第95页,共187页，2024年2月25日，星期天悬浮培养与微囊培养比较

第96页,共187页，2024年2月25日，星期天优点：微囊系统更有利于单克隆抗体的生产，而且单克隆抗体截留在微囊中，培养获得的产物浓度和纯度均更高。培养基中血清尤其是那些γ-蛋白能被半透膜排阻在微囊外，使纯化更简单。

第97页,共187页，2024年2月25日，星期天（2）高值生化药物的生产高表达有工业价值的蛋白质的重组细胞更多的用微囊化培养。例：一种在黑色素瘤细胞中表达的分子量为65000的重组蛋白用微囊化培养，纯化更简便。第98页,共187页，2024年2月25日，星期天（3）干扰素的生产

通过试剂和病毒方法诱导微囊化FS-1和Namalwa细胞生产干扰素。这两种细胞在微囊中生产比悬浮单层培养或单层培养旺盛

第99页,共187页，2024年2月25日，星期天2、在治疗及药物筛选上的应用（1）人工器官

微囊化动物细胞在排除免疫反应上可能有普遍的意义。人们已将某些器官的细胞微囊化并植入体内以期望能代替这些器官的功能。第100页,共187页，2024年2月25日，星期天

人工胰是研究得最多的一种，微囊化肝细胞也被用来研究人工肝。

例：微囊化大鼠兰氏胰岛细胞注入大鼠腹腔内，可用于治疗糖尿病。当4×108～4.5×108个细胞/ml微囊注入体内后，当天就使血糖由400-500mg/dL降至100mg/dL左右，并能长期维持正常血糖水平，在360天内不出现糖尿病症状。第101页,共187页，2024年2月25日，星期天（2）抗癌药的的筛选

微囊化的肿瘤细胞用于估价抗癌药物对活体的作用。

人的肿瘤细胞经微囊化后注入小鼠腹腔中，服用受检的抗癌药，检测微囊化的肿瘤细胞对药物的反应，结果发现抗癌药能穿透微囊的膜作用于微囊中的肿瘤细胞，抑制和杀灭的水平与其它体外和体内测定的药效一致。第102页,共187页，2024年2月25日，星期天第三节体外受精技术第103页,共187页，2024年2月25日，星期天

体外受精是指通过人为操作成熟的卵子与精子在合适的体外环境中完成受精过程。它的基本原理是在人工模拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体、渗透压、pH等，使卵丘卵母细胞复合体中的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能并完成受精。第104页,共187页，2024年2月25日，星期天人工受精与体外受精的主要区别？第105页,共187页，2024年2月25日，星期天人工受精与体外受精的区别与联系第106页,共187页，2024年2月25日，星期天

20世纪60年代初至20世纪80年代中期，人们以家兔、小鼠和大鼠等为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。

试管小鼠（1968）、大鼠（1974）、婴儿（1978）、牛（1982）、山羊（1985）、绵羊（1985）和猪（1986）等相继出生。

第107页,共187页，2024年2月25日，星期天体外受精技术的基本操作程序哺乳动物体外受精的基本操作程序，主要环节包括以下几个方面：1、卵母细胞的采集和成熟培养（1）卵母细胞的采集

活体卵巢上采集：这种方法是借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。

一头健康母牛每周可获得5—10枚卵子。

第108页,共187页，2024年2月25日，星期天（2）母细胞的选择

常把未成熟卵母细胞分为A、B、C和D四个等级。A级卵母细胞要求有三层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀；B级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞层低于三层或部分包围卵母细胞；C级为没有卵丘细胞包围的裸露卵母细胞；D级是死亡或退化的卵母细胞。

一般只培养A级和B级卵母细胞。

第109页,共187页，2024年2月25日，星期天（3）卵母细胞的成熟培养由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟，不需培养可直接与精子受精，对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。第110页,共187页，2024年2月25日，星期天2、精子的采集与体外获能

哺乳动物精子的获能方法有培养和化学诱导两种方法。牛、羊的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。第111页,共187页，2024年2月25日，星期天

3、体外受精将获能的精子和成熟的卵子置于受精液中共同培养，除钙离子载体诱导获能外，精子和卵子一般在获能液中完成受精过程。受精培养时间与获能方法有关。第112页,共187页，2024年2月25日，星期天

4、受精卵的体外培养体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育，此种现象称之发育阻断。用体细胞与胚胎在微滴同培养，利用体细胞生长过程中分泌的有益因子，促进胚胎发育，克服发育阻断。

第113页,共187页，2024年2月25日，星期天第114页,共187页，2024年2月25日，星期天受精卵的发育过程第115页,共187页，2024年2月25日，星期天第116页,共187页，2024年2月25日，星期天动物体外受精程序

精子采集超数排卵假孕动物准备

精子获能卵子采集胚胎移植

体外受精

胚胎培养产仔第117页,共187页，2024年2月25日，星期天

2010年10月4日公布的诺贝尔生理学或医学奖，获奖者为素有“试管婴儿之父”之称的英国生理学家罗伯特·爱德华兹。由他开创的体外受精技术使400多万人得以降生。第118页,共187页，2024年2月25日，星期天英国科学家罗伯特·爱德华兹

试管婴儿之父2010年诺贝尔生理学、医学奖

第119页,共187页，2024年2月25日，星期天

1978年7月25日11时47分，世界第一位“试管婴儿”诞生了，名为路易丝·布朗。路易斯的出生再次引起了社会对“试管婴儿”的关注，很多人对“试管婴儿”的健康提出质疑，“他们的发育正常么？”“智力会不会有问题？”“这项技术是否值得推广？”而更多的压力来自伦理和社会方面，为了提高成功率，会培育多个胚胎，那么其他未被采用的胚胎又该如何对待？这种工厂化的生产方式是否会加速人口过剩？人类的后代是否可以改造？人类基因组是否也能被设计？第120页,共187页，2024年2月25日，星期天

2004年，26岁的路易斯与34岁的韦斯利·姆林德喜结连理。爱德华兹受邀参加他们的婚礼。2006年年初，路易丝以自然受孕方式怀孕，当年12月20日自然分娩产下男婴卡梅伦。不过，路易丝不是世界首名“试管婴儿妈妈”。她的妹妹纳塔莉1999年自然分娩产下一个孩子，如今育有两个孩子。第121页,共187页，2024年2月25日，星期天

我国第一个试管婴儿于1988年在北京诞生，距世界上第一个试管婴儿诞生只有10年。

第122页,共187页，2024年2月25日，星期天第四节细胞转基因技术第123页,共187页，2024年2月25日，星期天细胞转基因技术

是指人类按照自己的意愿有目的,有计划,有根据,有预见地将外源基因导入生物细胞内,通过与染色体基因组进行稳定的整合,将生物性状遗传给后代的技术。第124页,共187页，2024年2月25日，星期天

植物转基因植物转基因是把目的基因与适当的载体相连接形成重组体DNA分子,并将它导入到寄主细胞中进行增殖与表达。第125页,共187页，2024年2月25日，星期天植物转基因的主要步骤1、目的基因的获得2、目的基因与载体连接3、重组体DNA分子导入宿主细胞4、目的基因在宿主细胞中的复制与表达第126页,共187页，2024年2月25日，星期天植物细胞转基因技术的应用1、抗病虫害转基因植物2、抗逆转基因植物

(耐盐,抗冻,抗旱等)3、抗杂草转基因植物4、转基因花卉植物5、转基因植物食品6、药用转基因植物(已用于生产各种疫苗,生长因子,生长激素等)第127页,共187页，2024年2月25日，星期天

转基因技术目前在植物品种改良方面应用的主要领域有：（1）抗虫基因工程（2）抗除草剂基因工程（3）抗病基因工程（4）抗逆基因工程（5）延熟保鲜基因工程（6）品质改良基因工程（7）杂种优势利用基因工程。

第128页,共187页，2024年2月25日，星期天

目前国内外已经得到60种以上转基因植物，其中玉米、大豆、油菜、马铃薯、番茄和棉花等，已经大面积种植。

但国际上爆发了关于转基因植物对人体和环境是否安全的争论。食用转基因植物是否会长肿瘤？你是支持转基因还是反对转基因？理由是什么？第129页,共187页，2024年2月25日，星期天

我国农业部批准商品化生产的转基因植物共有六种，包括两种抗棉铃虫的棉花，一种耐储存的番茄，一种抗黄瓜花叶病毒的番茄，一种甜椒，和一种转花色的矮牵牛。

第130页,共187页，2024年2月25日，星期天转基因动物指用人工方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞,使外源基因与动物本身的基因组整合,并随细胞的分裂而增殖,从而将外源基因稳定的遗传给下一代的工程化动物。第131页,共187页，2024年2月25日，星期天动物细胞转基因技术的应用动物细胞转基因技术在生物学基础研究、医学、农业及生物工程等领域的应用，已取得相当的成果。1．研究基因的结构和功能及其表达与调控

第132页,共187页，2024年2月25日，星期天2．建立人类疾病动物模型，研究人类疾病基因治疗传统的药物筛选方法是进行动物实验和体内实验，而传统的动物模型一般选取与人类某种疾病有类似症状的动物，其致病机理常与人体不完全一致，导致筛选结果与临床结果不一致。利用转基因技术可建立敏感动物品系和产生与人类相同疾病的动物模型来进行药物筛选，大大提高了准确性，缩短了试验时间，降低成本。第133页,共187页，2024年2月25日，星期天3．改良动物品种

转基因乳牛可产出营养成分更加丰富合理，生理生化特性更优良的牛奶。转基因绵羊长出的羊毛光泽亮丽，羊毛脂含量明显提高。第134页,共187页，2024年2月25日，星期天

4.提高动物繁育速度导入生长激素的动物表现出生长周期缩短，体形增大等特点。现已有成功的转基因小鼠，转基因鱼及经济动物如牛，兔，马等。第135页,共187页，2024年2月25日，星期天5．研制生物反应器，生产天然活性药物蛋白利用转基因动物作为生物反应器生产人类蛋白质药物，其质量大大优于通过微生物发酵获得的产品，并且生产成本可大大降低。转基因动物生物反应器主要包括动物乳腺生物反应器(生物活性蛋白)和动物血液生物反应器(非生物活性的融合蛋白)等。第136页,共187页，2024年2月25日，星期天问题和展望转基因表达水平低难以控制转基因在宿主基因组中的行为对基因作用缺乏深入了解制作转基因动物的效率低对传统伦理的挑战对于人类的生存存在一定的负面影响第137页,共187页，2024年2月25日，星期天转基因动物第138页,共187页，2024年2月25日，星期天转基因鼠1999年，美国普林斯顿大学的科学家曾经培育出一种转基因“聪明鼠”，它们脑部的NMDA受体较多，该受体能够激活神经，帮助记忆。实验表明，这种转基因鼠学习躲避轻度电击的能力比普通鼠要强。第139页,共187页，2024年2月25日，星期天转基因猴

这只名为“安迪”的转基因猴于2000年10月2日诞生。添加在“安迪”体内的是一种绿色荧光蛋白（GFP）标志基因。如果动物体内含有这种蛋白，在受到特定波长的光照射时，就会出现特定的荧光。第140页,共187页，2024年2月25日，星期天转基因鱼

2001年5月，新加坡国大生物系宫知远博士把来自水母的绿荧光蛋白基因和海葵的红荧光蛋白基因，注射入斑马鱼的早期胚胎。根据注射的不同基因，斑马鱼会在特别的光照下发出不同的光芒。第141页,共187页，2024年2月25日，星期天转基因蝴蝶

为了能够更有效地研究蝴蝶翅膀的颜色之迷，美国巴法罗大学的生物学家们近日成功地制造出世界上第一只转基因蝴蝶。有意思的是，这只蝴蝶的一些基因是来自水母的。

第142页,共187页，2024年2月25日，星期天转基因猕猴和普通猕猴外观上没有什么区别，在特殊光源下，转基因猕猴通体呈现绿色，因为它体内的绿色荧光蛋白所致。第143页,共187页，2024年2月25日，星期天十大神奇转基因动物

2007年末，哈佛大学的杰夫-里奇曼为首的科研小组在实验鼠的基因组中导入水母的绿色荧光蛋白基因，荧光鼠脑细胞的图片传遍世界各地，这些五彩斑斓的脑细胞是单个的神经元，鲜艳的色彩帮助科学家将它们区分开来。这种绿色荧光基因对小鼠无害，只起到标记作用。

1、荧光鼠

第144页,共187页，2024年2月25日，星期天2、蜘蛛羊

这种转基因山羊是独一无二的，因为它们能产生普通的蜘蛛丝。这种构成蜘蛛网的同样物质由它们的乳腺产生。如果把很多蜘蛛丝拧成一股绳的话，它足够强韧，可制成防弹背心、降落伞绳，或者从飞机到航母等设备。蜘蛛丝还可被制成人造韧带和人造腱，支撑组织、骨骼和神经细胞，让它们在生长期间保持稳定。

第145页,共187页，2024年2月25日，星期天3、抗癌老鼠

这些老鼠内转入Par-4基因，产生的一种蛋白质能消灭肿瘤细胞，却不会伤害体内的健康组织。这种蛋白质还能抵抗乳腺癌、胰腺癌和头颈癌等。至关紧要的一点是这些老鼠没有出现任何明显的副作用。

第146页,共187页，2024年2月25日，星期天4、翡翠海参

翡翠海参看起来更像一片树叶，而不是黏滑的腹足软体动物，但它却是已知第一种在自然演化过程中发生转基因现象的物种。这种生物令很多科学家大惑不解。研究发现海参中的一种基因与水藻中具有光合作用的基因类似，这表明在过去的漫长岁月中，该基因或许通过自然进化的方式从水藻转移到海参的DNA中。第147页,共187页，2024年2月25日，星期天5、荧光鱼

2003年，美国得克萨斯的一家公司宣布，经过转基因技术他们已经研制出能发荧光的小型热带鱼——“荧光鱼”。这种“光芒四射”的红色荧光鱼，是利用转基因技术得到商标注册的第一种商业性荧光宠物鱼。改基因后的斑马鱼散发出粉红色荧光，远看像金鱼一样。目前，公司以GloFish的商标对红色荧光鱼进行了注册，这标志着转基因荧光鱼可以被当作家庭宠物出售。

第148页,共187页，2024年2月25日，星期天6.转基因蚊子

伦敦帝国学院的科研小组培育了一种转基因蚊子，其中的雄性具有荧光睾丸，很容易被识别，然后令其不育。研究者称，可以将大量这样的转基因蚊子放到野外与普通的雌蚊交配，减少疟蚊的产卵量，从而慢慢减少疟蚊的数目。这种转基因蚊子没有生育能力，所以不会将基因遗传给野生蚊子。

第149页,共187页，2024年2月25日，星期天7、超级老鼠

一种超级老鼠可以不知疲倦地奔跑数小时、寿命更长、拥有更强繁殖能力、吃得更多而不增加体重……美国科学家培育出的这种转基因老鼠震撼了世界，引起人们的遐想：培育超级老鼠的技术手段能否应用于人类，改善人类的能力？

研究者将高度活跃的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因转化的老鼠在运动时有效利用身体脂肪产生能量，同时避免产生大量乳酸。乳酸可导致肌肉痉挛，即使耐力最强的运动员也会发生肌肉痉挛。第150页,共187页，2024年2月25日，星期天8、产药的小鸡

曾培育出世界上第一只克隆羊“多利”的英国罗斯林研究所，又取得了一项重大的科学突破：该研究所的科学家成功培育出世界上第一批能下“神奇鸡蛋”的小鸡。这种经过基因改造的小鸡所下的蛋能用来制造治疗癌症和其他疾病的药物。这一重大科学突破无疑为大规模生产药物提供了非常广阔的前景。法国品种鸡名为“依沙褐壳蛋鸡”，每年可下约300颗鸡蛋。经过基因改造后的“依沙褐壳蛋鸡”，其DNA中含有人为加入的人类基因，当母鸡生下蛋后，科学家就能从鸡蛋的蛋白中提取用来制造药物的蛋白质。

第151页,共187页，2024年2月25日，星期天9、无所畏惧的老鼠

日本科学家最近通过改变老鼠的基因，培育出了一只不怕猫的老鼠。长期以来，科学家们一直认为，动物的恐惧可能是由它们灵敏的嗅觉唤起的。老鼠拥有大约1000个嗅觉感受器基因，而人类只有400个起作用的和大约800个不活跃的嗅觉感受器基因。在用老鼠所做的一项实验中，研究人员确认并移除了老鼠大脑嗅球上的某些感受器，结果这些老鼠变成了一群无所畏惧的啮齿动物，在天敌猫面前转来转去，显示出极强的好奇心，永远不知道危险的存在。

第152页,共187页，2024年2月25日，星期天10、有利于改善环境的基因猪

携带细菌基因的转基因猪可产生更清洁，污染更少的绿肥。这些基因，可帮助猪除去食物中的磷酸盐，从而有助减少猪畜牧业中产生的对农业有害的废物。

转基因猪经过遗传修饰，在唾液中产生肌醇六磷酸酶，从而可以吸收植物中的磷，而普通猪是不能消化磷的。对转基因猪产生的肥料进行分析发现，他们比普通猪的排磷量减少了75%。第153页,共187页，2024年2月25日，星期天第五节克隆技术第154页,共187页，2024年2月25日，星期天生殖克隆技术先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后，再被植入动物子宫中使动物怀孕，便可产下与提供细胞者基因相同的动物。第155页,共187页，2024年2月25日，星期天治疗克隆技术当细胞发展到囊胚阶段时，不把细胞放入子宫，而是把其中胚胎干细胞在体外诱导、分化，胚胎干细胞是能在体外分化生成各种组织和器官的原始细胞，因此可以定向发育成各种组织和器官所需的细胞。第156页,共187页，2024年2月25日，星期天两者区别生殖性克隆是“培养个体”

治疗性克隆是“定向分化”第157页,共187页，2024年2月25日，星期天应用前景：1、利用克隆技术的细胞水平治疗2、用于建立人类疾病动物模型3、复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源第158页,共187页，2024年2月25日，星期天十二生肖已经克隆过半第159页,共187页，2024年2月25日，星期天子第一只体细胞克隆鼠卡缪丽娜，1997年10月3日出生。与克隆羊多利不同的是，来自日本、英国、美国和意大利等国的科学家采用了提高克隆成功率的新技术，一下子培育出了多只克隆鼠，而且还获得了“克隆的克隆”的第二及第三代克隆鼠。体细胞克隆鼠的诞生同时也宣告此前对多利羊身份和克隆技术的质疑结束。第160页,共187页，2024年2月25日，星期天丑能都和加贺是最早的两头体细胞克隆牛，出生在1998年7月5日，其名字均源于诞生地日本石川县的地名。尽管这两头牛早产近40天，但发育正常。它们的“妈妈”分娩当天没有异常反应，但第二天早晨却食欲不振，下午就死亡。克隆牛成功的事实