制药过程与工艺课件

緒論*1.1制藥工藝學課程地位和性質*一課程性質和地位*制藥業發展與挑戰•90年1752億USD•00年4775億USD•增長大於8%全球•4496億元,年增長大於12％•制藥業集中度↑•原料藥生產大國•制藥技術和裝備整體水準低中國國外制藥工程教育1995年，NSF—新澤西州立大學Rutgers分校—制藥工程研究生教育密西根大學等高校也相繼設立制藥工程專業：TheCaliforniaStateUniversity,Fullerton;NewJerseyInstituteofTechnology;ColumbiaUniversity,NewYork;EcolePolytechniqueofMontreal;TheUniversityofLeeds;UniversityofPennsylvania;UniversityofAlabama除美國外，加拿大、英國和德國、日本和印度等國家的部分高校也已設立制藥工程教育計畫。*國內制藥工程教育*1998年中國教育部調整新設置《制藥工程》工科本科專業化學制藥生物制藥中藥制藥……制藥工程制藥工程專業與原專業的關係*制藥工程制藥工藝學、制藥分離工程、藥品品質管理工程、制藥設備等厚基礎，寬口徑，注重培養全面素質與創新能力制藥過程共性規律、技術、學科基礎、發展需求化學制藥生物制藥微生物制藥中藥制藥工業製劑生物化工二研究對象與內容*制藥工藝：從發現-藥物上市發現臨床前臨床毒理註冊生產GLPGCPGMP化學化學生物生物中藥劑型開發過程開發工業制藥工業制藥技術開發技術開發GLP—藥物非臨床研究品質管理規範GCP—藥物臨床試驗品質管理規範GMP—藥品生產品質管理規範1研究對象藥物生產過程共性規律及其應用，包括製備原理+工藝路線+品質控制重要性：“安全、有效、均勻、可控”的保證藥物產業化的橋樑與瓶頸貫穿整個藥物研發過程*2主要內容綜合應用化學系列、生物系列、機械設備與工程單元操作等課程的專門知識深化理解並掌握工藝原理，去分析和解決研發和生產過程的實際問題。從工業生產角度，改造、設計和開發藥物的生產工藝，制定相應的操作規程。*主要內容實驗室（小試）工藝中試放大工藝在車間生產若干批號後，制定生產工藝規程*制藥工藝的類別（藥物分類）化學合成藥物(syntheticdrug)布洛芬、雷尼替丁、氧氟沙星…生物合成藥物(biosyntheticdrug)重組人胰島素、重組人紅細胞生成素…中藥(traditionalchinesemedicine)速效救心丸、複方丹參滴丸…*按照典型藥物生產過程,分為4類：化學制藥工藝學生物制藥工藝學中藥制藥工藝學製劑工藝學*1.2天然提取制藥技術發展*天然提取制藥是指直接從天然材料中使用分離純化等技術製備藥物。現代藥物最初來源於植物、動物和微生物，而且以提取分離為先導。*發展歷史15～17世紀，歐洲有了金雞納、愈創木、藥喇叭根、古柯果和可哥等。

19世紀，掀起了天然提取分離藥物的熱潮，從植物中分離出純的有效化學物質。從鴉片中提取出嗎啡結晶；從吐根中分離得活性成份吐根堿。從金雞納樹皮分離得到了奎寧，成為最早用於治療瘧疾的藥物。從莨菪中提取了阿托品，從古柯葉取得了可卡因；從洋地黃葉子獲得洋地黃甙晶體。20世紀50年代後，對動物臟器的有效成分和生理活性物質的全面瞭解，生產技術提高，改變了原來的混合製劑，生產單一特異性組分的生化藥物製劑。如豬牛胰島素、前列腺酶及輔酶、激素、脂類、蛋白質和核酸及其降解產物等。生化藥物品種迅速增加，已成為一類重要的藥物。*由於合成工藝、技術等因素的限制，仍然有些氨基酸、維生素、核苷酸、酶、多糖、脂類等仍然不能合成生產，必須直接從天然材料中提取。還有一些手性藥物和半合成藥物的中間原料也必須從天然材料中直接提取。*1.3生物技術制藥發展*一相關定義生物技術藥物（biotechnologymedicine）是利用生物機體、組織、細胞，生產製造或從中分離得到的具有預防、治療和診斷功能的藥品，包括多肽、蛋白質、酶和核酸以及具有生物活性的初級代謝和次級代謝產物、天然活性化合物及其類似物。生物技術藥物（biotechnologymedicine）、生物技術產品（biotechnologyproduct）、生物技術製品（productofpharmaceuticalbiotechnology）有時候也互換使用。在相關法規中，經常出現的術語是生物製品

(biologics，biologicproduct,中國、美國使用)、生物醫藥產品（biologicalmedicinalproduct，歐盟使用）。*中國生物製品規程對生物製品的定義：以微生物、寄生蟲、動物毒素、生物組織為起始材料，採用生物學工藝或分離純化技術製備，並以生物學技術和分析技術控制中間產物和成品品質製成的生物活性製劑，包括菌苗、疫苗、毒素、類毒素、免疫血清、血液製品、免疫球蛋白、抗原、抗體、變態反應原、細胞因數、激素、酶、發酵產品、單克隆抗體、DNA重組產品和體外免疫診斷製品等。分為預防用生物製品、治療用生物製品和診斷用品三類。預防用生物製品包括疫苗、菌苗和類毒素；治療用生物製品包括抗血清與抗毒素、血液製品、細胞因數與抗體；診斷用品包括細菌學試劑、免疫試劑、臨床化學試劑。*二生物制藥的類型微生物發酵制藥採用微生物發酵生產藥物。第二次世界大戰期間誕生了以抗生素為代表的次級代謝產物的工業發酵，很快應用到其他藥物的發酵生產，如氨基酸、維生素、甾體激素等。微生物藥物主要為抗生素(antibiotic)、氨基酸(aminoacid)、維生素(vitamin)、核苷酸和核苷(nucleotide,nucleoside)、酶(enzyme)、酶抑制劑(enzymeinhibitor)、免疫調節劑(immunomodulator)和受體拮抗劑(receptorantagonist)等。酶工程技術制藥酶工程技術在制藥工業上的主要應用是（1）生物酶用於製備手性藥物；（2）生物轉化，給已有藥物添加基團，增加藥效和功能。*細胞培養技術制藥動植物細胞培養(cellculture)是在離體條件下人工培養基上培養動植物細胞，使之生長繁殖併發育。主要應用於生產人畜病毒疫苗、單克隆抗體、重組基因工程產品等。基因工程技術制藥基因工程（geneengineering）制藥是在體外通過重組DNA技術，對生物的遺傳物質基因進行剪切、拼接、重新組合，與適宜的載體連接，構成完整的基因表達系統，然後導入宿主生物細胞內，與原有遺傳物質整合或以質粒形式單獨在細胞中繁殖，並表達活性蛋白質、多肽或核酸等藥物。通過基因工程改造微生物細胞的代謝過程，還可提高抗生素、維生素、氨基酸、核酸、輔酶、甾體激素等藥物的生產能力。*三、生物藥物的用途1作為治療藥物按藥理作用主要有以下：內分泌障礙治療劑：胰島素、生長素、甲狀腺素等。維生素類藥物：主要起營養作用，用於維生素缺乏症。中樞神經系統藥物：L－多巴，人工牛黃、腦啡肽。血液及造血系統藥物：常見的有抗貧血藥（血紅素）、抗凝藥（肝素）、纖溶劑－抗血栓藥（尿激酶）等。呼吸系統藥物：平喘藥（PGE、腎上腺素）、祛痰劑（乙醯半胱氨酸）、鎮咳藥（蛇膽、雞膽）。心血管系統藥物：抗高血壓藥（激肽釋放酶）、降血脂藥（彈性蛋白酶，豬去氧膽酸）、冠心病防治藥（硫酸軟骨素A）*消化系統藥物：助消化藥（多酶片）、潰瘍抑制劑（胃膜素、維生素U）、止瀉藥（鞣酸蛋白）。抗病毒藥物：抑制病毒核酸的合成，如碘苷抑制病毒合成酶，如阿糖腺苷調節免疫功能，如干擾素抗腫瘤藥物：主要有核酸類抗代謝物（阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶）、抗癌天然大分子（天冬醯胺酶，香菇多糖PSK，灰樹花多糖）、提高免疫力抗癌劑（白介素－2,干擾素）抗輻射藥物：如超氧歧化酶（SOD）計劃生育用藥：口服避孕藥（複方炔諾酮）生物製品類治療藥：各種免疫蛋白、抗毒素、抗血清（蛇毒抗血清）。*2作為預防藥物常見的預防藥物有菌苗、疫苗、類毒素及冠心病防治藥物。3作為診斷藥物（1）免疫診斷試劑利用高度特異性和敏感性的抗原機體反應，檢測樣品中有無相應的抗原或抗體，可作為臨床診斷的依據。主要有診斷抗原和診斷血清。診斷抗原：細菌類，如傷寒病毒類，如SARS，乙肝病毒毒素類，如鏈球菌溶血素O*

診斷血清：細菌類病毒類腫瘤類抗毒素類激素類血型及人類白細胞抗原診斷血清其他（2）酶診斷試劑利用酶反應的專一性和快速靈敏的特點，定量測定體液內的某一成分變化作為病情診斷的參考。目前有40餘種酶診斷試劑盒。*（3）器官功能診斷藥物利用某些藥物對器官功能的刺激作用，排泄速度等已檢查器官的功能損害程度。如甘露醇等。（4）放射性核素診斷藥物放射性核素診斷藥物有聚集於不同組織或器官的特性，故加入體內後，可檢測其在體內的吸收、分佈、轉運、利用及排泄等情況，從而顯示器官功能及其形態，以供疾病的診斷。（5）診斷用單克隆抗體（McAb）McAb的特點之一是專一性強，一個B細胞所產生的抗體只針對抗原分子上的一個特定抗原決定族。*（四）用作其他生物醫藥用品生化試劑如細胞培養基、電泳試劑等生物醫學材料手術縫合線、人造骨頭等。營養保健品和美容化妝品*1.4化學合成制藥技術發展*全合成制藥磺胺嘧啶、阿司匹林…半合成制藥多烯紫杉醇、頭孢類抗生素…手性制藥阿托伐他汀、阿奇黴素…*化學制藥工藝的要求最安全：易燃易爆、有毒的原料與中間體最經濟：成本最低最便捷：工藝路線最短，最簡，易於組織生產綠色工藝：三廢，廢水、氣、渣*1.5制藥工業的發展*一全球制藥工業的發展制藥工業（pharmaceuticalindustry）的歷史大約70多年，但一開始就發展很快，目前全世界制藥企業超過10000家，生產製造5000多種藥物，其中約100家為跨國公司。20世紀初所用藥物只有四種：洋地黃用於治療各種心血管疾病，奎寧用於治療瘧疾，吐根屬植物提取物（活性成分為生物堿）用於治療痢疾，水銀用於治療梅毒，但當時缺乏安全性和有效性。20世紀70年代以後，出現現代生物技術制藥公司。目前，全世界生物技術公司4400多家，主要集中在歐美，美國1444家，歐洲1815家，加拿大472家，亞太地區685家。年產值超過10億美元的生物技術公司有20餘家。*世界制藥行業具有以下特徵並購風雲不斷，重組形成更大集團，強強聯合優勢互補，戰略性驅動，企業經營的專業化，企業間的合作。並購數量增加，藥品生產的集中度不斷提高。研發費用持續上升，投入繼續增大，國際10大制藥公司的年均投入占銷售額的16％左右。1個新藥的研發費用約8－10億美元，但新藥批准上市的數目在下降。研發的難度越來越大，新產品是行業的希望。重磅炸彈藥物數目持續增加，從1995年到2004年，增長了近4倍。跨國公司更多依賴於重磅炸彈藥物，是企業的主要利潤來源。生物技術藥物異軍突起。20世紀80年代以前是治療性藥物，20世紀90年代是改善生命品質的藥物，而進入21世紀，將是靶向的蛋白質、多肽和核酸類治療性藥物。*二我國制藥工業發展中國制藥工業的發展經歷了從藥店到廠房，再到現代化企業和集團的過程。20世紀20～30年代，上海、廣州是我國近代制藥工業的發祥地，但制藥工業十分落後。1949年新中國成立初期，重視醫藥工業的發展，確定了“以發展原料藥為主”的方針。同時，積極發展藥物製劑生產。1951年試製出第一批結晶青黴素，1958年，以生產抗生素為主的華北制藥廠建成投產；至1959年，中國建立起化學制藥工業。20世紀80年代後，走上了按正規制藥工業管理和發展的道路。*1.6制藥技術展望*制藥行業是一個集約化、國際化程度極高的產業。國外公司在中國設立研發機構，並把生產製造中心向中國轉移。“十一五”時期乃至更長時間我國醫藥市場需求將繼續保持旺盛勢頭。中國醫藥市場今後5年內將以15％～20％的速度發展，到2010年將達到240億美元，成為繼美國、日本、德國和法國之後的世界第5大醫藥市場，2020年將達到1200億美元，超過美國成為全球第一大市場。從制藥業各子行業看，未來5～10年期間，我國醫藥市場將繼續保持以化學藥為主，生物技術制藥已經成為制藥行業的新領域，天然提取制藥有很大發展空間。主要途徑為：創新藥物研究、抗體工程制藥技術、制藥工藝新技術及其改造。*創新藥物研究加大制藥的科研開發投入，研究並擁有自主知識產權的藥物和技術。我國現有常用西藥4000多種，其中97％屬於仿製國外產品或進口藥。採用組合生物化學、生物分子晶片、細胞組織和動物模型等高通量的方法篩選天然藥物，發現新型治療藥物。利用人類基因組和蛋白質組以及病原生物體的基因組的最新成果，電腦技術，把生物資訊學、分子生物學、基礎醫藥學、藥物化學、藥理學等的技術綜合起來，通過突變、生物展示、嵌合、質譜分析等，進行新型藥物的輔助設計和藥物篩選，獲得創新性藥物。通過基因工程技術，改變重組蛋白類藥物的結構，從而增強活性，延長體內的半衰期。利用生物分子修飾化學藥物。如利用人白蛋白製成的納米顆粒結合紫杉醇注射製劑，代替傳統的紫杉醇製劑可避免過敏反應，加強了紫杉醇的臨床效果和安全性。*抗體工程制藥技術FDA批准上市的生物藥物中，抗體類藥物所占比例越來越大，2004年有11個，3個為全新藥物，其他為新適應症。抗體類藥物一上市就成為年銷售額逾億美元的重磅炸彈藥(blockbusterdrug)。基於單克隆抗體的治療劑主要的應用領域是癌症，上市的抗體藥物一半都在營利。預計單抗藥物的全球銷售額將從2004年的50多億美元增至2010年的150億美元，平均年增長30%。*制藥工藝新技術及其改造應用現代科學技術改造我國傳統的醫藥工業，使我國制藥行業的經濟實現由速度型向效益型、由粗放型向集約型的根本轉變，用先進的製造技術進行藥物生產。研究適用於大規模藥物生產的動植物和微生物表達系統，提高藥物生產效率的新途徑。大力開發手性藥物及外消旋藥物的手性轉化。加強環境保護與品質意識。*

微生物發酵制藥工藝2.1微生物發酵與制藥*一發酵概念發酵概念：通過微生物培養而獲得產物的過程。發酵種類：用產品說明，冠以產物名而成，如青黴素發酵，維生素發酵；發酵工程按需氧分為好氧發酵和厭氧發酵。初級代謝產物：在初級代謝過程中形成的產物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質、脂肪、核酸等。生長所必須的。幾乎所有生物初級代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機酸。次級代謝產物：比較複雜的化合物，不是細胞生長必需的，對生命活動有意義（抗逆境條件）。抗生素，毒素，色素。*發酵制藥種類微生物菌體發酵微生物菌體發酵是以獲得微生物菌體為目的，如：麵包的酵母發酵、單細胞蛋白發酵（利用各種碳源）、真菌類（各種蘑菇、冬蟲夏草）、生物防治劑（蘇雲金桿菌，伴孢晶體可以毒殺鱗翅目、雙翅目害蟲）。微生物酶發酵微生物酶發酵是以獲得酶為目的的發酵，如青黴素醯化酶，用於半合成青黴素時，製備中間體6－氨基青黴烷酸。微生物代謝產物發酵初級代謝產物：氨基酸，核苷酸，維生素，有機酸。次級代謝產物：最主要的是抗生素。微生物轉化發酵利用微生物的一種或多種酶把一種化合物轉變為結構相關的更有價值的產物的生化反應為轉化發酵。*制藥微生物的種類生產藥物的天然微生物主要包括細菌、放線菌和絲狀真菌三大類。細菌主要生產環狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產生桿菌肽（bacitracin），多黏芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa）產生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。細菌還可以產生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacteriumflarum）產生谷氨酸，大小菌生產維生素C。放線菌主要產生各類抗生素，以鏈黴菌屬最多，諾卡菌屬較少，還有小單孢菌屬。生產的抗生素主要有氨基糖苷類（鏈黴素、新黴素、卡那黴素等）、四環類（四環素、金黴素、土黴素等）、放線菌素類（放線菌素D）大環內酯類（紅黴素、螺旋黴素、柱晶白黴素）和多烯大環內酯類（制黴菌素、抗滴蟲黴素等）。酸性、鹼性和中性，但以鹼性為多。真菌的曲菌屬產生桔黴素，青黴素菌屬產生青黴素和灰黃黴素等，頭孢菌屬產生頭孢黴素等。脂環芳香類或簡單的氧雜環類，多為酸性化合物。*發酵制藥的基本過程*菌種選育發酵工段提煉工段成品工段孢子製備種子製備發酵控制預處理分離提取濃縮純化成品工段包裝原料藥實驗室、種子庫發酵車間提煉車間包裝車間2.3制藥微生物菌種的建立*新藥生產菌的選育自然分離自然選育誘變育種雜交育種基因工程技術育種基因組shuffling技術*2.8抗生素生產工藝*以青黴素為例一概述－發現1929:Fleming在葡萄球菌培養皿中，污染的黴菌周圍出現透明的抑菌圈。殺菌物質，斷言太不穩定，無法分離並用作藥物。

1939：牛津病理家HowardFlorey化學家ErnstChain,NormanHeatley。發酵瓶培養黴菌，培養裏提取，測活性，青黴素結晶。*發展1940：8只鼠注射鏈球菌，提取物對4只治療。未經治療鼠在24小時內死亡，治療鼠存活數天至數周。1941年2月開始治療第一批人類病人。1943：威斯康辛大學小組，取得突破生產菌表面培養：幾十個單位。深層培養產黃青黴：100U/ml。X、UV誘變育種：1000－1500U/ml。不產色素變種：66000－70000U/ml目前：85000U/ml。*概述－作用機理細胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段肽多糖的D-丙氨醯-D-丙氨酸二肽類似物競爭性與轉肽酶結合，使轉肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯。生長中的細胞有效，靜止細胞無效高效、安全的抗細菌感染藥物*概述－應用臨床抗感染治療：大多數革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性細菌及螺旋體等。毒性小，但需要皮試。各種半合成抗生素的原料：氨苄青黴素，磺苄青黴素，乙氧萘青黴素頭孢菌素母核。*二青黴素生產菌的生物學特性產黃青黴：Penicilliumchrosogenum孢子:綠色和黃色菌落：平坦或皺褶，圓形。*青黴穗:分生孢子鏈狀深層培養菌絲：球狀和絲狀兩種。發酵條件下的生長過程第1期：分生孢子萌發，形成芽管，原生質未分化，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，原生質體具有嗜鹼性，類脂肪小顆粒。第3期：形成脂肪包涵體，機理貯藏物，沒有空泡，嗜鹼性很強。第4期：脂肪包涵體形成小滴並減少，中小空泡，原生質體嗜鹼性減弱，開始產生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲呈桶狀，脂肪包涵體消失，青黴素產量最高。第6期：出現個別自溶細胞，細胞內無顆粒，仍然桶狀。釋放游離氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細胞壁。*鏡檢規定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的形態變化，控制發酵。1－4期為菌絲生長期，3期的菌體適宜為種子。4－5期為生產期，生產能力最強，通過工程措施，延長此期，獲得高產。在第六期到來之前結束發酵。*三發酵工藝過程*1生產孢子製備工斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白腖組成的固體培養基進行培養。米孢子：移植到小米或大米固體培養基上，生長7天，25℃。注意：每批孢子必需進行嚴格搖瓶試驗，測定效價及雜菌情況。*2種子罐培養工藝一級種子發酵：發芽罐，孢子萌發，形成菌絲。培養基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等。空氣流量1：3（體積比）；300-350rpm；pH自然，溫度27±1℃,40h二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％培養基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，25±1℃。10-14h品質：菌絲緻密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h*3生產罐培養工藝三級罐：生產罐；接種量20％。培養基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙醯胺，CaCO3,玉米油,矽油。參數條件：通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小時:pH6.4-6.6，26℃；60小時後:pH6.7,24℃。*4發酵培養與過程控制操作方式：反復分批式發酵。發酵罐：100M3，裝料80M3。帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。發酵週期：180-220h。*（1）過程控制——補料分批操作控制基質濃度前40小時：培養基中的主要營養物40小時後：低速連續補加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。半饑餓狀態：延長合成期，提高產量。碳源占成本12％以上，採用糖化液流加,降低成本。糖與6APA結合形成糖基-6APA，影響青黴素產量。*流加碳源控制根據殘糖、pH、尾氣中CO2和O2含量。葡萄糖的波動範圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停止，過高則導致呼吸活性下降，甚至引起自溶。殘糖0.3-0.6％左右，pH開始升高時流加糖。濃度：500kg/m3，流速:1.0-2.5kg/m3·h。*流加氮源控制玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。補加無機氮源：硫酸銨、氨水、尿素。氨基氮濃度：0.01-0.05%。*鹽離子控制無機鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵對青黴素合成有毒，30-40ug/ml以下。罐壁塗環氧樹脂保護層。*（2）添加青黴素側鏈前體時期：合成階段。種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙醯胺、苯乙胺、苯乙醯甘氨酸。毒性：抑制細胞生長和青黴素合成。策略：低濃度流加。濃度：苯乙酸0.1%，苯乙醯胺0.05-0.08%。控制：保持供應速率略大於生物合成需要。*提高產量的其他物質流加表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他：剪切保護劑；分散劑*（3）溫度控制適宜菌絲生長溫度30℃，分泌青黴素20℃。20℃青黴素破壞少，週期很長。變溫控制，不同階段不同溫度。生長階段:較高溫度，縮短生長時間；生產階段適當降低溫度，以利於青黴素合成。前期控制26℃左右，後期降溫控制24℃。*（4）pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過7.0直接加酸或堿：自動控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。pH下降：補加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補加糖、生理酸性物質（硫酸銨、油脂）*（5）溶氧控制＜30％飽和度，產率急劇下降；＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧。調整攪拌轉速:各階段的生長和耗氧量不同。*（6）消沫天然油脂：玉米油；化學消沫劑：泡敵。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。*四提煉工藝過程青黴素不穩定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩定，非極性溶劑中穩定易溶於有機溶劑，水中溶解度很小青黴素鹽很穩定；降解產物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速。*1預處理青黴素的存在部位：發酵液。濃度較低：10－30kg/m3。含有大量雜質：菌體細胞、核酸、雜蛋白質、細胞壁多糖等、殘留的培養基、色素、鹽離子、代謝產物等。目的：濃縮目的產物，去除大部分雜質，改變發酵液的流變學特徵，利於後續的分離純化過程。預處理:發酵液加少量絮凝劑沉澱蛋白。*2過濾鼓式真空過濾機過濾：一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質含量0.5-2.0%。板框式過濾機過濾：硫酸調節pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%矽藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用於提取（收率90％）*3、溶劑萃取原理：青黴素游離酸易溶於有機溶劑，而黴素鹽易溶於水。萃取劑：青黴素分配係數高的有機溶劑。工業上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質：加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃取：2－3次。*逆流萃取過程正相萃取：酸化pH1.8-2.0，濾液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式離心機分離（濃縮1.5-2.1）反相萃取：pH6.8-7.4（磷酸鹽、碳酸鹽緩衝液）。把青黴素從丁酯中提取到緩衝液中。反復萃取2－3次，達到結晶要求。萃取條件：10℃下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。*4脫色萃取液中添加活性炭，除去色素。過濾，除去活性炭。*5結晶——直接結晶加醋酸鈉－乙醇溶液反應：得到結晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液：得到青黴素鉀鹽。*5結晶——共沸蒸餾結晶萃取液，再用0.5MNaOH萃取pH6.4-6.8下得到鈉鹽水濃縮液。加3-4倍體積丁醇，16-26℃，真空0.67-1.3KPa）下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結晶析出。結晶經過洗滌、乾燥（60℃真空16h），磨粉，裝桶，得到青黴素產品。*2.9氨基酸發酵生產工藝*一氨基酸類藥物得基本概念*α氨基酸氨基酸及其衍生物在醫藥中的應用氨基酸的營養價值及其與疾病治療的關係必需氨基酸—人和哺乳動物自身不能合成，需要由食物供應，稱為必需氨基酸。賴氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸等8種。治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸及其鹽酸鹽，穀氨醯胺，乙醯穀醯胺鋁，甘氨酸及其鋁鹽，硫酸甘氨酸鐵，維生素U及組氨酸鹽酸鹽等。治療肝病的氨基酸及其衍生物精氨酸鹽酸鹽，磷葡精氨酸，鳥天氨酸，谷氨酸鈉，蛋氨酸，乙醯蛋氨酸，瓜氨酸，賴氨酸鹽酸鹽，及天冬氨酸等。*治療腦及神經系統疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸鈣鹽及鎂鹽，氫溴酸谷氨酸，色氨酸，5－羥色氨酸、左旋多巴等。用於腫瘤治療的氨基酸及其衍生物偶氮絲氨酸，氯苯丙氨酸，磷天冬氨酸及重氮氧代正亮氨酸等。其他氨基酸類藥物的臨床應用*二氨基酸類藥物的生產方法1發酵法2水解法3酶法轉化*1發酵法L－異亮氨酸的製備*培養液滅菌滅菌培養液菌種培養接種發酵發酵液過濾上層液酸化濾液離子交換洗脫液減壓蒸餾濃縮液活性炭脫色濾液減壓濃縮濃縮液氨水中和沉澱水結晶乾燥L－異亮氨酸成品工藝過程1）菌種培養種子培養基組成（％）為：葡萄糖2，尿素0.3，玉米漿2.5，豆餅水解液0.1，pH6.5。二級種子培養基加菜籽油，其餘同一級種子培養基。一級種子培養：1000ml三角燒瓶中培養基裝量為200ml，接種一環牛肉膏斜面AS1.998菌種，搖床30℃16h。二級種子培養：接種量3.5％，培養8h。逐級放大。2）滅菌、發酵發酵培養液組成（％）：硫酸銨4.5，豆餅水解液0.4，玉米漿2.0，碳酸鈣4.5，pH7.2，澱粉水解還原糖粗糖濃度11.5。滅菌，接種1％菌種（v/v），攪拌，發酵。*3）除菌體，酸化發酵結束後，發酵液加熱至100℃並維持10min，冷卻過濾，濾液加工業硫酸和草酸至pH3.5，過濾除沉澱。4）離子交換、吸附分離上述濾液每分鐘以樹脂量1.5％的流速進H＋型732離子交換柱（φ40×100cm),以100L去離子水洗柱，再以60℃,0.5mol/L氨水按3L/min的流速進行洗脫。分部收集洗脫液。5）濃縮趕氨6）脫色、濃縮、中和7）精製，烘乾*1水解法（一）基本原理蛋白質水解方法酸水解法、堿水解法、酶水解法氨基酸分離方法溶解度法、特殊試劑沉澱法、吸附法、離子交換法氨基酸精製方法結晶，重結晶*水解法舉例L－胱氨酸的製備：*人發或豬毛水解液L－半胱氨酸粗品濾液L－半胱氨酸粗品濾液L－半胱氨酸鹽酸水解氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭中和，氨水3酶法轉化*延胡索酸＋NH3固定化天冬氨酸酶轉化轉化液L－Asp粗品分離L-Asp精品轉化液固定化L－Asp－β－脫羧酶濃縮結晶L－Ala粗品L－Ala精品精製天冬氨酸和丙氨酸的製備工藝過程1）菌種培養大腸桿菌（E.coli）AS1.881的培養斜面培養基為普通肉汁培養基搖瓶培養基成分（％）：玉米漿7.5，反丁烯二酸2.0，硫酸鎂（7水）0.02，氨水調pH6.0，煮沸後過濾，500ml三角燒瓶中裝液量50-100ml。從新鮮斜面上或液體中培養種子，接種子於搖瓶培養基中，37℃振搖培養24h，逐級擴大培養至1000～2000ml規模。培養結束後用1mol/LHCl調pH5.0，升溫至45℃並保溫1h，冷卻至室溫，離心收集菌體。德阿昆哈假單胞（Pseudomonasdacunhae）68變異株的培養斜面培養基組成（％）為蛋白腖0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaCl0.5，pH7.0，瓊脂2.0。種子培養基與斜面培養基，不加瓊脂，250ml三角燒瓶中培養基裝量40ml。搖瓶培養基組成（％）為L－谷氨酸3.0，蛋白腖，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氫鉀0.05，MgSO4.7H2O0.01，用氨水調pH7.2，500ml三角燒瓶中培養基裝量為80ml。將培養24h的新鮮斜面菌種接種於種子培養基中，30℃振搖培養8h，再接種於搖瓶培養基中，30℃振搖培養24h，逐級放大。*2）細胞固定化Ecoli的細胞固定化取濕菌體20kg，懸浮於生理鹽水中，保溫至40℃，再加入90L保溫至40℃的12％明膠溶液及10L1.0％戊二醛溶液，充分攪拌均勻，放置冷卻凝固，再浸入0.25％戊二醛溶液中。於5℃過夜後，切成3～5mm的立體小方塊，浸入0.25％戊二醛溶液5℃過夜，蒸餾水充分洗滌，濾幹得含天冬氨酸酶得固定化。假單胞菌體固定取濕菌體20kg，加生理鹽水攪拌至稀釋至40L，另取溶於生理鹽水的5％角叉菜膠溶液85L，兩液均保溫至45℃後混合，冷卻至5℃成膠。浸於600L2％KCl和0.2mol/L已二胺的0.5mol/LpH7.0的磷酸緩衝液中，5℃下攪拌10min，加戊二醛至0.6mol/L濃度，5℃攪拌30min，取出切成3～5mm的立體方塊，用2％KCl溶液充分洗滌後，濾去洗滌液，即得固定化脫羧細胞。*3）生物反應堆的製備4）轉化反應5）產品純化與精製*4化學合成法L－脯氨酸**L－谷氨酸＋乙醇硫酸三乙胺L－谷氨酸－γ－乙酯KBH4還原L－Pro反應液五氯酚沉澱氨水解析濾液活性炭濾液乙醚固形物精製L－脯氨酸成品2.10維生素生產工藝*一概述維生素是一類生物生長發育起調節作用的、化學結構不同的、小分子有機化合物，人體內不能合成，必須從食物等中攝取。人體需求量很少，但不足時，出現相應的缺乏症。已知維生素13種，根據溶解性，一般分為水溶性和脂溶性維生素兩類。主要維生素的生產有三種方法。2002年我國維生素原料產量達8.2萬噸，其中維生素C超過5萬噸，成為世界上最大的原料藥生產國和出口國。維生素製劑年產量260－280億支/片/瓶，以片劑、注射液和膠囊為主。*2維生素C生產工藝目前，工業上生產維生素C採用二步發酵法，此法是在1975年由中國科學院上海生物技術研究所研究出來的，屬我國首創。發酵法生產維生素C可以分為發酵、提取和轉化三大步驟。即先從D-山梨醇發酵，提取出維生素C前體2-酮基-L-古龍酸，再用化學法轉化為維生素C。第一步發酵黑醋酸菌（Acetobactersuboxydans）經種子擴大培養，接入發酵罐，種子和發酵培養基主要包括山梨醇、玉米漿、酵母膏、碳酸鈣等成份，pH5.0~5.2。醇濃度控制在24~27%，培養溫度29~30℃，發酵結束後，發酵液經低溫滅菌，移入第二步發酵罐作原料。D-山梨醇轉化L-山梨糖的生物轉化率達98%以上。*第二步發酵氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans，小菌)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium，大菌)混合培養。生產維生素C的發酵罐均在100m3以上，瘦長型，無機械攪拌，採用氣升式攪拌。種子和發酵培養基的成份類似,主要有L-山梨糖、玉米漿、尿素、碳酸鈣、磷酸二氫鉀等，pH值為7.0。大、小菌經二級種子擴大培養，接入含有第一步發酵液的發酵罐中，29~30℃下通入大量無菌空氣攪拌，培養72h左右結束發酵，L-山梨糖生成2-酮基-L-古龍酸的轉化率可達70~85%。

2-酮基-L-古龍酸的分離提純經二步發酵法兩次發酵以後，發酵液中僅含8%左右的2-酮基-L-古龍酸，且殘留菌絲體、蛋白質和懸浮的固體顆粒等雜質，常採用加熱沉澱法、化學凝聚法、超濾法分離提純。傳統工藝是加熱沉澱法，發酵液經靜置沉降後通過732氫型離子交換樹脂柱，調節pH至蛋白質等電點，並加熱使蛋白質凝固，然後用高速離心機分離出菌絲、蛋白和微粒，清液再次通過陽離子交換柱，酸化為2-酮基-L-古龍酸的水溶液，濃縮結晶後得到2-酮基-L-古龍酸。*2-酮基-L-古龍酸的化學轉化將維生素C前體2-酮基-L-古龍酸轉化為維生素C，常採用堿轉化法。2-酮基-L-古龍酸在甲醇中用濃硫酸催化酯化生成2-酮基-L-古龍酸甲酯，加NaHCO3轉化生成維生素C鈉鹽，經氫型離子交換樹脂酸化得到維生素C。粗品經結晶精製得維生素C成品。*3維生素B2生產工藝維生素B2（vitaminB2）又稱核黃素(riboflavin)，國內約有l0家核黃素生產商。目前國內外廣泛採用微生物發酵法工業生產維生素B2。能夠產生維生素B2

的微生物有細菌、真菌和黴菌，工業生產中主要以阿舒假囊酵母(Eremothereciumashbyii)為生產菌種。維生素B2

的工業發酵一般為二級發酵，發酵液先沉澱再氧化進行分離提純。*發酵培養基中以植物油、葡萄糖、糖蜜或大米等作為主要碳源，植物油中以豆油對維生素B2產量的促進效果最為顯著,有機氮源以蛋白腖、骨膠、魚粉、玉米漿為主，無機鹽有NaCl、K2HPO4、MgSO4。種子擴大培養和發酵的通氣量要求均比較高，通氣比一般在1.0，罐壓0.05MPa左右，攪拌功率要求比較高。阿舒假囊酵母的最適生長溫度在28~30℃，種子培養34~38h後接入發酵罐，發酵培養40h後開始連續流加補糖，發酵液的pH值控制在5.4~6.2,發酵週期為150~160h。維生素B2的產量在50g/L左右。維生素B2的分離提取與純化發酵液酸化後加熱,然後加入黃血鹽、硫酸鋅沉澱蛋白，過濾後濾液調pH1.5~2.0酸化，靜置20~40h沉澱，壓濾後將沉澱物酸溶，加入硝酸銨，氧化抽提，氧化液經結晶、過濾後，濕晶在80℃以下乾燥20h，得到維生素B2成品。*

基因工程制藥工藝3.1基因工程制藥微生物表達系統*基因工程菌：微生物為操作對象，通過基因工程技術獲得的表達外源基因或過量或抑制表達自身基因的工程生物體。種類：細菌和酵母是重要的表達重組藥物的制藥生物。*一大腸桿菌表達系統1大腸桿菌（Eschericliacoli）形態特徵*細胞：G－，單細胞，杆狀。鞭毛，無芽孢，一般無莢膜。裂殖。菌落:白色至黃白色，光滑，直徑2－3mm。2生化與遺傳特性能在僅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的無機鹽的極限培養基上生長，發酵糖，產氣產酸。基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。基因組：4.6Mb，3000多種蛋白質。染色體DNA為環狀雙鏈，核外遺傳物質為質粒。*3質粒載體*複製起始點選擇標記多克隆位點質粒類型嚴緊型質粒：在每個宿主細胞只能複製少數幾個拷貝的質粒，pSC101；鬆弛型質粒：在每個細胞中能複製幾十至幾百個拷貝數的質粒，pMB1和colE1；克隆質粒：用於克隆和擴增外源基因；測序質粒：用於基因測序；整合質粒：用於外源基因與宿主染色體整合；穿梭質粒：能在兩種宿主細胞存在；表達質粒：能表達基因產物*4產物表達形式不溶性蛋白質：細胞質內形成包涵體；可溶性蛋白質：存在於細胞質；周質表達：外源蛋白被運輸分泌到周質，可溶性。有利於分離和減少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸；胞外分泌表達：胞內可溶性蛋白質分泌到胞外的培養液中。*5優點和不足發展最早、應用最廣泛的經典的表達系統。具有遺傳背景清楚、目標基因表達水準高（高達70％），培養週期短，抗污染能力強。不能用於加工修飾化（糖基化、醯胺化）蛋白表達。細胞死亡後，細胞壁脂多糖游離出來，形成內毒素，具有抗原性，產生熱源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反應。*6應用大量外源基因能超量的表達，18種藥物上市。多肽類2種（甲狀旁腺激素(1-34)、利尿鈉肽）激素：胰島素及2種突變體、8種生長素(1種PEG化)細胞因數類：5種干擾素α（1種PEG化）、干擾素β和γ，2種G-CSF(1種PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗劑溶栓酶類：rPA白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。*二酵母表達系統1形態特徵*細胞：單細胞真核生物，球形、橢圓形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定條件下才產生子囊孢子。菌落：乳白色，有光澤，邊沿整齊。2生長與遺傳特徵孢子萌發產生單倍體細胞，兩個性別不同的單倍體細胞結合形成二倍體接合子或營養細胞，進行芽殖。能發酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。生長繁殖迅速，倍增期約2小時。釀酒酵母有17條染色體1996年完成其全基因組測序，遺傳背景已相當清楚。基因組：120.68Mb，5887個ORF，編碼約6000個基因。*3優點與不足優點五種類型的載體，——安全、無毒。營養缺陷選擇外來質粒。培養條件簡單、大規模培養技術成熟。亞細胞器分化，進行蛋白質的翻譯後正確修飾和加工，並具有良好的蛋白質分泌能力。缺點釀酒酵母發酵產生乙醇，制約了高密度發酵。修飾的蛋白質糖基化側鏈過長，會引起副作用。*4應用1981年Hitzman等：酵母表達人干擾素激素類：6種人胰島素及1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素細胞因數：GM-CSF和血小板衍生生長因數多肽類：高血糖素2種乙肝疫苗等。8種產品*3.2基因工程大腸桿菌的構建技術*一工程菌構建流程*目標基因克隆表達載體構建遺傳轉化與篩選工程菌PCR、文庫、化學合成酶切、連接外源基因導入與培養二表達載體構建表達載體設計目標基因的定位克隆酶切反應連接反應轉化篩選與鑒定*三基因工程菌的建立過程適宜宿主菌的轉化篩選鑒定，遺傳穩定性等。目標獲得質粒能穩定遺傳、基因能高效和定向表達的載體，確保藥物的生物活性。*表達篩選與產物鑒定不同菌種的表達篩選誘導表達時間和誘導強度的篩選產物存在形式和存在場所的鑒定表達部位胞外，周質，胞內；包涵體，可溶性蛋白表達產物結構與活性鑒定電泳，SDS－PAGE，等電點電泳免疫雜交，末端測序，質譜分析分析與目標產物的同一性*3.3基因工程菌的發酵培養與控制*一培養基組成與控制碳源氮源無機鹽選擇劑誘導物*1碳源大腸桿菌：蛋白腖等蛋白質的降解物作為碳源；酵母：利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質。添加低濃度的單糖和雙糖及其他有機物如甘油等對菌體生長具有一定的促進作用。濃度稍高後就表現出底物抑制作用。葡萄糖優先利用會造成培養基的酸化。*2氮源直接很好地吸收利用銨鹽等，一般不能利用硝態氮。幾乎都能利用有機氮源。不同工程菌對氮源利用能力差異很大，具有很高的選擇性。大腸桿菌：利用大分子有機氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸為氮源*3、無機鹽磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素和鐵、銅、鋅、錳、鉬等微量元素的鹽離子形態基因工程菌生長提供必需的礦物質。*4選擇劑selectiveagent維持工程菌的純正性和質粒的穩定性的化合物。發酵培養過程中質粒容易丟失，使之成為宿主菌。為了保證質粒的穩定性、不丟失，根據質粒上的營養缺陷或選擇性標記基因，添加或缺陷選擇劑。*選擇劑種類營養缺陷互補和抗生素抗性。工程大腸桿菌：卡那黴素、氨苄青黴素、氯黴素、博來黴素等抗生素作為選擇劑；工程酵母菌：氨基酸營養缺陷型，缺陷亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸等。*5

誘導物誘導表達型工程菌：在細胞生長到一定階段，必需添加誘導物，以解除目標基因的抑制狀態，活化基因，進行轉錄和翻譯，生成產物。誘導物成為產物表達必不可少的。Lac啟動子表達系統：IPTG誘導。甲基營養型酵母：加入甲醇進行誘導。*6培養基組成對質粒穩定性的影響營養較豐富的培養基，質粒穩定性高於合成培養基；限制性基質對基因工程菌的比生長速率有不同影響；大腸桿菌對葡萄糖和磷酸鹽限制易發生質粒不穩定，有一些質粒對氮源、鉀、硫等表現不穩定；對於酵母，極限培養基比豐富培養基更有利於維持質粒穩定性；培養基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利於提高質粒穩定性。*二培養工藝與控制溫度溶解氧pH*1溫度對工程菌發酵的影響生長大腸桿菌和釀酒酵母生長最低溫度為10℃；大腸桿菌生長最適溫度為37℃，最高溫度為45℃；釀酒酵母生長最適溫度為30℃，最高溫度為40℃。生產生長與生產溫度不一致；較高溫度表達包涵體，較低溫度下有利於表達可溶性蛋白質；對於熱敏感的蛋白質，生產期可採用先高溫，然後低溫，變溫表達，避免蛋白質降解。*溫度控制兩段變溫發酵培養：前期：較高溫度發酵，獲得足夠高的菌體密度；後期：較低溫培養發酵，對菌體合成目標產物的抑制不明顯，但可有效抑制目標產物的降解和包涵體形成，總體提高工程菌的生產能力。溫度誘導型大腸桿菌表達系統：生長期維持37℃，生產期提高溫度42℃。*2pH值對發酵的影響細菌喜歡偏鹼性：大腸桿菌適宜pH為6.5～7.5，真菌喜歡微酸性：酵母適宜pH為5.0～6.0。影響產物穩定性，最適生長和最適生產pH不同。干擾素是在酸性條件下穩定，而在鹼性條件下容易降解。酸性環境有利於發揮菌株生產能力。乙酸的產生使菌體生長速率下降，也抑制基因表達。*pH控制瞭解發酵過程中各個階段的適宜pH以後，需要進一步設法控制pH在合適的範圍內。分階段控制pH：根據試驗結果來確定生長最適pH和產物最適pH，以達到最佳生產。*3溶解氧控工程菌是好氧微生物，生長過程需要大量氧。從供應量和需要量（菌體生長、質粒穩定性、產物積累）二個方面考慮，使之需氧不超過設備的供氧能力。考慮溶氧對質粒穩定性的影響通過調節攪拌轉速和通氣量來調控*三終點控制根據目標基因產物的表達模式而定。適宜的誘導時間：非常重要誘導物的濃度及其發酵溫度：影響表達量，產物存在形式在生產中應嚴格控制。*1

化學誘導表達化學誘導型啟動子：lac、tac、T7等誘導時間：對數生長期細菌：IPTG誘導甲基營養型酵母：甲醇誘導。*2溫度誘導表達溫度誘導型啟動子：PL、PR啟動子兩段培養發酵：誘導時間：菌體生長的對數期或稍後一些，升高溫度，合成產物。*3.4重組人干擾素生產工藝*一干擾素概述概念：（interferon，IFN）機體受到病毒感染時，免疫細胞產生的一組結構類似、功能接近的細胞因數功能：干擾病毒在細胞內的繁殖天然干擾素分類：I干擾素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNε、IFNω

II干擾素：IFNγ上市重組干擾素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ研發中的重組干擾素：IFNω，臨床階段*重組干擾素的臨床應用廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFNα）毛細胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調節活性——治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFNγ）多發性硬化症rhuIFNβ*干擾素生產工藝路線體外誘生干擾素製備工藝：Sendai病毒誘導人白細胞人源轉化細胞系培養生產工藝基因工程大腸桿菌假或單胞桿菌發酵生產工藝動物無限細胞系培養生產工藝*二生產過程工程菌的構建發酵過程產物分離和純化*1工程菌的構建第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達載體的構建第三步：工程菌的構建*2干擾素的發酵工藝過程*工作菌種庫藥瓶培養種子培養發酵培養菌體收集3干擾素的分離純化工藝過程(1)菌體裂解裂解緩衝液：純化水，2℃～10℃（pH7.5）；使用保護劑：EDTA，PMSF；破碎－20℃菌體：2釐米；攪拌：加裂解緩衝液，2℃～10℃，2h；凍融:細胞完全破裂，釋放干擾素。*(2)預處理加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌，對菌體碎片、DNA等進行沉澱。離心連續流離心機：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質雜質沉澱：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。*(3)初級分離鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻靜置過夜。離心：連續流離心機，16000r/min。保存：收集沉澱，粗干擾素，4℃。*(4)干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉澱與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝*

動物細胞培養制藥工藝4.1制藥動物細胞*一動物細胞的結構與功能動物細胞的結構與功能*細胞膜細胞質細胞核沒有細胞壁亞細胞器動物細胞培養的代謝特徵葡萄糖和穀氨醯氨：能量和合成代謝的前體。葡萄糖限制葡萄糖限制：通過增加穀氨醯氨消耗得以補償，反之通過增加穀氨醯氨消耗得以補償，反之亦然。葡萄糖代謝：糖酵解為主，，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外並在培養液中積累。另一條途徑為TCA迴圈，徹底氧化產生CO2和水。一小部分為戊糖磷酸途徑，生成生成4、5、7碳糖和NADPH。中間產物進入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。葡萄糖代謝旺盛，產生大量乳酸，對細胞有毒性。*Gln代謝：脫氨、轉氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。Gln氮源，Gln受限，增加其他氨基酸消耗以補償。離體動物細胞系，轉氨作用是主要代謝途徑。穀氨醯胺在脫氨酶的催化下，脫氨產生氨，對細胞有毒性。穀氨醯氨與丙酮酸發生轉氨作用，生成丙氨酸，進入培養液並積累。Gln能量：Glu轉化為α-酮戊二酸，進入TCA迴圈。流加葡萄糖或穀氨醯氨，控制整個代謝過程，避免有毒廢物的積累。*蛋白質糖基化與分泌表達蛋白質合成場所：粗糙內質網上的核糖體糖基化場所：內質網合成各種糖類，粗糙內質網腔內和高爾基體，加工修飾。不同細胞系糖基化特徵不同，選擇適宜細胞系。對於分泌型蛋白，分泌泡與細胞膜融合，釋放到胞外，完成了蛋白質的分泌表達。*二制藥動物細胞的種類目前用於制藥的動物細胞有4類：原代細胞系二倍體細胞系異倍體細胞系融合的或重組的工程細胞系*細胞系分類來源：原代細胞，傳代細胞。壽命：有限細胞系，無限細胞系。染色體數目：二倍體細胞系，異倍體細胞系。獲得方式：工程細胞系，癌變細胞系。生長特性：貼壁依賴型，非貼壁依賴型細胞系。*4.2動物細胞的生產特徵*一對培養條件要求嚴格動物細胞對周圍環境十分敏感無細胞壁保護，細胞膜直接接觸外界。物理化學因素：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力等耐受力很弱，容易受傷害。與細菌和植物細胞相比，動物細胞培養條件要求嚴格地多。*1溫度哺乳動物細胞最佳培養溫度為37℃雞細胞為39℃～40℃；昆蟲類細胞為25℃～28℃。耐受溫度範圍較窄，35℃～37℃細胞受傷：39℃～40℃1小時，但能恢復。受傷嚴重：41℃～42℃，部分可恢復。死亡：43℃以上。*2氧氣動物細胞生長必須有氧氣，缺氧時不能生存。離體培養的氣體：含有5％CO2和95％空氣，其中氧濃度為中氧濃度為21％。高氧環境：O2濃度60%以上，對細胞毒性較大，抑制生長和增殖，出現染色體異常等現象。有時充以有時充以N2氣稀釋O2濃度。*3pH值低於6.8或超過7.6會對細胞產生嚴重影響甚至使細胞死亡。機體細胞的pH範圍為6～8，而且在血液和體液中，變化範圍很小。人體：血液pH比較恒定，7.36～7.44。低於7.05發生酸中毒，高於7.45發生堿中毒。*4滲透壓正常血漿滲透壓為280～310mOsm/kg高滲溶液：高於310mOsm/kg低滲透壓溶液：低於280mOsm/kg。動物細胞對滲透壓有較強的耐受性離體培養細胞的滲透壓應控制為等滲透溶液。增減NaCl的濃度調整滲透壓，每增加1mg/mlNaCl，滲透壓增加32mOsm/kg。*二對培養基組成要求高動物細胞對培養基的要求高完全異養，容易利用、相對低分子量的營養物12中必需氨基酸8種以上維生素多種無機鹽和微量元素多種附加成分：生長類、細胞因數和貼壁因數因數及激素、結合蛋白質能源：單糖，葡萄糖，穀氨醯氨氮源：氨基酸單體化合物*三天然結構與活性的藥物完善的翻譯後蛋白質修飾功能游離核糖體：合成細胞質基質內的蛋白質。與膜結合的核糖體：合成分泌性和膜整合蛋白，多數為糖蛋白。修飾：內質網加工，高爾基體加工、轉運、分泌，糖鏈。糖基化、磷酸化、醯胺化等。活性分子：裝配折疊形成精確的三維結構。*四生產工藝特徵產品與天然的產物一致：適於臨床使用動物細胞生產：70％蛋白質藥物。培養工藝：難度大，產量低，成本高。胞外分泌產物：分離純化簡單。有潛在的血源性污染危險。*4.3動物細胞培養技術*一細胞生長和基質依賴性生長基質接觸抑制貼壁依賴性細胞非貼壁依賴性細胞兼性貼壁細胞*1生長基質概念：growthsubstratum把改變生長表面特性，促進細胞貼附的物質。胞外基質成分：多聚賴氨酸膠原*2接觸抑制概念：contactinhibition細胞在生長基質上分裂增殖，逐漸彙集成片，當每個細胞與其周圍的細胞互相接觸時，細胞就停止增殖。特點：保持充足的營養，細胞仍可存活一段時間，但細胞密度不再增加。有：大多數細胞無：少數懸浮培養細胞（癌細胞）*3貼壁依賴性細胞概念：anchoraged-dependentcell需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長的細胞。大多數動物細胞都屬於此類。*4非貼壁依賴性細胞概念：anchoraged-independentcell不依賴於固體支持物表面生長的細胞，可在培養液中懸浮生長，被稱為懸浮細胞。舉例：血液、淋巴細胞、腫瘤細胞和某些轉化細胞，Namalwa細胞。*5兼性貼壁依賴性細胞概念：對支持物的依賴性不嚴格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。舉例：CHO細胞、BHK細胞、L929細胞。理想的藥物生產細胞系。*二動物細胞培養基本過程1原代細胞分離與培養2傳代細胞培養*1原代細胞培養－過程*動物組織或器官洗滌粉碎酶解消化離心或過濾洗滌培養液稀釋細胞接種培養從體內取出組織或器官經過粉碎、消化而獲得單細胞進行體外接種培養。37℃消化，胰蛋白酶，膠原酶工作濃度：0.1-0.3mg/ml2傳代細胞培養－過程概念：對長滿表面的細胞進行消化分離，接種到新的培養基上，進行新一輪培養。傳代時期：剛剛全部匯合的細胞。消化方法：過程與原代細胞相同。傳代的次數：不能無限次傳代，保證特性。防止細胞系之間、非細胞生物的污染。要領：適宜的時期和方法，不要過度。*三動物細胞大規模培養方法1單層貼壁培養2懸浮培養3微載體培養4固定化培養*1單層貼壁培養——概念與過程細胞貼附於一定的固體支持表面上，形成單層細胞的培養過程。生長過程：接種，細胞經過吸附、接觸而貼附於基質表面；進行生長、分裂繁殖，很快進入對數期。數天就長滿整個表面，形成緻密單層細胞。*單層貼壁培養——特點優點：容易更換培養液，灌注培養時，能達到高細胞密度；有利於產物的分泌表達，可改變培養液與細胞的比例。缺點：操作較繁雜，檢測受到限制，培養條件難以均一，傳質和傳氧差，放大培養是瓶頸。*2懸浮培養細胞在反應器內游離懸浮在培養液中生長的培養過程優點：操作簡單，培養條件相對均一，傳質和傳氧較好，容易放大培養。缺點：細胞體積小，密度低，培養病毒易失去標記而降低免疫能力。適用範圍：懸浮細胞，兼性貼壁細胞，雜交瘤借鑒微生物發酵理論和經驗，發揮動物細胞的特性*3微載體培養概念：細胞貼附於微載體上伸展和增殖，再懸浮於培養液中的培養過程。優點：細胞生長的環境均一，培養基利用率高，重複性好，減少了勞動強度，容易放大。兼具貼壁和懸浮培養的雙重優點微載體，多孔微載體應用：工業化生產干擾素、疫苗和尿激酶原。*4固定化培養概念：用物理、化學方法將細胞固定在載體介質上，然後進行懸浮培養。應用：貼壁依賴性和非貼壁依賴性細胞。優點：細胞密度高、抗剪切力和污染，生產首選方法共價交聯：雙功能試劑處理，細胞之間交聯。吸附：物理吸附使細胞貼附在固體載體表面。包埋：細胞包埋在載體內部。微囊法：親水半透膜把細胞包埋在微囊內。*4.4重組人紅細胞生成素生產工藝*一概述天然紅細胞生成素的發現與種類理化性質重組人紅細胞生成素及其臨床應用重組人紅細胞生成素表達研究*1天然紅細胞生成1890：現象，低氧壓下紅細胞增多1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）。形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸組成及順序相同，166aa，活性類似。糖基化及其含量不同：EPO-α含有較多的N-乙醯葡糖胺，總含糖量比EPO-β高。*2EPO的理化性質大小：166aa糖鏈占分子量的39%。糖基化程度與準確性對活性影響很大。pI4.2～4.6，對熱和pH變化相對穩定。*3重組人紅細胞生成素第一代：兩種，rhEPO-α和rhEPO-β。1989：Amgen,Epogen；1990,OrthoBiotech,ProcritCHO、BHK細胞系生產第二代：EPO突變體，2001,Amgen,Arasnep長效。二聯體或三聯體EPO：高活性，長效（3－5倍）適應症：腎性貧血、愛滋病患者貧血、癌症相關貧血等。隔日注射一次，長效EPO：每週一次。*4rhEPO的表達研究由再生障礙性貧血患者的尿液中純化而得，人源的紅細胞生成素。產量極其有限。SV40病毒啟動子驅動表達載體，在COS-1中暫態表達紅細胞生成素昆蟲SF9細胞中杆狀病毒系統表達rhEPO。產率有所改善，但糖基化程度較小干擾素-α基因啟動子的rhEPO表達載體，BALL-1細胞，產生較高量的rhEPO。*大腸桿菌中表達，僅具有體外抗原結合活性。家蠶體內的表達系統，糖基化簡單，藥物在體內穩定性較低、活性較差等問題。在CHO、BHK細胞系統中穩定表達，獲得的重組紅細胞生成素與天然紅細胞生成素相似。現在工業生產中多採用動物細胞培養表達紅細胞生成素進行大規模生產。*二CHO培養工藝工程CHO細胞系建立種子細胞製備反應器培養工藝培養過程控制*1工程CHO細胞系*共轉染，篩選穩定表達的細胞系穩定轉染的篩選培養胰蛋白酶消化，1：5稀釋，在含有1nMMTX培養基上培養，3－4d更換培養基，培養10～14天，至性克隆出現。胰酶消化，1：5稀釋，按1nM→5nM→25nM→100nM→200nM→1000nM使MTX濃度逐次升高，篩選抗性克隆。抗性克隆培養於100mm培養皿中，按1：500稀釋，繼續培養3～5天，集落2-4mm。酶聯免疫分析：確認表達人紅細胞生成素*2種子細胞製備凍存的細胞株37℃水浴，無菌離心。加適量DMEM培養基（10%小牛血清）。37℃、CO2培養箱培養，連續傳三代。細胞消化後接種，製成接種細胞濃度。*3灌流培養反應器滅菌：加纖維素載體片及pH7.0的PBS緩衝液，高壓滅菌1.5h。接種：排出PBS緩衝液，加DMEM培養基，接種。貼壁培養：pH7，<50r/min，37℃，DO50-80%。擴增培養：80－100r/min。灌流培養：控制溫度、DO、pH值等培養條件，進行無血清培養基連續培養。收穫培養物，4℃－8℃保存。*4培養工藝過程控制攪拌控制：接種後,攪拌速度緩慢，使細胞貼附於載體上，隨著細胞數量的增加逐漸提高攪拌速度。溫度控制：較為嚴格，恒定37℃pH值控制：7.2-7.4,輸入CO2和碳酸氫鹽溶液維持其恒定。溶解氧控制：在50％-80％的範圍內，通入氧氣、空氣或氮氣的比例混合氣體。葡萄糖控制：流加補料代謝廢物控制：監測氨、乳酸鹽類等，維持較低濃度，減少對細胞損害。*三rhEPO的分離純化工藝初級分離精製純化產品品質控制*1初級分離收穫培養液：離心過濾：濾膜親和色譜：NaCl－Tris平衡，梯度洗脫，收集活性洗脫峰透析：0.1mMTris，過夜，換液4次。過濾：0.22μm濾膜。*2純化精製DEAE離子交換：NaCl-Tris梯度洗脫，收集活性峰。RP-HPLC：乙腈梯度洗脫，收集活性洗脫峰。凝膠過濾：檸檬酸鹽緩衝液洗脫，收集活性峰過濾：0.22μm濾膜。rhEPO產品：蛋白含量為1.2mg/ml，其比活可為2×105IU/mg。*3EPO的質控與活性檢測純度，蛋白質含量，分子量等體外活性：ELISA測定（原理免疫沉澱），單位unit（IU）體內活性：網織紅細胞計數法，注射BALB/c小鼠，眼眶取血，染色，塗片計數網織紅細胞數。比活性(specificactivity,U/mg)：單位重量蛋白質(mg)中所含的活性*

藥物合成工藝研究6.1概述*在設計和選擇了合理的合成路線後，就需要進行生產工藝條件研究。合成路線通常可由若干個合成工序組成，每個合成工序包含若干個化學單元反應。這些化學單元反應往往需要進行實驗室工藝研究（小試），以便優化、選擇最佳的生產條件，也為中試放大作製備。藥物的生產工藝也是各種化學單元反應與化工單元操作的有機組合與綜合應用。*現代有機合成反應特點:反應條件溫和，反應能在中性、常溫和常壓下進行；高選擇性（立體、對映體）；需要少量催化劑（1%1%）；無“三廢”或少“三廢”。*one-potreaction(一勺燴）即多個化學單元反應合併成一個合成工序的生產工藝。也稱一鍋法。後處理：包括產物的分離、精製。它是藥物工藝研究的重要組成部分，只有經過後處理才能最終得到符合品質規格的藥物。*探討藥物工藝研究中的實踐及其有關理論，需要研究反應物分子到生成物分子的變革及其過程，包括：反應過程的內因（物質的性能）反應過程的外因（反應條件）合成藥物工藝研究需要探索化學反應條件對反應物所起作用的規律性。只有對化學反應當內因和外因，以及它們之間的相互關係深入瞭解後，才能正確地將兩者統一起來考慮，才有可能獲得最佳的工藝。*新藥合成工藝研究的七個重大課題配料比參與反應當各物料相互間物質量的比例稱為配料比。通常物料以摩爾為單位，則稱為投料的摩爾比。溶劑化學反應的介質、溶劑化作用催化酸堿催化、金屬催化、相