1.2.2微生物的培养技术及应用课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

1.2微生物的培养技术及应用高压蒸汽灭菌液体培养基二微生物的选择培养与计数课题背景

自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。稀释涂布平板法呈现的杂菌群那么我们又如何达成这一目标呢？科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。阅读课本P17—18，

思考下列问题：（2分钟完成）1.实验室中微生物筛选的原理？2.选择培养基的概念？3.选择培养基的类型？4.比较选择培养基与鉴别培养基？5、选择培养基配方的设计？？？二、微生物的选择培养和计数（一）选择培养基科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶寻找目的菌种时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐高温的细菌（DNA聚合酶）保留下来。（一）选择培养基耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找那么，如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？生物与环境相适应的观点生物与环境相适应的观点筛选原因：启示：PCR(聚合酶链式反应)是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。1973年，科学家在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐高温的水生栖热菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。实例：1.实验室中微生物筛选的原理

人为提供_________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时___________________________。有利于目的菌生长抑制或阻止其他微生物的生长营养温度pH2.选择培养基的概念

在微生物学中，将允许

生长，同时

或

其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。特定种类的微生物抑制阻止3.选择培养基的类型类型条件分离得到的菌种改变培养条件70～80℃的高温添加某种化学物质加入青霉素高浓度食盐特殊碳、氮源石油是唯一碳源营养缺陷不加碳源不加氮源水生栖热菌(淘汰细菌)酵母菌、霉菌等真菌金黄色葡萄球菌石油降解菌自养型微生物固氮菌《金版》P24点拨提升培养基中加氨苄青霉素具有抗氨苄青霉素能力的菌落不添加抗生素的培养基上的菌落没有氨苄青霉素抗性基因的细菌被淘汰怎样筛选(选择)出抗氨苄青霉素能力的细菌?举例哪些菌被淘汰？项目选择培养基鉴别培养基原理加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应用途培养、分离出目标微生物鉴别目标微生物举例培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑紫色，且带有金属光泽)图示尿素分解菌大肠杆菌拓展延伸4、比较选择培养基与鉴别培养基思考-讨论5、选择培养基配方的设计尿素的立体结构尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。讨论：1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？使用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖区别：只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。《金版》P18例1、例2、例4P221牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000mlKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml培养基一培养基二讨论：1.从物理性质看两种培养基属于哪类？依据是什么？培养基的主要用途是什么？都属于固体培养基。依据是添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%-2%。培养基的主要用途是分离、鉴定、计数。2.从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？培养基二属于选择培养基；其可获得能分解尿素的微生物。3.两种培养基中共有哪些成分？碳源、氮源、无机盐、水培养基一的碳源为_______，氮源为_______；培养基二的碳源为_______，氮源为_______；牛肉膏蛋白胨葡萄糖尿素（一）选择培养基疑难突破一：选择培养基配方的设计编号①②③④⑤成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量0.4g4.0g0.5g0.5g100mL【♣典例2】据某微生物培养基的配方表回答下列问题1.此培养基按物理性质划分属于

培养基，理由是

；按功能划分属于

培养基，因为没有碳源，只有

微生物才能生长(利用空气中的CO2)。2.此培养基含有的微生物的营养成分包括

三类，若加入氨基酸，则它可充当的营养成分包括

。3.若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是

。4.若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中

成分(填表中序号)，应加入

和

的有机物。液体选择自养型水、无机盐、氮源碳源、氮源、特殊营养物质凝固剂(琼脂)①尿素不含氮元素没有凝固剂(琼脂)制备以

为唯一氮源的

培养基。尿素选择尿素选择3、制备培养基：15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNa2HPO41.4gKH2PO4碳源：氮源：葡萄糖尿素培养基的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4、鉴定方法

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入

指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将

，说明该细菌能够分解尿素。P26酚红变红CO(NH2)2脲酶+CO22NH3+H2O思考：土壤中细菌的种类和数量非常多。1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物计数：测定分解尿素的细菌的数量注意：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。无菌水、系列梯度稀释二、微生物的选择培养和计数（二）微生物的选择培养(1)选择培养基的制备(2)土壤的取样、稀释(3)接种(4)培养、观察菌落(5)计数(6)菌种鉴定1.获得能分解尿素的细菌的纯培养物的步骤(思路)？稀释涂布平板法以尿素作为唯一氮源稀释涂布平板法、显微镜直接计数法酚红指示剂恒温培养箱葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml①原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。（1）选择培养基的制备②配方：制备选择培养基（尿素为唯一氮源）制备牛肉膏蛋白胨培养基对照作用思考1：为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？①提供无机盐；②调节培养基pH。细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3-8cm的土壤层。铲去表层土，取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。（P19提示2）（2）土壤取样与稀释①土壤取样②样品的稀释测细菌数：一般用104、105、106稀释液。测放线菌：一般用103、104、105稀释液。测真菌数：一般用102、103、104稀释液。不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。BAC思考2:

在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？将稀释范围放宽一点。(即103~107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养①铲取土样，将样品装入纸袋中1ⅹ101ⅹ1071ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1041mL1mL1mL1mL1mL1ⅹ105注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。90mL无菌水1mL1）样品的梯度稀释步骤：6支试管，分别加入

9ml无菌水1克土壤≈1ml水第4支试管稀释后，共稀释的倍数是_______.105(3)稀释涂布平板法操作过程④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。2）涂布平板步骤1071061031021041mL1mL1mL1mL9mL无菌水1mL105移液枪注意：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置培养。30-37°C，恒温培养箱，1-2d一浸、二滴、三烧、四涂③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。(3)稀释涂布平板法操作过程2024/4/6原则要求：②同一稀释度下，至少涂布3个平板(重复实验)①确保菌落数在30—300之间①每个稀释浓度下，都接种3个选择培养基（此为实验组，3为重复实验）和接种1个牛肉膏蛋白胨培养基（用来判断选择培养基是否具有选择作用）；②设置2个不接种的(空白)平板：1个是不接种的选择培养基，1个是不接种的牛肉膏蛋白胨培养基（都是为了检验培养基是否含有杂菌污染）。思考：下图至少共要涂布、设置多少个平板？共涂布16个、设置18个平板(即16+2)注意事项：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。(书本P19)2）涂布平板步骤注意：设置对照组，相同条件培养对照组：如何验证是否有杂菌污染？如何验证是否具有选择（筛选）作用：设置接种的牛肉膏蛋白胨培养基（几乎所有微生物都可以生长）未接种的选择培养基、未接种的牛肉膏蛋白胨培养基3.【设置对照】不接种的培养基同时进行培养（空白平板）①判断培养基是否被污染，设置

作对照。②判断选择培养基具有筛选作用，设置

作对照。牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液

主要目的是排除实验组中非测试因素（无关变量）对实验结果的影响，提高实验结果的可信度(书P22)。注意：设置对照组一同培养对照组：验证是否有杂菌（未接种的选择培养基、未接种的牛肉膏蛋白胨培养基）验证是否具有选择（筛选）作用：设置接种的牛肉膏蛋白胨培养基（几乎所有微生物都可以生长）（4）微生物的培养与观察观察：每隔

统计一次菌落数目，选取

时的记录作为结果。防止

。结果：因培养时间不足而导致菌落数目遗漏24h菌落数目稳定细菌一般在

的温度下培养1～2d。培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。30～37℃（5）微生物的计数（下节详细学习）本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。（6）菌种鉴定（进一步探究）CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2方法：在培养基中加入酚红指示剂培养基加酚红指示剂,NH3呈碱性,PH升高,呈

红

色。——鉴别培养基①液体培养基可以直接看液体的变色情况；②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强1、选择培养基的制备2、对土壤样品进行稀释3、接种：涂布平板操作4、培养并观察菌落5、计数

土壤样品中菌落数目6、菌种鉴定课本19页探究实践，总结实验流程：方法平板划线法稀释涂布平板法纯化原理接种工具单菌落的获得用途接种效果图相同点通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的等比稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落。接种环涂布器从最后划线区挑取稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种

②都在固体培养基上进行的平板划线法vs稀释涂布平板法阅读课本P18，

思考下列问题：（3分钟完成）1.稀释涂布平板法的原理？2.稀释涂布平板法的计数原则？3.为什么统计的菌落往往比活菌的实际数目低？4.稀释涂布平板法的计算公式？

5.显微镜直接计数的原理？

6.计数板的类型？

7.显微镜直接计数的缺点？1、稀释涂布平板法2、显微镜直接计数法血细胞/细菌计数板——间接计数法——直接计数法（三）微生物的数量测定当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。①选择30-300个菌落的平板进行计数；②每个稀释度至少取3个平板取其平均值；③统计的结果一般用菌落数而不是活菌数；(2)原则(要求)因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的只是一个菌落稀释涂布平板法(该法也是接种法)（三）微生物的数量测定如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。（间接计数法，计活菌）(1)原理：(3)误差分析（为什么？）①统计的菌落往往比活菌的实际数目少（为什么？）②恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。1、计数方法1：(4)计算公式：每克（每mL）样品中的菌株数(个/克)（个/mL）=平均菌落数C÷涂布的稀释液体积V×稀释倍数M×（要计算的体积）（注：1克土壤≈1mL水）第4支试管稀释后，共稀释的倍数是_______.105三、微生物的数量测定M：代表稀释倍数；C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)间接计数法4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为________个

方法1：稀释涂布平板法③计算公式：每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M1.1×108110个÷0.1ml×105×1克实例分析1：甲同学做此实验在稀释倍数为105时，获得3个平板，菌落数分别是85、90、95，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每10克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（4）计算公式：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M×要计算的体积(1克)C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。（85+90+95）/30.1ml×105×10克=9×108（个/10克)《课时》P7

9A

每克（每mL）样品中的菌株数(个/克)（个/mL）=平均菌落数C÷涂布的稀释液体积V×稀释倍数M×（要计算的体积）。（注：1克土壤≈1mL水）平均90个×105（稀释倍数）0.1ml(涂布液体积)共X个细菌10克(约10ml）＝【例2】某同学在涂布平板时所用稀释液的体积为0.2mL，在稀释倍数为104的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为66，那么每升样品中活菌数是多少？（）A.

6.6×109

B.

3.3×109C.

6.6×108

D.33【解析】稀释倍数为104，0.2mL稀释液的菌落数的平均值为66，1升＝103mL

则每升样品中菌落数就为66/0.2×104×103mL=3.3×109。B每克（每mL）样品中的菌株数(个/克)（个/mL）=平均菌落数C÷涂布的稀释液体积V×稀释倍数M×（要计算的体积）。（注：1克土壤≈1mL水）每克（每mL）样品中的菌株数(个/克)（个/mL）=平均菌落数C×稀释倍数M

×（要计算的体积）÷涂布的稀释液体积V。（注：1克土壤≈1mL水）常用、快速、直观（优点）不能区分死菌与活菌（缺点）；统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。2、显微镜直接计数法—计数板计数法利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后计算一定体积样品中微生物的数量。(2)特点(“染色排除法”，使用台盼蓝，死细胞会被染成蓝色）（三）微生物的数量测定每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400小格×104×稀释倍数×(计算体积)（104＝要计算的体积（1mL）/计数室体积0.1mm3）

细菌计数板血细胞计数板（真菌等细胞相对较大的）（细菌等细胞相对较小的）(5)比较：显微镜直接计数法：统计的是全部微生物的数量(活+死菌)

稀释涂布平板法：只统计活菌的数量《金版》P26点拔提升3(1)原理：(4)计算公式（3误差（得到的数值比实际偏大）1、显微镜直接计数法：方法用具：缺点：例子：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；酵母菌种群数量变化血细胞计数板显微镜二.统计菌落数目计数室1mm血细胞计数板:一种专门计数较大单细胞微生物的仪器计数室（1个大方格）的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其体积为__mm3，合_________mL，(1mL=1cm3=1000mm3)。0.11×10-4计数室(1个大方格,体积0.1mm3）=25中格×16小方格

或

16中格×25小方格=400个小方格计数室1mm血细胞计数板:一种专门计数较大单细胞微生物的仪器计数室（1个大方格）的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其体积为__mm3，合_________mL，(1mL=1cm3=1000mm3)。0.11×10-4计数室(1个大方格,体积0.1mm3）=25中格×16小方格

或

16中格×25小方格=400个小方格算一算1：如果五个中格（一个计数室共25个中格）中的酵母菌数分别有38、39、40、41、42个，用来计数的培养液稀释了100倍，请估算1mL原始酵母菌培养液有酵母菌多少个？种群密度（个/mL）＝中方格中酵母菌数的平均值×25中格(或16)×104×稀释倍数x要计算的体积（1mL）（104＝要计算的体积（1mL）/计数室体积0.1mm3）40×25×104×100=1×109（个/mL)小方格计数公式：种群密度（个/mL）＝每个小方格平均细胞个数×400小格×104×稀释倍数x要计算的体积（1mL）。或者：

种群密度（个/mL）＝每个小方格平均细胞个数×400小格×要计算的体积（1mL）/0.1mm3（即

x104）

x稀释倍数

算一算2：如果每一个小格平均有酵母菌5个，用来计数的培养液稀释了100倍，请估算1mL原始酵母菌培养液有酵母菌多少个？5×400×104×100=2×109（个/mL)平均40个×25中格×100倍稀释0.1mm3(计数室体积=10-4ml)＝共X个细胞1ml两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。实例分析2：《金版》P26例5、例6、易错提醒P289、10（四）结果分析与评价①②③3小结：实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染方案：配制牛肉膏蛋白胨培养基并接种A同学所用的土样，作为对照，以证明培养基是否有选择作用。如何验证?（3）土样不同（1）培养基被污染（2）培养基混入了其他的含氮物质方案：由其他同学用与A同学相同土样进行实验资料3（四）结果分析与评价【课堂小结】一、选择培养基的成分：分解尿素细菌的分离与计数尿素作为唯一的氮源。二、鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素。三、统计菌落数目的方法（1）显微镜直接计数法（2）间接计数法（稀释涂布平板计数法）①计算公式每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M×计算的体积②操作：设置重复组，选择菌落数30～300的平板进行计数。（3）设置对照①证明培养基未被污染，用空白培养基作对照。②证明选择培养基的筛选作用：用牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液作对照。一、概念检测1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。（1）这种培养基是一种选择培养基。（

）（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（

）（3）相对未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（

）√√√2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（

）A.菌落中的细菌数目是固定的B.平板上的一个菌落就是一个细菌C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌D二、拓展应用1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌,请你给出详细的实验方案。（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。详细方案：土壤取样-选择培养-梯度稀释-将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上-挑选产生透明圈的菌落2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与