医用基因工程课件

第一章核酸的结构与功能一、核酸的种类与组成二、DNA的结构与功能三、RNA的结构与功能四、其它小分子RNA五、双链RNA（dsRNA）一、核酸的种类与组成核酸的基本构成单位是核苷酸，是由多个核苷酸连接而成，又称多聚核苷酸。（一）化学组成：碱基+戊糖+磷酸（二）种类：DNA/RNA两类1.碱基2.戊糖3.核苷4.核苷酸

5.核酸DNA/RNA比较核酸碱基核糖磷酸嘌呤嘧啶DNAA、GC、T脱氧核糖磷酸RNAA、GC、U核糖磷酸碱基DNA/RNA均有A、G、C，但DNA中由胸腺嘧啶T替换了RNA中的尿嘧啶U。戊糖RNA中为β-D-核糖，DNA中为β-D-2-脱氧核糖。核苷碱基和核糖通过糖苷键连成核苷：嘌呤类以N9与核糖C1相连，嘧啶类以N1与核糖C1相连。核苷酸任何核苷与磷酸缩合（磷酸化）生成的磷酸酯称为核苷酸。由核糖核苷（或脱氧核苷）生成的磷酸酯称核糖核苷酸（或脱氧核糖核苷酸）。根据缩合在C5上的磷酸数目又可组成：核苷一磷酸（NMP/dNMP）；核苷二磷酸（MDP/dNDP）；核苷三磷酸（NTP/dNTP）。（如图）核酸由多个核苷酸通过C3-C5的磷酸二酯键连接而成的多核苷酸链。种类有DNA、RNA两种二、DNA的结构与功能（一）DNA的一级结构（二）DNA的二级结构（三）功能（四）三链DNA（一）DNA的一级结构核苷酸中脱氧核糖和磷酸的一样，但由于碱基不同而带有不同的遗传信息，通常称为碱基序列（又称碱基对，bp）。人类有3×109bp。（二）DNA的二级结构1.Watson-Crick双螺旋结构模型两条逆向（5’-3’/3’-5’）平行的脱氧核糖核苷酸链彼此间以A=T，G≡C的碱基氢键相连。（如图1-7）。由于不同湿度、离子强度，分子构象呈现多样性（多态性）有A、B、B’、C、C’、C’’、D、E、S、Z等构象。由于双链的扭结或进一步盘绕可形成三级结构等超螺旋结构，其意义：①使DNA体积压缩变小，节约空间位置；②使DNA遗传信息获得稳定储存。（三）功能1.可提供64个遗传密码的遗传信息（如表）2.可按半保留方式进行复制，稳定传代3.可通过转录mRNA合成蛋白质，可遵循遗传的中心法则。逆转录酶的发现又使该中心法则得以修正可由RNA逆转录成cDNA。（四）三链DNA三链DNA由于双螺旋的一股轻微旋转、折叠后，该股中的碱基可与双螺旋的碱基以Hoogsteen氢键相连如TAT、CGC、TAA、CGG。（如图）三链DNA结构类型、意义：①可作为精确切割DNA的靶序列的“分子剪刀”②抑制基因表达（转录）（反义DNA基因治疗）③影响DNA与蛋白质结合及DNA复制、转录等，此外，还有四链DNA。三、RNA的结构与功能通常为单链，T被U替代（T是U的甲基取代衍生物）；由核糖取代脱氧核糖，因RNA由DNA转录而成，故保留有DNA遗传信息。RNA由rnRNA、rRNA、tRNA三种类型共同担负着基因表达、表达调控和蛋白质合成的任务。四、其它小分子RNA（一）细胞核内RNA（hnRNA和SnRNA）（二）反义RNA（三）核酶（一）细胞核内RNA（hnRNA和SnRNA）DNA转录产物很不均一，故将mRNA前体称为不均一核RNA（核内hnRNA）。此外，核内还存有小核RNA（SnRNA），约为70~300个核苷酸，可参与真核生物的RNA剪接。（二）反义RNA反义RNA：指能与特定mRNA互补结合的RNA片断，其功能：①阻断mRNA的翻译②抑制DNA复制③可选择性地关闭基因。意义：①参与基因调控②可用于基因治疗（病毒、肿瘤）（三）核酶

核酶是指具有催化活性的RNA，命名为核酶（ribozyme），又指“酶RNA”。酶RNA不用于RNA酶（Rnase），前者是RNA，后者是蛋白质。核酶呈锤头状（如图）。

由13个保守核苷酸残基好个螺旋结构域构成的锤头状二级结构，剪切反应是在GUX序列的3’端自动发生。催化结构域（R）可据底物（S）和R在锤头结构中的相对位置行使对S（底物）的剪接。功能：参加RNA剪切和降解。意义：①肿瘤的基因治疗（人工合成锤头状核酶）②HIV-1等病毒病的治疗五、双链RNA（dsRNA）小分子的双链RNA能引发转录后的基因沉默（Post-transcriptionalgenesilencingPTGS）或RNA干扰（RNAinterference，RNAi）。该dsRNA在Dicer酶作用下可被降解，进而发生基因干扰（或沉默），也就是说阻断了基因的表达。（机理如图）特点：①不同SiRNA序列可行使特异识别，切割作用②mRNA被切割后所产生的dsRNA在RNA依赖性RNA多聚物下可发生PCR扩增起放大干扰效应③dsRNA可进行人工设计合成，也可用于载体构建体外扩增或基因敲除工具，可应用于病毒病、肿瘤基因治疗。第一节

基因的概念

一、基因与“遗传因子”二、基因与染色体三、基因与蛋白质四、基因与DNA五、基因密码的破译六、基因的概念七、基因的新概念一、基因与“遗传因子”对遗传物质基础的认识有个发展过程，孟德尔（G.Menodel）在1857～1864年以豌豆为材料进行杂交实验的研究中,提出“遗传因子”决定和控制着生物体的各种性状。1909年丹麦生物学家W.Johannsen为了强调“遗传因子”与生命的关系,他根据希腊“给予生命”之义的词“gene”（基因）创造性地用“gene”这个术语来代替“遗传因子”。基因这个词当时被用来描述遗传性状，但对基因的物质概念还未能认识，只是遗传的一个符号。孟德尔的豌豆杂交试验

遗传因子是成对的，一个来自父本，一个来自母本，形成配体时彼此分开，在性细胞中是成单的，杂交子一代各自保持独立和纯一状态，形成配子时又彼此分开，互不混杂，完整地传给后代，雌雄配

子结合有等同随机结合的机会。

圆形种子＋皱形种子

杂交第一代(均为圆形)

回交

圆形豆皱形豆

5474粒1850粒

3：1黄色图形＋绿色皱形杂交第一代(均为黄色圆形)回交黄色圆形豆黄色皱形豆绿色圆形豆绿色皱形豆315粒121粒108粒32粒9

：

：

：331二、基因与染色体1910年～1926年,美国的摩尔根（T.H.Morgan）选用果蝇做研究材料，发现了基因连锁和交换现象，创立了遗传的染色体理论（Chromosomoltheoryofinheritance），绘制了基因连锁图,接受了孟德尔的遗传原理,指出遗传物质必须由某种独立的要素组成,即遗传因子或叫做基因。从而证明了基因是位于染色体上呈直线按顺序排列的遗传单位，基因是携带遗传信息的结构单位，又是控制遗传性状的功能单位。摩尔根果蝇杂交试验有4对染色体，一对小粒状，2对V形，一对呈棒状XX或XY（性染色体）

X1X2（红眼）+XWY（白眼）（野生型）（突变型）杂交子一代（雌雄均为红眼）

X1XW，X1Y，X2XW，X2YX1X1，X1Y，XWX1，XWY，X2X1，X2Y，XWX2，XWY¼为红眼雄性及白眼雄性三、基因与蛋白质1941年G.W.Beadle和E.L.Tatum应用X射线诱导链孢霉菌（Newosporecrassa）在DNA损伤修复后,产生了大量营养缺陷性突变体,提出了“一个基因一种酶”学说,后来又修正为“一个基因一种蛋白质”的学说,或“一个基因一种多肽链”学说。

四、基因与DNA1928年美国O.T.Avery首次证明了控制遗传特性的物质是DNA,而不是蛋白质,染色体上的基因为DNA分子。1953年J.watson和F.Crick根据碱基配对规律和DNA分子的X射线衍射图谱等实验,提出了DNA分子的双螺旋结构。1958年证明了DNA半保留复制和DNARNA蛋白质合成的中心法则（如图）。遗传中心法则五、基因密码的破译1961年F.Crick,S.Brenner,M.W.Nirenberg,H.G.Khorana等确立了每三个核苷酸可作为决定一个氨基酸的密码子。1964年64种三联密码子全部被破译公布。64种密码子中有61个密码子可用于编码20种氨基酸,有3个密码子为终止信号,只表示链的终止,不表达任何氨基酸。其中AUG为启始密码子，并具有通用性、偏爱性和简并性。遗传密码的兼并性六、基因的概念按照分子生物学理论，基因的概念应当是指编码有功能蛋白质多肽链或RNA分子所必需的全部核酸序列（即DNA序列）。根据这个概念，一个基因不仅含编码蛋白质肽链或RNA分子的核酸序列,还包括保证转录所必需的非编码的调控序列即位于编码区上游5’端的启动子非编码序列、内含子（intron）和位于编码区下游3’端的终止子非编码序列。编码区是发挥基因功能的结构基因（或功能基因），而起调控、启动和终止作用的非编码区属于调控基因。

七、基因的新概念1、移动基因2、断裂基因（splitgene）3、重叠基因4、假基因5、重复序列及重复基因1、移动基因

移动基因（movablegene）又叫转位因子（transposableelements）,由于它可以在染色体基因组上移动，甚至可在不同染色体间跃迁，故又称跳跃基因（jumpinggene）,这种基因是J.A.Shapiro在研究大肠杆菌高效突变时发现的。有三种类型：1.插入序列（insertionsequences,简称IS），其长度为数百个到数千个碱基对之间（如图1-1）。2.转位子（Tn)，即两侧的IS和一个中心序列（带有遗传信息）3.噬菌体Mu和D108，其转位作用如图1-2。2、断裂基因（splitgene）

在真核细胞中的核苷酸序列中间插入与氨基酸编码无关的DNA间隔区段，使一个有功能的结构基因分隔成不连续的若干区段，将这种编码序列不连续，有间隔区段的DNA片断称为断裂基因。这种非编码间隔区段DNA称间隔子（内含子），有转录和编码功能的编码序列称表达子。原核细胞无内含子。其二者mRNA剪辑作用如图1-3，1-4，1-53、重叠基因

不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用，将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因（overlappinggenes）,在

174噬菌体有两种类型的重叠基因（图1-6）。4、假基因

在珠蛋白基因簇（genecluster）各片断核苷酸序列分析时发现，除了有正常的功能基因之外，还有功能失活的特殊序列片断，它不能行使表达功能。该类无表达功能的畸变核苷酸基因序列片断，称为假基因。其产生原因如图1-7、1-85、重复序列及重复基因

几乎所有的真核细胞（酵母除外）的基因组DNA中都具有重复序列（repeatedsequence）,它无转位移动能力，因此它区别于转位作用的IR（invertedrepeat）。IR是指序列的重复性。但无基因序列的交叉重叠性，故不同于重叠基因序列。重复序列可分为四种类型：(1)不重复序列，是唯一的序列，只有一个拷贝。(2)低度重复序列，一般有1-10个拷贝。(3)中度重复序列，有数十至数万（105）拷贝。如图1-9、1-10(4)高度重复序列拷贝数可达106以上,包括卫星DNA、高丰度SINE家族的Alu序列。第二节

基因组

“基因组”是表示某物种单倍体的总DNA，对于二倍体高等生物其配子的DNA总和即为一组基因组。不同生物基因组数目不同，如表研究得较多的为以下三类基因组：

一、病毒基因组二、细菌基因组三、真核生物基因组第三节

基因工程的定义和研究内容

基因工程的定义通常是指在体外把核酸分子（基因）组合到特定的载体上（病毒，质粒，噬菌体等）并使之进入（或导入）到原来没有这类分子的宿主体内，能使基因在宿主内繁殖或表达生物活性物质。基因工程的核心内容是重组DNA技术，还包括体外DNA突变，体内基因操作以及基因的化学合成等。第四节

基因工程的发展史

一、四大里程碑二、三大技术发明三、基因工程的诞生病毒基因组特点：1.结构简单，无细胞结构，基因组为DNA或RNA组成，有双链/单链，环状/线状。2.有调控元件和转录元件组成，转录元件可转录成为多顺反子mRNA。3.有重叠基因。4.逆转录病毒（RV）可使RNA变cDNA其结构如图，具U3RU5的长末端重复序列（LTR），具随机整和能力，可用作病毒载体。细菌基因组约有三千个基因，无内含子，为双链DNA，但无核仁、核膜，多为单拷贝，无重叠基因，有多种功能调控区，有复制起始区、终止区、转录起始区，终止区常有反向重复序列。另外有质粒存在，质粒可作为载体。真核生物基因组特点：大而复杂，为双倍体，有低中高重复序列，多为断裂基因，基因组中非编码区多于编码区（占90%），大多于蛋白质结合形成染色体，DNA占35%，RNA占5%，其余为蛋白质（组蛋白或非组蛋白）与C值矛盾：一般高等生物的全部DNA量（称C值）均大于低等生物，但某些植物或两栖动物的C值比人高出几十倍，这种与进化复杂性不一致的C值反常现象称为C值矛盾。类型多基因家族四大里程碑遗传物质的明确——DNADNA双螺旋结构理论（半保留复制及其中心法则）基因遗传密码子的破译基因转译载体的发现三大技术发明工具酶的发明：内切酶、合成酶、连接酶基因合成和测序（合成仪、测序仪）PCR技术（PCR扩增仪）基因工程的诞生1972年是基因工程的诞生之年。美国斯坦福大学P.Berg将SV40的DNA导入噬菌体载体在大肠杆菌中获表达。S.Cohen等人将抗四环素、新霉素基因的质粒转化大肠杆菌，获得抗四环素，抗新霉素重组菌落，从而揭开基因工程的序幕。类型单拷贝序列：人类约占60%~65%中度重复序列：长短300~700bp，重复次数达105。通常为Alu、KpnⅠ、Hinf、rRNA、tRNA、组蛋白基因等。高度重复序列：卫星DNA及微卫星DNA反向重复序列：人类约占5%，长度300bp在复性时，若有间隔序列，可形成发夹结构，若无间隔序列，可形成回文结构，可能与复制、转录调控有关。多基因家族指来源相同，结构相似，功能相关的基因在染色体上成串存在，形成多基因家族。如rRNA、tRNA、组蛋白基因等为成串的，干扰素、珠蛋白、生长激素等为分散的。卫星DNA卫星DNA又称随体DNA，由CsCl超速离心后，分散在主峰旁，形似卫星分布而称之。一般5-10bp短序列，人类为171bp，保护和稳定染色体。近来又发现微卫星DNA，又称简单重复序列，一般由1-6bp的串联重复单位组成，有2bp、5bp、6-7bp不等，以2bp为常见。人类基因组中2bp（≥14）的重复序列呈高度多态性。采用限制性长度多态性（RFLP）分析，可用于基因连锁的遗传标记，广泛用于诊断。第一节

基因表达的概述和基本条件

一、基因表达的基本概念二、基因表达的基本条件三、真核基因在原核细胞中表达及调控第二节

在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素一、启动子结构对表达效率的影响二、表达载体的选择三、外源基因（cDNA）中密码子的作用四、mRNA的一级结构与基因表达五、mRNA的二级结构对翻译起始的影响六、mRNA稳定性的影响七、转录终止区对外源基因表达效率的影响八、转录后的若干因素与基因表达的关系九、宿主选择对表达的影响十、培养条件的控制对表达效率的影响一、基因表达的基本概念

生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上,基因表达是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA,再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因的表达依赖于有效的转录和mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作用，其中转录最为关键，原核的基因表达过程和方式与真核细胞有显著不同。二、基因表达的基本条件1.外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。2.插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能够识别插入的基因。3.外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。

三、真核基因在原核细胞中表达及调控真核基因在原核细胞中表达及调控的特点㈠有效转录及其调控元件

㈡正确转译

㈢原核表达载体的构建㈠有效转录及其调控元件

1.RNA聚合酶2.启动子及其转录作用的启动（启动子的概念、分类）3.转录作用的终止4.转录的弱化作用㈡正确转译

1.起始密码子（intiqtioncodon,initiator）2.核糖体结合位点（RBS，又称SD序列）㈢原核表达载体的构建

原核表达载体的构建的要求1.表达载体类型2.表达载体的举例3.包涵体表达载体启动子⑴乳糖启动子（Lac）⑵Trp启动子⑶Tac启动子⑷噬菌体的PL和PR启动子⑸脂蛋白启动子（LPP）启动子结构对表达效率的影响启动子-35区和-10区序列与通用转录序列一致，间距为17bp，大于17bp效果差，不同产物选用不同启动子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL启动子效果好。表达载体的选择载体分子量不宜过大，以2.5-5.6kb为佳，高拷贝，不同产物选用不同类型表达载体。外源基因（cDNA）中密码子的作用细菌中基因表达对密码子有偏爱性，不偏爱的稀有密码子（AGA、AGG）表达效果差，特别当有AGA-AGG连续序列存在时表达效率低mRNA的一级结构与基因表达启始密码子：表达效率AUG>GUG>UUGSD序列：较长的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列与AUG间距一般6-12bp，4-10bp较佳，9bp最佳；SD序列的5’非翻译区，若有5’-UGAUCU，则有增强作用。mRNA的二级结构对翻译起始的影响mRNA形成二级结构时，可产生茎环。若SD序列、AUG位于茎环内或发夹内，转译受抑制；在茎环外则有利于转译。见表6-1mRNA稳定性的影响REP序列可阻止mRNA降解，偏爱密码子也起保护作用。真核基因在原核细胞中表达及调控的特点只有一种RNA聚合酶以操纵子为单位来完成基因转录基因转录无RNA剪接功能因无核仁、核膜，核酸均为裸露的，转录与翻译是连续进行的转录产物在多聚核糖体上合成，同时合成多条肽链有特有SD序列，调控mRNA与核糖体有效结合和翻译的起始无糖基化功能RNA聚合酶原核细胞只有一种RNA聚合酶，当其核心酶与σ因子结合，形成全酶后，才能识别DNA上的启动子进行转录。启动子的概念启动子是位于结构基因上游，转录起始调控所必需的一段DNA序列，内含-35区（与σ因子结合）和-10区（和核心酶结合）的保守序列。当启动子与全酶结合后可在+1转录起始点开始转录，如图6-1。转录作用的终止由转录终止子发挥作用，凡能使转录终止的有关的DNA的序列称终止子。强终止子：不依赖ρ因子发挥终止作用，回文序列中G/C配对多，有四个以上U，致使RNA聚合酶构象改变而终止转录。如图6-9,如图6-10弱终止子：依赖ρ因子发挥终止作用。如图6-11转录的弱化作用转录的弱化作用使转录没有到达终止信号处而中途停止转录，使mRNA转录发生部分停止，而不是发生全部停止。

起始密码子起始密码子是编码多肽链第一位氨基酸的密码子AUG（或ATG），编码甲硫氨酸（蛋氨酸）。在细菌中也有罕见的起始密码子GUG，编码缬氨酸。其起始表达作用AUG＞GUG。核糖体结合位点转录mRNA的AUG上游具有的，能与核糖体发生有效结合和转译所需要的序列（RBS），长度为3-9bp，距AUG3-11bp，它与16srRNA3’末端（AUUCCUCCAC-DAG-5’）互补其互补程度、SD与AUG间距等与转译效果有关。如图表达载体类型表达载体的类型主要有四种：非融合型表达载体，如PKK223-3如图6-14分泌型表达载体，如PINⅢ-ompA1如图6-15融合蛋白型表达载体，如PGEX如图6-16包涵体型表达载体，如pBV220如图6-17原核表达载体的构建的要求完整的表达载体（质粒）应有强启动子（P）、终止子（T）、多个酶切位点、有抗性标记、复制子和RBS的SD序列。（如图6-13）还应结合考虑：质粒的拷贝能力和稳定性，转译蛋白的表达形式和存放地点（分泌型/包涵体/融合蛋白），蛋白质的分子量、性质和稳定性以及选择合适宿主细胞。乳糖启动子（Lac）无乳糖时，调节基因（I）产生阻遏蛋白与操纵基因结合，阻止RNA聚合酶结合进而阻止转录；有乳糖时，乳糖能与阻遏蛋白结合，使其变构解离而行使转录功能。如图6-2而LacZ基因可由IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖）诱导转录。Lac启动子改建如图6-3、6-4(a)

(b)Trp启动子色氨酸启动子（Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸时，二者结合，阻遏蛋白变构激活而与启动子结合，阻止RNA聚合酶的转录。无色氨酸时，阻遏解除，因β-吲哚丙烯酸是色氨酸的竞争性抑制剂，常用作诱导剂，诱发色氨酸启动子转录。（如图6-5）同时，衰减子对Trp转录也有调节作用（如图6-6）Tac启动子Tac启动子是由Trp启动子和Lac启动子构建而成的杂合启动子，-35区为Trp启动子顺序，-10为LacUV5启动子顺序，二者之间距离为16bp者为pTrc，17bp者为pTac。该启动子只需用IPTG诱导转录即可。如图6-7噬菌体的PL和PR启动子PL为λφ左向启动区，PR为右向转录启动区，与CI阻遏蛋白结合，可抑制OL或OR

转录，但CI在42℃诱导转录（如图6-8）。脂蛋白启动子（LPP）脂蛋白为细胞外膜蛋白，细菌中含量高，该启动子表达效率高，由信号肽可将基因表达产物分泌到胞外，常用来构造分泌型表达载体。第一节

真核细胞基因表达的调控

一、真核生物基因表达的特点及优势二、真核细胞表达及调控元件第二节

哺乳动物细胞表达系统的选择标记基因

一、胸苷激酶基因选择标记（定义）二、二氢叶酸还原酶基因选择标记三、新霉素抗性基因选择标记四、氯霉素已酰转移酶基因选择标记五、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因第三节

真核细胞表达系统的载体种类

一、载体的类型二、几种常用的真核表达载体一、真核生物基因表达的特点及优势

1.细胞的全能性2.转录和翻译分开进行3.有相当大的非编码区（调控序列）4.有三种不同RNA聚合酶参与转录5.初级转录产物能进行剪接加工修饰6.不存在操纵子结构7.基因多拷贝，功能基因分散在不同区域，分别转录二、真核细胞表达及调控元件

（一）真核生物基因转录水平的调控

（二）转录后水平的调控

（三）翻译水平的调控

胸苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核细胞中都有表达,是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶,它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP,继续磷酸化生成dTTP,参与DNA的生物合成。一、载体的类型1.质粒型载体2.病毒载体3.整合型表达载体4.游离型表达载体5.瞬时表达载体6.稳定性表达载体7.非复制性HSV-Ⅰ病毒（单纯疱疹病毒HSV-Ⅰ型）载体8.裂解性HSV-Ⅰ病毒载体二、几种常用的真核表达载体㈠逆转录病毒载体1.卸甲载体2.穿梭载体㈡痘类病毒载体㈢HSV-Ⅰ单纯疱疹病毒载体1.重组病毒型载体2.重组质粒型载体3.裂解型病毒载体

（一）真核生物基因转录水平的调控

基因调控的顺式作用元件启动子增强子RNA剪接信号负调控元件终止子和polyA信号基因调控的反式作用因子概念反式作用因子主要作用规律（二）转录后水平的调控mRNA前体加工：转录的mRNA前体经5’加帽，3’酶切加尾去除内含子后，产生成熟mRNA，通过核孔进入胞质中。RNA编辑（RNAediting）（三）翻译水平的调控翻译起始序列eIF-2的磷酸化反应由模板来源的遗传信息，进而可编码产生不同氨基酸序列的多种蛋白质，这是生物适应性的保护措施。顺式作用元件顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录按效应和功能可分为启动子、增强子、RNA间接信号、负调控元件、终止子等调控元件。反式作用因子主要作用规律同一DNA序列可被不同蛋白质识别同一蛋白质因子可与多种不同DNA序列发生联系，多数是通过蛋白质-蛋白质先相互作用后，再与DNA结合，发挥调节作用。反式作用因子的自身生物合成有相当大的可变性、可塑性。反式作用因子与顺式作用元件相互作用的特定结构域，有两种类型：通用转录因子的结构域为识别特异DNA的DNA结合结构域，如：锌指结构。转录调节因子的结构域又称转录活化结构域，如：酸性α-螺旋结构域。不同结构域各自的特征不同结构域各自的特征通用转录因子的DNA结合结构域锌指结构亮氨酸拉链螺旋-转角-螺旋（HTH）螺旋-环-螺旋转录调节因子的转录活化结构域RNA编辑（RNAediting）RNA编辑是在转录时或转录后，能够改变RNA分子编码特性，是与剪切形式不同的一种修饰形式，如可使mRNA某位点密码子CAA转变为UAA，使C变U，编辑的结果形成了UAA终止密码子，在编码酶的作用下，除使C变U，还可在RNA上添加多个U或呈单个C的添加，使前体mRNA变成成熟mRNA时，通过插入或替换方式，可改变和扩大原遗传信息，编码多种蛋白,是生物的适应性保护。翻译起始序列

在ATG起始密码子周围要有5’-CCACCA-TGG-3’保守序列，以利mRNA翻译起始，若发生突变，其翻译水平可下降10倍。在起始AUG上游若有比较多的二级结构序列，也会影响翻译，建议外源基因的5’端AUG上游序列不宜过长。eIF-2的磷酸化反应eIF-2为转译起始因子-2是蛋白质合成起始阶段13种起始因子中最为关注的因子。若转入动物细胞中的质粒DNA的两条链一旦都发生转录，就会形成双链互补mRNA，而激活胞内的双链RNA激活的蛋白激酶（DAIPK）该激酶可使eIF-2的α-亚基磷酸化，转译受抑，为防止该激酶活化，常在载体上加上腺病毒的VARNA基因，VARNA是由RNA聚合酶Ⅲ合成的小分子RNA，能阻止双链RNA对DAI激酶的激活作用，使转译得以正常进行。一、胸苷激酶基因选择标记外源基因+载体(TK+)的重组体导入TK-细胞中，在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷）选择培养基中筛选，TK-细胞因氨基喋呤抑制了dTTP的合成而死亡，TK+细胞可存活，以此进行筛选。（HSV-1的TK基因转染细胞加GCV后被杀死，如小鼠LMTK-细胞。）注：TK++BrUdR因掺入后对紫外线敏感而死亡，

TK-+BrUdR因不掺入，对紫外线不敏感而存活。二、二氢叶酸还原酶基因（DHFR）选择标记DHFR是合成dATP和dGTP的关键酶。常用DHFR—的CHO细胞因不能合成四氢叶酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培养基中生长。在不含该培养基中导入该标记基因重组子，则可筛选出阳性克隆，也可将DHFR基因置在强启动子下高表达或通过DHFR基因突变以提高抵抗高浓度氨甲喋呤（抗MTX的抗性）的能力，从而筛选阳性克隆。三、新霉素抗性基因选择标记新霉素类似物G418抗生素，可影响80s核糖体RNA功能，对细胞有毒性。新霉素抗性基因neo的载体可在真核细胞中表达产生新霉素磷酸转移酶能使G418失活，可在含G418培养基中筛选重组体转化的阳性克隆细胞。阳性克隆存活，阴性者死亡。五、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，在转化细胞中就能表达XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP中间体补救合成GMP，使DNA合成正常进行，加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而未转化的阴性细胞则受霉酚酸的抑制而死亡，以此可用来筛选阳性细胞。1.质粒型载体

质粒型载体（穿梭载体）：实际上是病毒质粒型载体，共有两套复制元件和选择标记，在原核中复制，真核中表达。2.病毒载体

病毒载体种类多，SV40、Adv、RV、HSV-1、痘苗V。可在敏感细胞中复制，表达外源基因，有的还可通过整合后表达。3.整合型表达载体

RV、SV40可携带外源基因整合到宿主细胞的基因组中进行表达。4.游离型表达载体

该病毒载体是以完整的或缺陷病毒形式携带外源基因导入宿主细胞后不发生整合，可在胞浆中游离复制，表达外源基因，如痘苗V、Adv。5.瞬时表达载体瞬时表达载体（转染后70-90h左右）：含病毒复制子的病毒载体，可携带外源基因导入宿主细胞，不整合到染色体上，只在细胞内进行暂时性表达，不能随细胞传代，随后逐渐降低或消失。常用SV40复制子载体，在COS细胞中表达，由于载体复制，若超过104个/细胞，细胞不能承受而死亡。6.稳定性表达载体将外源基因与具标记基因（DHFR）病毒载体转染动物细胞（CHO），可将基因整合到细胞染色体上，可随细胞转录表达和传代。（CHO、DUKX-B11因加入氨甲喋呤而死亡，依此筛选阳性克隆。）7.非复制性HSV-Ⅰ病毒（单纯疱疹病毒HSV-Ⅰ型）载体

HSV-1病毒去除α极早期基因，失去复制能力，但携带外源基因转染细胞后高效表达，毒性小，转染和表达能力强。8.裂解性HSV-Ⅰ病毒载体

HSV-1病毒去除了β早期基因，而不能产生DNA合成所需的酶，该病毒在静止细胞中不能复制和裂解细胞，但在高度分裂活跃的细胞中（如肿瘤）可复制并裂解感染的细胞，因分裂活跃细胞可提供病毒复制所需的DNA合成酶，复制时只杀死肿瘤细胞，对正常细胞无损害。㈠逆转录病毒载体

逆转录病毒载体是RNA单链，pol基因产生逆转录酶，使单链生成双链。有5’、3’的U3RU5的长末端重复序列，有TATA强启动子和加尾功能，经体外包装，可整合表达。穿梭质粒载体组装基因后，可由辅助病毒协助或经体外细胞包装，形成具感染性假病毒颗粒，再感染宿主细胞进行表达。㈡痘类病毒载体

已用于构建多价活疫苗载体（HBsAg、HA、狂犬、HAV、麻疹V、HSV-Ⅱ、EBV等。该载体的双链DNA的大病毒载体，组装量大，安全，可在细胞独立复制，表达。1.重组病毒型载体

在HSV-1非必需区插入外源基因的重组体DNA与野毒株共转染细胞，可发生同源重组，通过LacZ筛选，转染效率高，无需辅助病毒，但有毒性作用。启动子大多位于基因5’端上游区，是一种与基因转录起始有关的5’端DNA序列，在-30bp区有TATAbox，可引导RNA聚合酶Ⅱ转录起始，在-70~-80bp区还有GCbox，可协同调节转录起始频率和提高转录效率。常用的启动子有RSV启动子、CMV启动子、SV40早期启动子。增强子增强子是一类可使启动子的基因转录效率显著提高的顺式作用元件，本身无启动子活性，可独立存在与上游区、下游区或基因内部，可进行远距离增强启动作用，而且无方向性。它有特征性序列，常由812bp组成，以单拷贝或多拷贝的形式存在。增强子可使转录效率增强10-100倍，通常来源于SV40、RSV或CMV病毒。一旦增强子的作用使表达产物对细胞有毒性时，最好改用诱导型启动子来表达外源基因，如热休克启动子、金属硫蛋白启动子。RNA剪接信号虽然cDNA来源的基因转入哺乳类细胞后，其表达不受有或无内含子的影响，但在该细胞中表达最好有一段内含子序列的剪接信号，以提供对cDNA基因表达的需要，常用SV40的小t抗原的内含子序列来作为cDNA中的内含子剪接序列。负调控元件沉默子和衰减子为转录的负调控元件，它们与反式作用因子相互作用而起作用，不受距离、方向、基因来源的限制。终止子和polyA信号真核基因转录的确切终止信号和终止机制目前尚不清楚，现发现在模板DNA分子3’端有一终止序列，称终止子，产生具有polyA尾的转录序列，在DNA区域内G/T簇。如SV40中的终止子序列为AGGTTTTTT的DNA序列，并有发夹结构的反向重复序列。polyA可使mRNA稳定其多聚腺苷酸化需要两种序列：①位于polyA位点下游的GU或U丰富区，②位于polyA上游11-30bp处的6bp高度保守序列（5’-AAUAAA）与转录后的RNA切割和加尾有关。反式作用因子的概念反式作用因子是一组能直接或间接地与DNA的顺式作用元件特定序列结合，发挥调节作用的核内非组蛋白，即DNA结合蛋白（DBP），DBP又称转录因子（transcriptionfactor,TF）分通用转录因子及转录调节因子两大类。基因表达的组织特异性及细胞周期特异性受上述元件和因子的相互作用所决定，通用转录因子中识别TATAbox的为TFⅡD，可与RNA聚合酶Ⅱ结合使转录起始，识别GCbox的DBP为SP1，可调控转录效率。锌指结构锌指（zinefinger）结构：由两个半胱氨酸（Cys）和两个组氨酸（His）残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构，表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关。一个蛋白分子有2-9个锌指重复单位，由指部碱基或极性氨基酸（赖氨酸Lys、精氨酸Arg）结合于DNA双螺旋的深沟内。结构域为以锌辅基螯和形成的环状结构作为活性结构域。亮氨酸拉链

亮氨酸拉链（Leucinezipper，LZ）：为两组走向平行带亮氨酸的α-螺旋形成的对称二聚体，每个亚基含4个亮氨酸，每2个Leu之间相隔6个氨基酸。于α-螺旋的某一侧面，每2圈（3.6碱基/圈）就出现一个Leu，排成一排，使2个α-螺旋蛋白分子间形成一条拉链，只有在形成二聚体拉链后，链上富含的碱性氨基酸区可与DNA结合。结构域为链上碱性区和亮氨酸拉链形成的稳定结构为基础。螺旋-转角-螺旋（HTH）

螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）：此α-螺旋中含碱性氨基酸较多，其所带的正电荷基团可与带负电荷的DNA链结合。螺旋-环-螺旋螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）：HLH与HTH结构相似，不同之处为两个α-螺旋之间的肽链为非螺旋的环，在α-螺旋附近的氨基酸也有碱性区，为与DNA结合所必需，DNA结合性质与亮氨酸拉链相似。第五章

分子克隆常用的工具酶

第一节

限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第二节

DNA连接酶和DNA分子的体外连接第三节

其他工具酶第一节

限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割

限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图2-2二、限制性核酸内切酶的制备方法三、限制性核酸内切酶分类和命名四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性五、影响限制性内切酶活性的因素分类：ⅠⅡⅢ

Ⅰ：识别和切割位点不固定，随机性。

Ⅲ：核酸内切酶活性和甲基化活性是不分开的。Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的。常用。四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性识别序列：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序列

2.回文结构：两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。

EcoRⅠ5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型1.粘性末端(1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：PstⅠ5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’(2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ

5’-GAATTC-3’

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

3’-CTTAAG-5’2.平末端如:SmaⅠ5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’两种特殊的限制酶(1)同尾酶

识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的两种酶。如：BamHⅠ和BglⅡ(2)同裂酶识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两种酶。如:MboⅠ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC，但对GmeATC切点,前者不能切，后者能切。五、影响限制性内切酶活性的因素1.DNA的纯度2.DNA的甲基化（1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌（2）研究基因工程DNA的甲基化程度（3）改变限制酶的识别特性3.温度4.分子结构5.限制酶的缓冲液星号活性EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT第二节

DNA连接酶和DNA分子的体外连接一、DNA连接酶

DNA连接酶（Ligase）是一种能够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复，不能连接单链DNA或裂口.

温度二、DNA分子的体外连接二、DNA分子的体外连接1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的磷酸化2．平末端DNA片段的连接（1）T4DNA连接酶法（2）同聚物加尾法（3）用化学合成的衔接物连接DNA分子第三节

其他工具酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）三、T4DNA聚合酶四、逆转录酶五、末端脱氧核苷酰转移酶六、核酸酶S1七、核酸酶BAL31八、外切核酸酶Ⅲ九、T4多聚核苷酸激酶十、碱性磷酸酶十一、

甲基化酶命名

HindⅢH:Haemophilus嗜血杆菌属in:influenzae流感d:Rd株Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶同尾酶BamHI和BglII

AGATCT

GGATCC

TCTAGA

CCTAGG

BglⅡBamHI

AGATCC

TCTAG G

T4连接酶

AGATCC

（连接后的切点均不能被上述两种酶切）

TCTAGG

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.三种活性（1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时）（2）3’外切酶活性（无dNTP时大亚基活性）（3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性）2.在基因工程中的应用：缺口平移标记技术。二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）1.DNA聚合酶活性（切除小亚基，保留大亚基）2.3’外切酶活性（无dNTP时）3.在基因工程中的应用（1）标记粘性末端.

-32P—dNTP

标记平末端

-32P—dNTP（2）将5’端伸出的末端填平（3）可用来反转录合成双链cDNA。（4）补平粘性末端。

三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。其外切酶活性比E.coliDNA聚合酶I的活性高200倍。

取代反应四、逆转录酶

逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。1.聚合酶活性

RNA或DNA为模板2.3’外切酶活性能使DNA-RNA杂合链中的RNA降解。应用：1.RT-PCR使mRNA逆转录成cDNA2.制备探针。五、末端脱氧核苷酰转移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接脱氧核糖核苷酸。常用于同种碱基多聚体接尾反应核素标记DNA片段的3’端六、核酸酶S1

可以降解单链DNA和RNA(1)将DNA切成平末端。有些限制性内切核酸酶可以将DNA切成粘性末端，经过核酸酶S1降解可切除DNA末端的单链。生成平末端DNA。(2)切除cDNA中单链发夹状结构。反转录反应合成的cDNA，可能形成单链发夹状结构，为了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解，生成无发夹结构的cDNA。(3)可用核酸酶S1分析DNA·RNA杂交分子的结构。十、碱性磷酸酶该酶的功能是以单链或双链的DNA、RNA为基质，将DNA或RNA片段5’端的磷酸切除，产生5’-OH。应用：(1)用该酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸,然后加上γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下标记5’端。

(2)用于避免单酶切后质粒自我环化。十一、

甲基化酶常见的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，可使相应碱基甲基化。dam可在限制酶识别的5′GATC3′或5′GAAT3′序列的5′腺嘌呤N6位上引入甲基。dcm可在限制识别的5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列的5′胞嘧啶引入甲基。常用于使酶切位点中的碱基甲基化而避免降解，保护酶切位点。核酸酶BAL31

从线形DNA分子两端（粘端/平端）以渐进方式切去单核苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有类似于SI酶单链特异降解活性，可除去粘性末端或单链发夹结构。外切核酸酶Ⅲ

能从线性DNA的3′-OH末端沿3′→5′方向切去单核苷酸，制造3′端缺失，制备DNA模板或特异DNA探针。T4多聚核苷酸激酶能将ATP上的γ位磷酸转移到单链或双链DNA或RNA的5′-OH上，可将γ-32P-ATP中的32P连接到5′端的5′-OH上，以完成寡聚核苷酸的核素标记。二、基因工程的基本程序载体质粒外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞选出含有重组DNA的细胞扩增表达abbAAb第六章

分子克隆常用的载体

第一节

质粒载体第二节

噬菌体载体第三节

真核细胞的克隆载体第一节

质粒载体

一、质粒的基本特性二、质粒的分离纯化方法三、质粒载体的选择四、大肠杆菌质粒载体五、多种功能的衍生质粒的组建一、质粒的基本特性1．质粒及其命名2．质粒的种类3．质粒的复制类型4．质粒的分子生物学特征二、质粒的分离纯化方法1．氯化铯溴乙锭浮密度超速离心密度梯度分离法

（图3-3）2.Triton和PEG化学提取法3．煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质粒DNA4．碱变性法抽提质粒DNA

质粒的存在形式：呈共价闭合环状①超螺旋的SC构型（cccDNA）②松弛开环的OC型（ocDNA）③松弛线性的L构型（cDNA）基本步骤：细菌生长和质粒的扩增菌体收获和溶菌质粒纯化氯化铯浮密度分离法

当各种DNA分子在有饱和溴乙锭染料存在下进行氯化铯密度梯度离心时，与共价闭环状分子结合的染料要大大少于与开环状或线状DNA的结合，因此，在氯化铯梯度离心中质粒DNA与染料相结合后生成的条带是在较高的密度范围内，而断裂为线状的染色体DNA与溴乙锭结合较多，生成的条带是低密度范围。所以，离心后形成2条带，上面的条带主要是染色体DNA及少量开环状质粒DNA，下面的带则是共价闭合环状质粒DNA。

碱变性法抽提质粒DNA

该法也是一种快速抽提质料DNA的方法。其分离原理，大肠杆菌的染色体约有4700KB长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的PH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链便分离成单链，而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢链被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当PH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。三、质粒载体的选择

作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件（1）能自主复制，即本身是复制子（2）具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；（3）在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征，（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。四、大肠杆菌质粒载体1．pSC101质粒载体2．pBR322质粒载体分别由pMB1(ori)、pSF2124(Ampr)和pSC101(Tetr)三种质粒通过载体改造后形成，使之具有松弛型ori和Ampr及Tetr两种抗性基因的理想的基因克隆载体。

Ampr

（Scal、PvuI、PstI切点）

Tetr

（EcoRI、Nhel、BamHI、SphI、HindIII切点）五、多种功能的衍生质粒的组建

（一）、带有不同种类抗性基因的质粒载体（二）、高拷贝数质粒pAT153（三）、正选择质粒（四）、多功能质粒-PUC质粒带有不同种类抗性基因的质粒载体pBR328是从pBR322改建成的质粒，大小为4.907kb,它具有Ampr、Tetr和Cmlr基因。Cmlr基因有EcoRI、PvuⅡ和BalI的单一酶切位点。除了pBR328外，pBR325也有类似结构。pAT153是由pBR322质粒改造而成，这种质粒的拷贝数比pBR322高1.5～3倍。它的大小是3.6kb,选择标记有氨苄青霉素抗性基因Ampr和四环素抗性基因Tetr、单一切点的限制性内切核酸酶有PvuⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、ScaⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ。正选择质粒pTR262是正选择质粒。在这种质粒中，在四环素的抗性基因（Tetr）前有λ噬菌体的PR启动子，同时在这种载体中还带有λ噬菌体编码CI蛋白质（阻遏物）的基因。没有外源基因插入时，由于CI蛋白质阻遏从PR进行的转录作用，因此对四环素不表现抗性。在CI蛋白质基因上有单一的HindⅢ和BclⅠ切点，若利用其中任何一个切点插入外源DNA片段，都可以使CI蛋白质基因功能丧失，结果PR激活Tetr基因表达；表现出对四环素的抗性，达到正选择的效果。第二节

噬菌体载体一、噬菌体的一般生物学特性二、λ噬菌体载体三、粘性质粒四、单链DNA噬菌体载体烈性噬菌体温和噬菌体溶源化细菌溶源化原噬菌体二、λ噬菌体载体（一）λDNA分子(1)λ噬菌体基因结构：如图3-11、3-12Cos位点（Cohesive-endsite）：λDNA为线状双链分子，两端各有12个碱基的单链互补粘性末端，通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。这种由粘末端结合形成的双链区段即Cos位点。(2)λ噬菌体DNA的复制（二）λ噬菌体的类型插入型载体替换型载体

(三)λ噬菌体载体的应用1.转染作用转染：由宿主细胞捕获噬菌体或病毒DNA的过程。转导：以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。转化：质粒等外源DNA引入细胞的过程。2.λDNA的体外包装（四）常用λ噬菌体凯伦噬菌体载体这类载体有插入型的，如Charon2；也有替换型的，如Charon30。在基因操作中用途很广。Charon载体上具有适当数量的限制酶切位点，带有来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ（中央区段）。插入基因经包装后，可通过蓝/白斑筛选阳性克隆。Charon载体的特点是容量大，对研究大范围内的染色体结构很有用处。三、粘性质粒

粘性质粒（Cosmid）带有λ噬菌体的Cos位点和整个pBR322的DNA顺序。经感染进入细菌细胞以后，它就好象质粒那样在细胞中进行复制。易环化和扩增。分子量小，可包装30-45kb外源基因，可由Ampr抗性筛选，常用于构建基因文库。在酵母细胞中常用的载体的共同特点这些载体，它们共同的特点是：（1）能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增；（2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。这些标记一般能和大肠杆菌相应的突变体互补，如Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。有些还携带用于大肠杆菌的抗菌素抗性标记；（3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。共有三种类型的载体，如图3-19。第三节

真核细胞的克隆载体一、在酵母细胞中克隆基因常用的载体（共同特点）

1.整合型载体（YIP）

2.复制型载体（YRP）

3.附加体型载体（YEP）二、植物基因克隆的载体——Ti质粒三、动物细胞基因克隆的载体整合型载体（YIP）YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。如Pyeleu10是由ColEI质粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段构成，在细菌中复制、扩增，进入酵母后可整合表达。YIP型载体的特点是转化率低(只有1-10转化子/微克DNA)，但转化子遗传性稳定稳定，多用于遗传分析工作。复制型载体（YRP）YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体（ShuttleVector），（如图3-20）穿梭载体在基因工程中广泛使用。YRP型载体转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失。附加体型载体（YEP）YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2µm质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2µm质粒，人们已经构建出许多YEP型载体。YEP型载体PYF92（如图3-21）就是由酵母的2µm质粒、pBR322质粒和酵母的His3+(组氨酸)基因构成的。YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105转化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也高（25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。载体载体（Vector）：能携带外源基因导入受体细胞，这种运载工具称载体。1.克隆载体:具组装、复制、扩增功能。如：pBR322、pUC18/19等。

2.表达载体:不仅具组装、复制、扩增功能，还有转录表达功能。如：pBV220、pKK223-33.载体的种类：质粒、噬菌体衍生物（COS、M13）、动物病毒。共同特征：①自主复制②易于扩增分离纯化③有非必需区④有单一酶切位点（多克隆位点）单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点⑤有选择标记基因⑥表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列）质粒本质是细菌染色体以外的遗传物质，是一种简单的，环状DNA分子，能自主复制。命名：前一个小写p代表质粒，后两个大写英文字母代表发现者或实验室，数字代表编号，如pBR322质粒。种类：F质粒：使宿主染色体上的基因通过性菌毛随其一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。R质粒：抗性因子，携有一种或多种抗生素抗性基因转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。Col质粒：有编码大肠杆菌素基因质粒的类型和特性传递类型：①接合型：含有自主转移基因，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。如：F质粒、部分R、Col质粒②非接合型：不含有自主转移基因，质粒不能自主从一个细胞转移到另一个细胞。如：部分R、Col质粒（安全常用）复制类型：①严紧型：低拷贝1-3个拷贝/菌②松弛型：高拷贝10-60个拷贝/菌特性：自主复制、转移、选择标记遗传特性、不相容性（同者相斥、异着共存）、分配功能（亲代子代）特性：CopA和CopB基因1.复制：负调控

RI质粒：repA基因表达复制PSC101：正调控是由ori复制子向左单向复制2.不相容性；在同一细胞中，同类质粒不能并存的现象。PUC18PUC19分配功能：质粒复制后，随细胞分裂的进行，质粒分配到子细胞中。Triton和PEG化学提取法Triton和PEG处理法，此法简单，不用昂贵的氯化铯，不必长时间的超速离心，费用较低，分离效果也很好，此法大体过程如下：培养菌体并加入氯霉素使质粒扩增→离心沉淀菌体。在TE缓冲液中悬浮→加入溶菌酶和去污剂Triton部分裂解菌体→35000r/min离心除去菌体，留上清液→上清液用酚处理除去蛋白质→用乙醇初步沉淀DNA→将DNA悬浮于TE缓冲液中→加聚乙二醇（PEG6000），在4℃下过夜→10000r/min离心15分钟→DNA沉淀悬浮后再用乙醇沉淀→将DNA沉淀悬浮即得到提纯的质粒DNA。煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质粒DNA该法简便迅速，是实验室中制备小量质粒DNA时常用的一种方法。将菌液移入1.5ml塑料管，离心去上清，先用Triton和新鲜配制的溶菌酶处理细胞，100℃加热60秒种裂解细菌细胞。将裂解液放置冰浴2分钟，离心5分钟，根据不同的复性特性，从而去除染色体DNA及细胞碎片。然后用酚氯仿抽提上清去除蛋白质，再加入异丙醇，置于室温20-30分钟，离心取沉淀，70%乙醇洗两次，最后悬浮于TE，即为提纯的质粒DNA。根据实验要求，亦可省去酚：氯仿抽提步骤，使实验在2小时内完成。多功能质粒-PUC质粒多功能质粒-PUC质粒是由pBR322改建成的带有LacZ基因的PUC质粒。LacZ上有多克隆位点，插入外源基因后在X-gal平板上使原先的蓝斑变成白斑。插入型载体在λimm434区有EcoRI单一酶切位点便于外源DNA插入的称为插入型载体。λgt10（CI)λgt11(LacZ)若CI插入外源基因溶菌透明噬斑若不插入外源基因溶源混浊斑若LacZ插入基因IPTG/X-gal平板有白斑若LacZ无插入基因IPTG/X-gal平板有蓝斑

替换型载体在λNM781/791/762替换型载体的SupE基因中可致使宿主菌lacZ琥珀突变，在该基因中具有成对的EcoRI限制酶位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被插入的外源DNA片段所取代，亦称取代型载体。由于上述λ噬菌体的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变被抑制,所以能在乳糖麦康基氏(McConkey)琼脂培养基上产生红色的噬菌斑,或是在X-gal琼脂培养基上产生蓝色的噬菌斑。但如果supE基因的EcoRI区段被外源DNA所取代，那么形成的重组体噬菌体只能产生出白色的噬菌斑。可方便地筛选出阳性克隆。如图3-15单链DNA噬菌体载体M13单链DNA噬菌体为细线状DNA，呈单链环状包装在线状蛋白外壳中。载体有多聚接头，可进行LacZ插入失活白斑筛选。可应用于克隆基因，