五虎活血贴膏的制备和质量评价

五虎活血贴膏的制备和质量评价【摘要】目的：以成方制剂五虎散为主要功效成分，制备一款活血化瘀，消肿止痛贴膏，并对其进行评价。方法：通过黏力和感官评价筛选基质配方中骨架材料、黏合剂、交联调节剂的种类；通过单因素试验和正交试验确定骨架材料、黏合剂、交联剂和交联调节剂用量；通过黏性测定感官评价确定基质的添加顺序和最大载药量；通过鸡胚绒毛尿囊膜试验对贴膏进行刺激性评价。通过比色法测定贴膏中总黄酮含量；结果：得到的基质配方中骨架材料确定为聚丙烯酸钠NP-700，黏合剂为卡波姆980，交联调节剂为柠檬酸，保湿剂为甘油；烘干前膏体总重为44.07g，其中聚丙烯酸钠3.50g，卡波姆0.22g，溶胀于22g去离子水中，甘羟铝0.25g，柠檬酸0.1g，溶于1g去离子水中，甘油16g，载药量1g；总黄酮含量1.5840mg/g。结论：制得的五虎活血贴膏具有较好的黏性和成型性，安全无刺激、稳定性好。【关键词】五虎散；贴膏；正交试验；总黄酮；质量评价

PreparationandQualityEvaluationofWuhuHuoxuePlaster[Abstract]Objective:Toprepareablood-activatingandstasis-resolving,detumescenceandpain-relievingplasterwithWuhuPowderasthemainfunctionalcomponent,andtoevaluateit.Methods:Thetypesofskeletonmaterials,adhesivesandcrosslinkingregulatorsinthematrixformulaweredeterminedbysinglefactortest.Theamountofskeletonmaterial,adhesive,crosslinkingagentandcrosslinkingregulatorwasdeterminedbysinglefactorexperimentandorthogonalexperiment.Theadditionorderandmaximumdrugloadingofthematrixweredeterminedbysensoryevaluationofviscositydetermination.Theirritationofthepastewasevaluatedbychickembryochorioallantoicmembranetest.Thecontentoftotalflavonoidsinthepastewasdeterminedbycolorimetry;Results:Inthematrixformula,theskeletonmaterialwasdeterminedtobeNP-700,thebinderwascarbomer980,thecrosslinkingregulatorwascitricacid,andthemoisturizerwasglycerin.Thetotalweightofthepastebeforedryingwas44.07g,ofwhichNP-7003.50g,carbomer0.22g,swellingin22gdeionizedwater,aluminumglycinate0.25g,citricacid0.1g,dissolvingin1gdeionizedwater,glycerol16g,drugloading1g.Thecontentoftotalflavonoidswas1.5840mg/g.Conclusion:ThepreparedWuhuHuoxuePlasterhasgoodviscosityandformability,safeandnon-irritating,andgoodstability.[Keywords]WuhusanpasteOrthogonaltestTotalflavonoidsQualityevaluatio目录TOC\o"1-3"\h\u1前言 前言1.1软组织损伤现代医学认为急性软组织损伤为外力对机体的直接和间接影响，引起皮肤，皮下结缔组织，关节爽，筋膜血管和周围神经及其他软组织的损害。引起局部炎症反应导致局部出现红肿热痛反应。软组织损伤中医理论辨证属淤症，多由局部受到外伤而引起，局部挫伤可使皮肤，皮下组织与肌肉破裂，炎症与瘢痕痊愈，进而引起肢体疼痛与功能障碍，临床上以局部肿胀和疼痛为主。调查显示软组织损伤高发，在体育院校，运动员，一般军事训练和其他人群尤为多见。现代医学治疗软组织损伤以对症处理为主，其目的在于限制内部血肿，缓解疼痛，然后辅以抗炎治疗。但中医治疗手段较重视，早期行气活血，消肿止痛，中期缓解疼痛，舒筋活络，晚期则以补益气血，培肝补肾。而本文所研究的五虎活血贴膏则是以活血祛瘀、消肿止痛为主。1.2五虎散主要成分红花为菊科植物红花CarthamustinctoriusL的干燥花始载于《开宝本草)性温，味辛，归心、肝经REF_Ref25271\w\h[1]。文献报道红花中含有醇类、木脂素类、有机酸类、生物碱类、黄酮类及快类等诸多化学成分REF_Ref25440\w\h[2]；当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv)Diels的干燥根，始载于《农本草经》，性温，味甘、辛，归肝、心、脾经REF_Ref25538\w\h[3]。主要含有黄酮类、氨基酸、挥发油、有机酸、多糖类等[4,5]；防风为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz)Schischk.的干燥根，始载于《神农本草经》，性微温，味辛、甘，归膀胱、肝、脾经REF_Ref25659\w\h[6]。防风中所含的化学成分较多，相关学者从防风中分离出包括防风色酮醇.麻素昔、香豆素类、挥发油类和多糖等100多种化合物REF_Ref25692\w\h[7]；白芷为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.exHofm.)Benth.etHookf.或杭白Angelicadahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.etHookfvarformosana(Boiss.)ShanetYuan的干燥根，始载于《神农本草经》，性温，味辛，归胃、大肠、肺经REF_Ref25734\w\h[8]。白芷的化学成分有香豆素类、挥发油类及生物碱、微量元素等；天南星ArisaemaRhizoma为天南星科天南星属植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.Schott)、异叶天南星A.heterophyllumB1.或东北天南星A.amurenseMaxim的干燥块茎，其味苦、辛，性温，归肺、肝、脾经。天南星的化学成分有生物碱类、黄酮类、苯丙素、木脂素及苯环衍生物、甾体和萜类、苷类和酯类等[9-11]。1.3五虎散研究现状五虎散由以上五种中药材组成，是一种具有活血散瘀、消肿止痛等功效的中药，用于跌打损伤、瘀血肿痛的治疗REF_Ref25881\w\h[12]。临床常用以治疗外伤性淤血肿痛，以及风湿性肢体疼痛等症，效果良好REF_Ref25917\w\h[13]。杨嘉等人通过采用凝血筛选实验，使用人体血浆对五虎散进行实验研究，发现其有明显的抗凝作用REF_Ref25976\w\h[14]。活血化瘀药具有抗凝作用，抗凝作用是活血化淤药取得疗效的可能途径之一。牟天REF_Ref26009\w\h[15]等人通过临床研究用五虎散外敷加以宣痹达经汤内服达到治疗内风湿性关节炎的作用；何康乐REF_Ref26038\w\h[16]等人研究发现五虎散外贴对肩周炎肩关节活动功能改善的作用；五虎散在民间应用颇多，在临床实验中也得到良好的验证，其中包括吕中REF_Ref26071\w\h[17]所记载的此方治愈很多伤科患者，何康乐REF_Ref26100\w\h[18]治疗陈旧踝部损伤153例，毛小华REF_Ref26126\w\h[19]治疗急性腰扭伤74例等。目前市场上对五虎散的应用主要有九旭的五虎口服液，在临床上应用广泛，主要用于活血散瘀和消肿止痛，对于皮下软组织淤血或者跌打损伤引起的疼痛感，都能起到辅助恢复的作用；同仁堂的五虎散，保留了原剂型，口服或与白酒调和敷于患处，同用于治疗瘀血肿痛，活血化瘀。本课题对五虎散在凝胶贴膏的应用作研究，符合现代外用制剂发展的潮流趋势。1.4凝胶贴膏研究现状凝胶膏剂的前身为20世纪70年代末，日本发明的泥剂剂型，后经广大科研工作者们研究，在此基础上逐渐衍生出了凝胶贴膏剂。引入我国后被广泛使用，2000和2005版《中国药典》称其为巴布剂，后在2010版中正式更名为凝胶贴膏剂。与传统的贴膏不同的是，凝胶贴膏剂主要由基质和所载药物组成，基质常用亲水性高分子材料，选定基质后，再将其与药物一起炼合，最后涂布于合适材料上制备而REF_Ref26162\w\h[20]。1.5研究目的与意义以红花、当归、白芷、防风、天南星为主要活血作用成分，添加到骨架材料为NP-700、黏合剂为卡波姆980、交联剂为甘羟铝、交联调节剂为柠檬酸，保湿剂为甘油的基础配方中，结合现代凝胶贴膏的便捷性，制备一款黏附力好、稳定性强、安全无毒、无刺激性的贴膏剂。符合现代人安全、便捷用药的需求。1.6研究内容与方法通过初黏力，持黏力和感官评价，确定基质配方中骨架材料、黏合剂、交联调节剂的种类；通过单因素试验考察骨架材料、黏合剂、交联剂和交联调节剂用量范围；以初黏力，持黏力和感官评价为评分指标，通过正交试验筛选出各类基质用量的最佳配比；通过初黏力测定和感官评价考察基质的添加顺序；通过初黏力、持黏力、膏体透明度、膜残留度和均匀性考察贴膏最大载药量；通过通过性状考察、含膏量、耐寒耐热试验、赋形性、黏附力、鸡胚绒毛尿囊膜试验和比色法测定贴膏中总黄酮含量，对五虎活血贴膏进行质量评价。

2实验部分2.1主要试剂与仪器2.1.1实验试剂表1实验试剂试剂名称级别生产厂家红花安徽协和成药业饮片有限公司当归陇西奇正药材有限公司防风四川新荷花中药饮片股份公司白芷安徽协和成药业饮片有限公司制天南星四川新荷花中药饮片股份公司聚丙烯酸钠NP-700(NP-700)工业级华南生物科技有限公司黄原胶食品级广东建达生物科技有限公司西黄芪胶食品级广东建达生物科技有限公司卡波姆980食品级江苏鸿诗生物科技有限公司甲基纤维素分析纯泰安瑞纤维素有限公司羧甲基纤维素钠（CMC-Na）分析纯天津市大茂化学试剂厂聚乙烯醇化妆品级山东优索化工科技有限公司酒石酸分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司柠檬酸分析纯天津市福晨化学试剂产甘羟铝分析纯华夏生物科技有限公司甘油分析纯广东光华化学厂有限公司亚硝酸钠分析纯广州化学试剂厂硝酸铝分析纯广州化学试剂厂氢氧化钠分析纯天津市大茂化学试剂厂芦丁分析纯上海源叶生物科技有限公司2.1.2实验仪器表2实验仪器仪器名称型号生产厂家紫外可见分光光度计L8上海天美科学仪器有限公司恒温水浴锅HWS26上海一恒科学仪器有限公司初黏力测试仪HG-810东莞市华国精密仪器有限公司持黏力测试仪HG-820东莞市华国精密仪器有限公司电子分析天平BP211D德国赛多利斯孵化器HHD32S豪华德电器制造源头厂家2.1贴膏剂的评价指标2.1.1初黏力的测定用《中国药典》(2020版)（四部）通则测定初黏力法。制备好的贴膏于25℃、相对湿度55%条件下放置2h，撕下盖衬后铺于与水平面成15度的不锈钢板中央，膏面朝上，中间留出5cm膏面长度，将钢球由顶端自由下落。记录贴膏可以黏住的最大钢球号。按20号钢球为满分，19号钢球为满分的19/20，依次类推。2.1.2持黏力的测定用《中国药典》(2020版)（四部）通则测定初黏力法。制备好的贴膏于25℃、相对湿度55%条件下放置2h，撕下盖衬后贴于试验板和加载板的中部，用2kg的压辊在贴膏上来回滚压3次，静置20min后，上端固定于试验架上，下端悬挂200g砝码，记录贴膏脱落的时间。确定最大值1h以上为满分，其余与之相比（测得值/最大值）×满分的评分计算。2.2初步处方的确定根据实验室现有的基质种类，结合文献中处方比例，通过实验室前期预实验，确定一个初步处方为：NP-7002.55g为骨架材料，卡波姆0.22g作为增稠剂，甘羟铝0.2g作为交联剂，酒石酸0.14g作为交联调节剂，甘油16g作为保湿剂，蒸馏水23g。2.3骨架材料种类的筛选选取NP-700、西黄芪胶、西黄芪胶、黄原胶作为骨架材料进行考察，其他按照初步处方制备凝胶贴膏。按初黏力（40分），持黏力（30分）和感官评价（30分）进行评分，感官评价指标包括膜残留度（15分）、表面光滑度（10分）、基质色泽（5分），如表3所示，完成评价并计算评分结果，筛选骨架材料的种类。表3骨架材料筛选感官评价标准感官指标评分细则膜残留度反复揭帖后皮肤上无黏连、膏体无变形（11-15）反复揭帖皮肤上有少许残留、膏体轻微变形（6-10）反复揭帖大量膏体残留皮肤、膏体脱落（0-5）表面光滑度膏体表面平坦、光滑（7-10）膏体表面有少量凹凸不平（4-6）膏体表面凹凸不平（0-3）基质色泽基质纯白、通透（4-5）基质较白、不浑浊（2-3）基质发黄、浑浊（0-1）2.4黏合剂种类的筛选选取卡波姆980、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇作为黏合剂进行考察，其他按照初步处方制备凝胶贴膏；按初黏力（40分），持黏力（30分）和感官评价（30分）进行评分，感官评价指标包括膜残留度（10分）、皮肤追随性（15分）、均匀性（5分），如表4所示，完成评价并计算评分结果，筛选黏合剂的种类。表4黏合剂筛选感官评价标准感官指标评分细则膜残留度反复揭帖后皮肤上无黏连、膏体无变形（7-10）反复揭帖皮肤上有少许残留、膏体轻微变形（4-6）反复揭帖大量膏体残留皮肤、膏体脱落（0-3）皮肤追随性贴膏贴于手腕背部，用力甩不脱落。（11-15）贴膏贴于手腕背部，用力甩易脱落。（6-10）贴膏贴于手腕背部，轻甩易脱落。（0-5）均匀性膏体质地均匀、无结块颗粒、无气泡、表面有光泽（4-5）膏体质地较均匀，有个别白色结块颗粒或气泡（2-3）膏体质地不均匀，有大量结块或空洞气泡，表面凹凸不平（0-1）2.5交联调节剂种类的筛选选取酒石酸、柠檬酸作为交联调节剂进行考察，其他按照初步处方制备凝胶贴膏；按初黏力（40分），持黏力（30分）和感官评价（30分）进行评分，感官评价指标包括表面光滑度（5分）、皮肤追随性（10分）、渗布程度（15分），如表5所示，完成评价并计算评分结果，筛选黏合剂的种类。表5交联调节剂筛选感官评价标准感官指标评分细则表面光滑度膏体表面平坦、光滑（4-5）膏体表面有少量凹凸不平（2-3）膏体表面凹凸不平（0-1）皮肤追随性贴膏贴于手腕背部，用力甩不脱落。（7-10）贴膏贴于手腕背部，用力甩易脱落。（4-6）贴膏贴于手腕背部，轻甩易脱落。（0-3）渗布性完全无渗布（11-15）轻微渗布（6-10）渗布量大（0-5）2.6基质添加顺序的考察查阅文献和初步实验结果所得，确定基本处方为高分子骨架材料：NP-7002.55g；黏合剂：卡波姆9800.22g；交联剂：甘羟铝0.2g；交联调节剂：酒石酸0.10g；保湿剂：甘油16g；蒸馏水23g。卡波姆980需要充分溶胀于水中，作为A相，而甘羟铝、NP-700、可以较好得溶解于甘油中，搭配甘油作为B相，酒石酸易溶于水中，作为C相。选取B+A+C，B+C+A，A+B+C的基质添加顺序进行考察。按初黏力（40分）、感官评价（60分）作为评价指标，对不同基质添加顺序制备的贴膏进行评价，择优确定基质添加顺序。2.7单因素试验确定基质用量范围2.7.1NP-700用量考察准确称取0.65g、1.60g、2.55g、3.50g的NP-700，其余基质用量不变，按照2.6中基本处方和最优基质添加顺序制备凝胶贴膏。按初黏力（15分），持黏力（15分）和感官评价（70分）进行评分，感官评价指标包括均匀性(20分)、膜残留度（20分）、赋形性（30分），完成评价并计算评分结果，确定NP-700的用量范围。均匀性：膏体是否均匀，表面是否光滑，分为表面均匀光滑、有凹凸、凹凸不平严重对应20、14、7分。膜残留度：膏体揭离皮肤时是否无残留，反复揭开，黏贴于手腕背部，重复3次，末次观察有无残留，分为无残留、少量残留、残留，对应20、14、7分。赋形性：膏体形态稳定，不易变形，用手指触摸，无膏体黏连至拉丝，分为不变形、有少量黏连和拉丝、大量黏连和拉丝,对应30、20、10分。2.7.2卡波姆980用量考察准确称取0.10g、0.16g、0.22g、0.28g、0.34g的卡波姆980，其余基质用量不变，按照2.6中基本处方和最优基质添加顺序制备凝胶贴膏。按初黏力（15分），持黏力（25分）和感官评价（60分）进行评分，感官评价指标包括均匀性（20分）、皮肤追随性（25分）、膜残留度（15分），完成评价并计算评分结果，确定卡波姆980的用量范围。均匀性：膏体是否均匀，表面是否光滑，分为表面均匀光滑、有凹凸、凹凸不平严重对应20、14、7分。皮肤追随性：将成型凝胶膏剂贴于手腕背部,用力甩10下不脱落,分为不脱落、不易脱落、易脱落，对应25、16、8分。膜残留度：膏体揭离皮肤时是否无残留，反复揭开，黏贴于手腕背部，重复3次，末次观察有无残留，分为无残留、少量残留、残留，对应15、10、5分。2.7.3甘羟铝用量的考察准确称取0.10g、0.15g、0.20g、0.25g、0.30g的甘羟铝，其余基质用量不变，按照2.6中基本处方和最优基质添加顺序制备凝胶贴膏。按初黏力（30分），持黏力（25分）和感官评价（45分）进行评分，感官评价指标包括膜残留度（25分）、均匀性（20分），完成评价并计算评分结果，确定甘羟铝的用量范围。膜残留度：膏体揭离皮肤时是否无残留，反复揭开，黏贴于手腕背部，重复3次，末次观察有无残留，分为无残留、少量残留、残留，对应25、16、8分。均匀性：膏体是否均匀，表面是否光滑，分为表面均匀光滑、有凹凸、凹凸不平严重对应20、14、7分。2.7.4柠檬酸用量考察准确称取0.6g、1g、1.4g、1.8g的柠檬酸，其余基质用量不变，按照2.6中基本处方和最优基质添加顺序制备凝胶贴膏。以初黏力和感官评价作为评价指标，对不同用量柠檬酸制备的五虎活血贴膏进行评价，确定柠檬酸的用量范围。2.7.5甘油用量考察准确称取10g、13g、16g、19g、22g的甘油，其余基质用量不变，按照2.6中基本处方和最优基质添加顺序制备凝胶贴膏。按初黏力（20分），持黏力（15分）和感官评价（30分）进行评分，感官评价指标包括膜残留度（40分）、均匀性（15分）、表面光泽度（10分），完成评价并计算评分结果，确定甘油的用量范围。膜残留度：膏体揭离皮肤时是否无残留，反复揭开，黏贴于手腕背部，重复3次，末次观察有无残留，分为无残留、少量残留、残留，对应40、26、13分。均匀性：膏体是否均匀，表面是否光滑，分为表面均匀光滑、有凹凸、凹凸不平严重对应15、10、5分。2.8正交试验优化凝胶贴膏的配方结合单因素试验结果，选用甘油（A）、NP-700（B）、甘羟铝（C）、卡波姆980（D）4种基质，每种基质均设置3个水平，见下表6设计L9（34）正交设计因素水平表。按初黏力（35分），持黏力（20分）和感官评价（45分）进行评分，感官评价指标包括均匀性（10分）、膜残留度（10分）、皮肤追随性（10分）、涂展性（5分）、渗布程度（10分），如表7所示，完成评价并计算评分结果，筛选出最优的凝胶贴膏处方。表6L9（34）正交设计因素水平表水平因素A甘油/gBNP-700/gC甘羟铝/gD卡波姆/g1121.60.150.162142.550.20.223163.50.250.28

表7正交优化试验感官评价的评分指标感官指标评分细则均匀性膏体质地均匀、无结块颗粒、无气泡、表面有光泽（7-10）膏体质地较均匀，有个别白色结块颗粒或气泡（4-6）膏体质地不均匀，有大量结块或空洞气泡，表面凹凸不平（0-3）膜残留度反复揭帖后皮肤上无黏连、膏体无变形（7-10）反复揭帖皮肤上有少许残留、膏体轻微变形（4-6）反复揭帖大量膏体残留皮肤、膏体脱落（0-3）皮肤追随性贴膏贴于手腕背部，用力甩不脱落。（7-10）贴膏贴于手腕背部，用力甩易脱落。（4-6）贴膏贴于手腕背部，轻甩易脱落。（0-3）涂展性膏体容易涂展（4-5）膏体易涂展（2-3）膏体不能涂布（0-1）渗布性完全无渗布（7-10）轻微渗布（4-6）渗布量大（0-3）2.9载药量的选择根据最终优化的处方，考察不同载药量时，五虎活血贴膏的性能，以载药量0.6g、0.8g、1.0g、1.2g、1.4g为考察变量。按初黏力（40分），感官评价（60分）进行评分，感官评价指标包括膜残留度（15分）、膏体透明度（25分）、均匀性（20分），如表8所示，完成评价并计算评分结果，选择合适的载药量。表8载药量选择的评分指标感官指标评分细则膜残留度反复揭帖后皮肤上无黏连、膏体无变形（11-15）反复揭帖皮肤上有少许残留、膏体轻微变形（6-10）反复揭帖大量膏体残留皮肤、膏体脱落（0-5）膏体透明度膏体透明，不溶物少（17-25）膏体有少量条絮状不溶物（9-16）膏体有大量颗粒状、团状不溶物（0-8）均匀性膏体质地均匀、无结块颗粒、无气泡、表面有光泽（14-20）膏体质地较均匀，有个别白色结块颗粒或气泡（8-13）膏体质地不均匀，有大量结块或空洞气泡，表面凹凸不平（0-7）2.10五虎活血贴膏配方与制备工艺通过筛选确定基质配方中骨架材料、黏合剂、交联调节剂的种类；通过单因素试验和正交试验确定骨架材料、黏合剂、交联剂和交联调节剂具体用量；通过黏性测定感官评价确定基质的添加顺序和最大载药量；2.11五虎活血贴膏的质量评价2.11.1性状考察在室内明亮柔和光线下观察三个不同批次的五虎活血贴膏，对其膏面外观均匀性、渗布性、基质色泽、气味等，判断其质量。2.11.2含膏量测定用2020版《中国药典》含膏量检查法，取3个不同批次五虎活血贴膏，撕下盖衬，称定背衬与膏体总重量，置烧杯中，倒入适量蒸馏水，使之没过贴膏，于电炉上加热煮沸，至背衬与膏体分离完全后，将背衬取出，用清水清洗至背衬无残余膏体，高温100℃下干燥30min，取出放冷后称定其质量，损失重量为膏重。2.11.3稳定性考察（1）耐热稳定性参照2020年版《中国药典》橡胶贴膏耐热性检查法，取3个不同批次五虎活血凝胶贴膏，除去盖衬，将贴膏置于60℃的温度下加热2h,自然冷却至室温后，检查背衬材料是否渗膏体、漏膏现象、膏体表面是否光滑、是否有黏性。（2）耐寒稳定性取3个不同批次五虎活血凝胶贴膏，除去盖衬，将贴膏置于-10℃的冰箱冷冻室中24h,取出恢复室温后，将样品与常温放置的样品进行比较，观察膏体表面是否光滑，是否有黏性。2.11.4赋形性测定取3个不同批次五虎活血凝胶贴膏，除去盖衬，置37℃、相对湿度60%的恒温恒湿箱30min，取出，用夹子将供试品固定在一平整钢板上，钢板与水平面的倾斜角为60度，放置24h，观察膏面是否有流淌现象。2.11.5黏附力测定取3个不同批次五虎活血凝胶贴膏，除去盖衬，按照2.11下初黏力测试方法测定贴膏的黏附力，记录贴膏可以黏住的最大钢球号。2.11.6总黄酮含量测定试剂准备5%亚硝酸钠溶液：称取5.0g亚硝酸钠（NaNO2），去离子水稀释并定容至100mL容量瓶中。10%硝酸铝溶液：称取10.0g硝酸铝（Al(NO3)3•9H2O），去离子水稀释并定容至100mL容量瓶中。4%氢氧化钠试液：称取4.0g氢氧化钠（NaOH），去离子水稀释并定容至100mL容量瓶中。0.2mg/mL芦丁对照品溶液：称取20mg芦丁对照品，70%乙醇稀释并定容至100mL容量瓶中。芦丁对照品标准曲线制备精密称取芦丁对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0置25mL容量瓶中，加水至10mL，加入5%亚硝酸钠溶液1mL，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，得以0.0mL对照品溶液制得的溶液为空⽩，在波长510nm处测定吸光度值。以对照品浓度为横坐标(mg/mL)，吸光度为纵坐标(A)，绘制标准曲线。样品溶液的测定按2.8项下最优处方和工艺制备五虎活血贴膏，精密刮取膏体10g，置于锥形瓶中，加50mL70%乙醇，超声30min，放冷，浸泡至膏体变白色，溶剂颜色不再加深，用45μm滤头滤过，准确移取滤液10mL于25mL容量瓶中。加入5%亚硝酸钠溶液1mL，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加⽔⾄刻度，摇匀，放置15min。按2.8项下最优处方和工艺制备空白凝胶膏剂，其余处理与供试品溶液相同，所得溶液做空白对照，在波长510nm处测定吸光度值。根据结果计算样品中总黄酮的含量。2.11.7鸡胚绒毛尿囊膜试验将7天以内的受精鸡胚于37.5℃（±0.5℃）、相对湿度55%～70%的培养箱中培养9d。用牙科锯齿弯镊剥去气室位置的蛋壳，暴露白色蛋膜，滴加0.3mL0.9%氯化钠溶液湿润蛋膜后用镊子小心撕掉内膜,保证血管膜不受损。参考SN/T2329-2009《化妆品眼刺激性／腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验》[21]，采用终点评价法，取3g五虎活血贴膏样品涂布于保鲜膜，覆盖于CAM膜上，使之与五虎活血贴膏样品直接接触。作用３min后，揭开保鲜膜，30S后观察每种毒性效应变化程度，平行6次。以质量分数为0.9%的氯化钠溶液作为阴性对照，以0.1mol/L氢氧化钠溶液作为阳性对照，设置对照组。根据（公式1）计算五虎活血贴膏样品终点评分（ES），根据（公式2）计算对照组刺激评分（IS）。并根据表10评价五虎活血贴膏样品的刺激性，根据表11评价对照组的刺激性结果保留小数点后2位：ES=（公式1）IS=（公式2）式中：secH——CAM出现出血的平均时间（s）secL——CAM出现血管融解的平均时间（s）secC——CAM出现凝血的平均时间（s）表9终点评分法结果评价刺激评分刺激性分类ES＜12无/轻刺激性12≤ES＜16中度刺激性16≤ES强刺激性/腐蚀性表10刺激评分法结果评价刺激评分刺激性分类IS＜1无刺激性1≤IS＜5轻刺激性5≤IS＜10中度刺激性10≤IS强刺激性/腐蚀性

3结果与讨论3.1骨架材料种类的筛选结果骨架材料种类的筛选结果如表11所示，可以看出NP-700的初黏力、持黏力表现均比黄原胶和西黄芪胶要好，且膜残留度、表面光滑度和基质色泽外观评分均优于黄原胶和西黄芪胶，因此选择骨架材料为NP-700。表11骨架材料种类筛选结果骨架材料初黏力持黏力膜残留度表面光滑度基质色泽总分NP-7002210157559黄原胶26065340西黄芪胶1001233283.2黏合剂种类筛选结果黏合剂种类的筛选结果如表12所示，卡波姆980、甲基纤维素和CMC-Na的初黏力和持黏力大小相当，均优于聚乙烯醇，而相比于甲基纤维素和CMC-Na,卡波姆980在膜残留度、皮肤追随性和均匀性的评分总最高，因此选用卡波姆980作为黏合剂。表12黏合剂种类筛选结果黏合剂初黏力持黏力膜残留度皮肤追随性均匀性总分卡波姆9802210815459甲基纤维素2210814256CMC-Na2210913458聚乙烯醇184772383.3交联调节剂种类筛选结果交联调节剂种类的筛选结果如表13所示，作为交联调节剂，与酒石酸相比，加入柠檬酸的膏体初黏力与持黏力均优于酒石酸，但渗布现象稍逊于酒石酸，在表面光滑度与皮肤追随性上评分均高于酒石酸，综合选择柠檬酸作为交联调节剂。表13交联调节剂种类筛选结果交联调节剂初黏力持黏力表面光滑度皮肤追随性渗布性得分酒石酸1610391351柠檬酸26304139823.4基质添加顺序考察结果交联调节剂种类的筛选结果如表14所示，以添加顺序为B+A+C、A+B+C制得的贴膏，膏体均匀，较易搅拌和涂布，但B+A+C添加顺序制得的贴膏存在少量颗粒，且初黏力表现不如A+B+C添加顺序制得的膏体，因此综合选用A+B+C的添加顺序为本实验其质的添加顺序。即甘油相和柠檬酸先后加入溶胀好的卡波姆980中。表14基质添加顺序考察结果添加顺序钢球大小感官评价B+A+C12号膏体均匀，较易搅拌，较易涂布，少量颗粒，无残留B+C+A11号膏体不均匀，不易搅拌，难以涂布，少量颗粒，无残留A+B+C13号膏体均匀，较易搅拌，较易涂布，无颗粒，无残留3.5单因素试验确定基质用量范围结果3.5.1NP-700用量考察结果NP-700用量考察结果如表15所示，当NP-700的用量少于1.6g时，制得的膏体流动性大，赋形性差，有大量膜残留，当其用量大于3.5g时，制得的膏体表面不均匀且难以涂布，综合选用1.6g、2.55g、3.5g作为其正交试验的水平。表15NP-700用量考察结果NP-700/g初黏力持黏力均匀性膜残留度赋形性得分0.651101606331.613316812522.55158131623753.5141541825763.5.2卡波姆980用量考察结果卡波姆980用量考察结果如表16所示，当卡波姆980的用量少于0.28g时，制得的膏体黏力逐渐增大，当其用量大于0.28g时，黏性稍有下降，且膏体表面不平整，综合选用0.16g、0.22g、0.28g作为其正交试验的水平。表16卡波姆980用量考察结果卡波姆/g初黏力持黏力均匀性皮肤追随性膜残留度总分0.1131517188710.161419171910790.221420162011810.281524121812810.34142571812763.5.3甘羟铝用量考察结果甘羟铝用量考察结果如表17所示，在一定范围内，随着甘羟铝用量增多，膏体的成型性和黏性增强，但随着用量增加的同时，均匀性也在下降，膏面表面不平整，综合选用0.15g、0.20g、0.25g作为其正交试验的水平。表17甘羟铝用量考察结果甘羟铝/g初黏力持黏力膜残留度均匀性总分0.12331218550.152471516620.224252015840.252622312620.3024212310783.5.4柠檬酸用量考察结果柠檬酸用量考察结果表明，用量为0.6g、1g、1.4g、1.8g时，外观无明显区别，可黏住的钢球大小分别为11号、13号、13号、12号。1g和1.4g用量时黏性表现最佳，考虑到降低损耗，综合选用1g为配方的具体用量。3.5.5甘油用量考察结果甘羟铝用量考察结果如表18所示，随着甘油用量增加，膏体表面越光滑，色泽越好，初黏力增强；同时，膏体内聚力变差，持黏力有所下降，膜残留度增加。因此，综合选用12g、14g、16g作为其正交试验的水平。表18甘油用量考察结果甘油/g初黏力持黏力膜残留度均匀性表面光泽度得分1011153855741313123497751617924108681918216119562219158129493.6正交试验优化凝胶贴膏的配方结果4个因素的极差R值结果为：RB>RA>RC>RD，如表19-20所示，因此4个因素对贴膏的影响程度为：B>A>C>D，即4种基质材料的影响程度为：NP-700>甘油>甘羟铝>卡波姆980。根据Ki值结果，可得出较优组合为A3B3C3D2，即甘油16g、NP-7003.50g、甘羟铝0.25g、卡波姆9800.22g。表19正交试验优化凝胶贴膏的配方结果编号初黏力持黏力均匀性膜残留性皮肤追随性涂展性渗布性得分126103294256223156934107032317593410714257464435352613773456562115693456373354384057832119374470932138974679表20L9（34）正交设计试验结果编号ABCD总分111115621232703132371421335352221656231263731225783213709333179K165.6755.3363.0066.67K260.3368.3364.3367.67K368.6771.0067.3364.67R8.3315.674.333.00验证试验：综合正交试验结果，确定最优处方为甘油16g、NP-7003.50g、甘羟铝0.25g、卡波姆9800.22g。柠檬酸0.1g，按照2.6中最优基质添加顺序制备3批五虎活血贴膏，进行验证试验。结果如表21，所制得凝胶膏剂黏性好，外观均匀,皮肤追随性好,无膜残留。表21正交设计验证结果编号初黏力持黏力均匀性膜残留度皮肤追随性涂展性渗布性总分1331599746832331589746823331799746853.7载药量考察结果载药量考察结果如表22所示，随着载药量增大，贴膏的外观性能下降，不利于凝贴膏的成型，但药粉用量过少达不到治疗效果，由最大载药量原则，综合确定凝胶贴膏载药量为1.0g。表22载药量考察结果药粉/g初黏力膜残留度膏体透明度均匀性得分0.63872218850.84082016841.04091814811.2409169741.4389137673.8五虎活血贴膏的配方与制备工艺得到凝胶贴膏的配方如表23所示。表23五虎活血贴膏的配方表相别序号原料名称重量/gA相1卡波姆9800.222去离子水22B相3NP-7002.554甘羟铝0.25五虎药粉1.06甘油14C相7柠檬酸0.18离子水去1制备工艺如下：将A相中卡波姆撒在去离子水中，静置一晚，至其充分溶胀；将C相中柠檬酸溶解于去离子水中；称取适量甘油，提前60℃水浴1min，加入NP-700和甘羟铝，用玻棒搅拌均匀；保持水浴温度，往B相中加入药粉，用玻棒搅拌均匀；B相、C相先后缓慢倒入A相，用玻棒搅拌，至基质混匀，玻棒搅拌出现阻力感；趁热涂布于无纺布上，烘箱50℃下烘6h，即得。3.9五虎活血贴膏的评价结果3.9.1性状考察在室内明亮柔和光线下观察五虎活血贴膏，色棕黄，气芳香，膏面平整光滑，无结块，存在少量不溶红色条状物，无漏膏，黏性好，可反复揭贴。3.9.2含膏量测定结果五虎活血贴膏含膏量结果如表24所示，平均每贴膏剂含膏量为3.7236g表24含膏量计算结果批号贴膏总重量/g背衬重量/g膏体重量/g平均含膏量/g20230405-14.82500.86783.95723.723620230405-24.37040.84993.520520230405-34.55410.86103.69313.9.3稳定性考察结果（1）耐热稳定性3个批号五虎活血贴膏通过高温测试恢复室温后，均未发生明显变化，贴膏未出现渗膏、漏膏现象，膏体表面光滑，手指触摸有较强黏性，表明五虎活血贴膏的耐热稳定性良好。（2）耐寒稳定性3个批号五虎活血贴膏通过高温测试恢复室温后，均未发生明显变化，贴膏未出现渗膏、漏膏现象，膏体表面光滑，手指触摸有较强黏性，表明五虎活血贴膏的耐热稳定性良好。3.9.4赋形性测定结果3个批号五虎活血贴膏通过倾斜角60度，放置24h后，均未发生明显变化，贴膏膏面无流淌现象，表明五虎活血贴膏赋形性良好。3.9.5黏附性测定结果测得3个批号的五虎活血贴膏能黏住的钢球大小分别为19号、18号、18号钢球。因此暂定本品黏附性为能黏住18号钢球。3.9.6总黄酮含量测定结果芦丁标准曲线测量结果如表25所示，芦丁对照品浓度（c）为横坐标（x），吸光度（A）为纵坐标(y)，线性回归得y=1.1267x+0.0057，R2=0.9955，标准曲线如图1所示，根据公式3算得三个批次五虎活血贴膏中总黄酮含量分别为为:1.4909mg/g、1.6146mg/g、1.6465mg/g。平均总黄酮含量为1.5840mg/g。（公式3）式中：ABS——溶液吸光度（A）M——取膏量（g）表25不同浓度的芦丁标准液在510nm处吸光度值样品浓度（mg/mL）00.040.080.160.240.32吸光度（A）00.04720.09450.18720.28960.3562表26总黄酮含量计算结果批号取膏量/g吸光度（A）总黄酮含量(mg/g)总黄酮平均含量(mg/g)20230405-19.84320.13801.49091.584020230405-29.58460.14521.614620230405-310.34100.15921.6465图1芦丁标准曲线3.9.7鸡胚绒毛尿囊膜试验结果6组五虎活血贴膏样品均无出血、凝血和血管融解的情况出现，ES=0，表现为无刺激性；0.9%氯化钠溶液作用于鸡胚绒毛尿囊膜5min内均未出现出血、血管融解、凝血现象，IS为0；0.1mol/L的氢氧化钠溶液作用于鸡胚绒毛尿囊膜后10s时开始发生出血，38s时出现血管融解，96s时发生凝血现象，根据（公式2），算得IS为17.14，鸡胚绒毛尿囊膜血管的刺激性结果如表27所示。结果表明五虎活血贴膏刺激性小，较为温和。表27五虎活血贴膏对CAM刺激性结果编号出血情况凝血情况血管融解情况ES刺激性分类10000无刺激性2000无刺激性3000无刺激性4000无刺激性5000无刺激性6000无刺激性阴性对照0000无刺激性阳性对照10389617.14强刺激性/腐蚀性

4结论本论文主要是以药典中记载的，具有活血散瘀、消肿止痛功效的成方制剂五虎散为功效成分，结合凝胶贴膏便捷性，设计一款具有活血散瘀、消肿止痛功效、黏附力好、稳定性强、安全无毒、无刺激性的贴膏剂。通过一系列实验得出以下结论：按初黏力、持黏力、膜残留度、