第十章 微生物分离纯化与菌种保藏技术

第十章微生物分离纯化与菌种保藏技术第十章微生物分离纯化与菌种保藏技术了解微生物分离纯化及微生物纯培养原理与方法理解并熟悉微生物分离纯化常用方法了解菌种退化的原因与影响因素能开展菌种复壮不同方法的操作理解微生物菌种保藏的原理及方法，能进行多种方法的菌种保藏学习目标第十章微生物分离纯化与菌种保藏技术微生物菌种分离纯化与保存菌种的衰退与复壮菌株的保存和使用

授课内容授课内容第一节微生物菌种分离纯化与保存微生物分离与纯化概念微生物分离与纯化技术菌种保存方法简介微生物菌种的分离与纯化 为了研究某微生物的特性，或者要大量地培养和利用某微生物，需要从自然界混杂的微生物群中分离单一的菌种，这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物菌种的分离与纯化。一、微生物菌种的分离与纯化概述第一节微生物菌种的分离纯化与保存自然界中，微生物都是以群居的方式存在的。在人为条件下培养的微生物群体称为培养物(culture)只有一种微生物的培养物称作纯培养物(pureculture)第一节微生物菌种的分离纯化与保存固体培养基单个微生物只在固体培养基上形成菌落.菌落是在固体培养基上（内）以微生物母细胞为中心的一团肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的子细胞的集团。一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养； 菌落形态

包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等

鉴定菌种的重要依据同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落第一节微生物菌种的分离纯化与保存显微镜下的菌落第一节微生物菌种的分离纯化与保存第一节微生物菌种的分离纯化与保存液体培养基

变浑浊（某些菌培养后液面有菌膜，或有皱醭） 不会形成菌落出发菌株的确定采样富集培养分离纯化菌种鉴定性能确定毒性测试第一节微生物菌种的分离纯化与保存二、微生物菌种的分离与纯化技术菌株保存微生物菌种筛选纯化流程（一)菌株的筛选途径向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株向自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中分离筛选从一些发酵制品中分离目的菌株第一节微生物菌种的分离纯化与保存从土壤中采样根据土壤特点采样根据微生物营养特点采样特殊环境下采样局部环境的影响极端环境条件的影响（二)含微生物样品的富集培养第一节微生物菌种的分离纯化与保存

富集培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。控制培养基的营养成分（唯一碳源或氮源）控制培养条件（pH、温度及通气量等）极端环境条件的影响（高温、高压、加入抗生素等）富集培养选择培养基分离目的菌验证例一：从土壤中分离能产生ß－半乳糖苷酶的微生物第一节微生物菌种的分离纯化与保存例二：分离筛选产高温淀粉酶（65℃）细菌单细胞选择培养基平板（淀粉为唯一C源）65℃培养淀粉水解透明圈目的菌菌落营养选择因子：淀粉环境选择因子：65℃高温第一节微生物菌种的分离纯化与保存（三)微生物的分离纯化技术第一节微生物菌种的分离纯化与保存用固体培养基分离、培养倾注平板法涂布平板法平板划线法稀释摇管法用液体培养基分离、培养单孢子分离选择培养分离1、用固体培养基分离纯种微生物样品多种混杂某种方法分散成单个微生物平板培养单菌落每个菌落为纯种（纯培养）单菌落转接培养纯种（纯培养）第一节微生物的分离与纯化原理图解（2）涂布平板法（1）倾注平板法涂布倾注梯度稀释过程10-110-210-310-410-510-6第一节微生物菌种的分离纯化与保存第一节微生物菌种的分离纯化与保存倾注平板平板涂布

操作示意图操作要点：1、梯度稀释度的确定：取决于需分离微生物在样品中的数量2、选择菌落接种的依据：a、菌落特征；b、菌体的特征3、微生物纯培养的标准：菌落特征一致性4、注意无菌操作（2）平板划线法平板划线分离的方法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。第一节微生物菌种的分离纯化与保存分区划线法适用于浓度较大的样品1234第一节微生物菌种的分离纯化与保存平板分区划线法连续划线法适用于浓度较小的样品平板连续划线法第一节微生物菌种的分离纯化与保存（3）稀释摇管法第一节微生物菌种的分离纯化与保存稀释摇管法：是对氧气特别敏感的厌氧菌的一种纯培养方法。操作：先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右然后将待分离材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡混合物，将培养基和空气隔开。（3）稀释摇管法

第一节微生物菌种的分离纯化与保存培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。2、用液体培养基分离纯种适用范围个别细胞较大的细菌原生动物、藻类如何分离纯培养？——接种物液体培养基顺序稀释法分离营养琼脂平板不能长菌落第一节微生物菌种的分离纯化与保存培养物在液体培养基中进行高度顺序稀释，如果经稀释后的同一稀释度的大多数（95%以上）试管中没有微生物生长，有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。接种物液体培养基顺序稀释法分离第一节微生物菌种的分离纯化与保存3、单细胞（单孢子）分离定义：采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养。操作特点：营养琼脂平板上不能形成菌落分离难度与细胞或个体的大小成反比个体较小的微生物需采用显微操作仪较大的微生物可使用毛细管提取第一节微生物菌种的分离纯化与保存第一节微生物菌种的分离纯化与保存4、选择培养分离第一节微生物的分离与纯化特点：创造适于目的微生物生长条件促使目的微生物快速生长呈优势菌抑制非目的微生物生长从混杂微生物中分离目的微生物操作方案：利用选择培养基进行直接分离富集培养法二元培养物（1）利用选择培养基进行直接分离选择培养基:只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基土壤目的菌优势非目的菌选择培养基直接分离选择培养基平板（含牛奶或酪蛋白唯一C、N源）37℃培养菌落周围有透明蛋白水解圈单细胞目的菌落例：分离筛选蛋白酶产生细菌第一节微生物的分离与纯化含牛奶选择培养基目的菌生长平板营养选择因子：牛奶或酪蛋白只允许分解利用蛋白质的目的菌生长，淘汰非目的菌长出的目的菌并不一定是同种细菌，但皆产蛋白酶。（1）利用选择培养基进行直接分离例：分离筛选蛋白酶产生细菌第一节微生物的分离与纯化。（2）富集培养法人为创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基富集培养是分离微生物菌种最强有力的技术之一营养选择因子和生理条件选择因子可无穷尽组合，可从自然界选择分离各类特异微生物第一节微生物的分离与纯化（3）二元培养物如果培养物中只含有两种微生物，而且是有意识的保持两者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。病毒和宿主细胞纤毛虫、变形虫和粘细菌第一节微生物的分离与纯化微生物纯培养分离方法的比较方法应用范围稀释倒平板法

涂布平板法平板划线法稀释摇管法液体稀释法单细胞分离法选择培养分离即可定性,又可定量,用途广泛用得最多方法简便,多用于分离细菌主要分离严格厌氧菌适用于培养细胞较大的微生物局限于高等专业化的科学研究适用于分离某些生理类型较特殊的微生物第一节微生物的分离与纯化生化特性（免疫学特性）生产性能测定毒性试验据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验（四)微生物性能测定第一节微生物的分离与纯化（五)菌株的保存第一节微生物菌种的分离纯化与保存要求：在一定时间内使菌种不死亡、不变异、不受污染。原理：人为地创造有利于微生物长期休眠的条件，主要是低温、干燥、缺氧。方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮低温冰箱、真空冷冻干燥法等液氮超低温保藏法保藏时间达2-15年适用于各种微生物菌种的保藏设备和操作费用要求高液氮超低温冰箱砂土管保藏法1.适用于保藏能产生孢子的微生物2.保藏时间因菌种而异3.对干燥敏感的细菌、营养细胞，不宜选择此法保藏第一节微生物的分离与纯化（五)菌株的保存斜面低温保藏法方法简单、便于操作菌种易变异、退化及污染保藏时间一般为1-6个月液体石蜡覆盖保藏法适用于酵母、霉菌和好氧性细菌的保藏疱肉培养基可用此法保存厌氧菌保存时间可达1年以上方法简单、对设备要求不高第一节微生物的分离与纯化（五)菌株的保存真空冷冻干燥保藏法将菌种在极低温度下快速冷冻，然后在低温下真空干燥、封装，隔绝空气，使菌体细胞结构成分保持原来状态，达到长期保藏的目的。适用于各类微生物时间长达10年以上第一节微生物的分离与纯化（五)菌株的保存冷冻干燥机授课内容第二节菌种的衰退与复壮菌种的衰退菌种的复壮菌种衰退（degeneration）：是指菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。一、菌种衰退第二节菌种的衰退与复壮性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。c）死亡.（一）菌种衰退的具体表现第二节菌种的衰退与复壮原有形态形状变得不典型；生长速度变慢，产孢子越来越小；代谢产物生产能力下降，即出现负突变；致病菌对宿主侵袭力下降；对外界不良环境（包括低温、高温或噬菌体侵染等）的抵抗力下降。总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生长优势，导致在群体中最后数量占优势第二节菌种的衰退和复壮（二）菌种衰退的原因1、基因突变有关基因发生负突变导致菌种衰退

菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变表型延迟造成菌种衰退

如：在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了质粒脱落导致菌种衰退

质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的第二节菌种的衰退和复壮（二）菌种衰退的原因2、连续传代

这是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。第二节菌种的衰退和复壮（二）菌种衰退的原因3、不适宜的培养和保藏条件

这是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件（营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等）不良的保藏条件（营养、含水量、温度、氧气等）不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退1、控制传代次数即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的机率第二节菌种的衰退和复壮（三）菌种衰退的防治2、创造良好的培养条件结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复突变细胞基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失培养营养缺陷型菌株时应保证适当的营养成分，尤其是生长因子控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。第二节菌种的衰退和复壮（三）菌种衰退的防治3、利用不易衰退的细胞移种传代在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就不会发生这种现象另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退，而改用子囊孢子移种则能避免衰退。第二节菌种的衰退和复壮（三）菌种衰退的防治4、采用有效的菌种保藏方法有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。 在实践中，应当有针对性的选择菌种保藏的方法 例如，酿酒酵母，保持其优良发酵性能最有效的保藏方法是－70℃低温保藏，其次是4℃低温保藏，而冷冻干燥保藏法和液氮保藏法并不理想短期保藏——一般斜面冰箱保藏法长期保藏——砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法（长期/短期）。第二节菌种的衰退和复壮（三）菌种衰退的防治6、讲究菌种选育技术在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力,避免表型延迟现象。同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯度。第二节菌种的衰退和复壮（三）菌种衰退的防治5、定期进行分离纯化定期进行分离纯化，对相应指标进行检查，也是有效防止菌种衰退的方法。第二节菌种的衰退和复壮狭义的复壮：菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施广义的复壮：一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种地生产性能逐步提高二、菌种的复壮复壮措施方法纯种分离法