药物靶点常见项目FAQ（二）

药物靶点常见项目FAQ（二）1.为什么做蛋白芯片筛小分子靶点要生物素标记呀？这个是基于我们蛋白芯片的原理，下图是人类蛋白质芯片的原理图，白色的部分是我们芯片的片基部分，上面蓝色的是纯化出来的蛋白固定在芯片上，黄色部分是小分子，绿色五角星是生物素，灰色的是链霉亲和素，红色的是CY3荧光（或CY5），在进行芯片实验时，您的小分子会和我们的芯片进行孵育，如果小分子和蛋白有结合，小分子就会结合到蛋白上，但是如果不进行生物素的修饰，那么我们是没有办法进行结合的监测的，虽然结合上了，但是看不到，也是不行的，所以我们对小分子进行生物素标记，这样链霉亲和素就可以和生物素进行结合，进而荧光就可以固定在结合的蛋白上，这样我们就可以通过检测荧光的发光情况去检测小分子与蛋白的结合。是基于这样的原因所以需要对小分子进行生物素标记。2.人类20K蛋白质组芯片的应用方向有哪些？人类20K蛋白质组芯片是非常具有探索性和创新性的研究工具，是功能性芯片的代表。芯片上有近2万种全长蛋白质，覆盖81%的人类基因组ORF区。重组蛋白采用酵母表达系统，逐个进行表达与纯化鉴定。在芯片上每个蛋白质均设置技术重复，并设有多种质控点，确保实验体系稳定可靠。研究人员除了可以进行血清或血浆中自身抗体谱的筛选建立疾病诊断标志物外，还可以基于蛋白质结构与相互作用的特点进行蛋白质与蛋白质、核酸、小分子药物、糖类、脂类等的相互作用检测。同时，研究人员还可以在芯片上进行复杂的酶与底物反应实验，从而确定酶的底物谱，进而广泛用于磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等蛋白修饰研究。目前我们蛋白质-蛋白质相互作用和lncRNA互作蛋白应用方面有很多高分文章发表，具体见知识库售前资料。在自身抗体谱筛选这个业务点上，可以找到很多大项目，尤其是做肿瘤免疫、风湿科、器官移植等科室。3.DNA/RNA，脂质，糖类等小分子可以检测吗？用什么芯片？可以检测与其相互作用的蛋白质。如果还不明确这些分子可能的作用蛋白是哪些，可以选用我们的Huprot20K蛋白质组芯片，确定与这些分子有相互作用的蛋白质。如果您已经明确相互作用蛋白，但是想知道二者结合的动力学情况，可以选用我们的SPR技术。4.人类20K蛋白质组芯片的检测手段有哪些？对于小分子药物、糖类、核酸类可以采用Cy5荧光直接标记或biotin+SA_Cy5的方式标记和检测。如果是蛋白检测，除了上述两种方法外，还可以采用针对该蛋白纯化时的非GST/Histag抗体标记荧光，或者直接针对该蛋白的一抗标记荧光检测。需要注意的是，抗体检测在实验设计时尤其要考虑相关阴性对照。5.20K做小分子靶点筛选比pulldown+MS的优势？1）芯片实验为体外实验，芯片上每个蛋白点相互独立，保证筛选到的互作蛋白均为目标蛋白的直接结合蛋白，数据分析简单；pulldown-LC/MS检测到的是与小分子有结合的蛋白复合物，不一定是直接结合的蛋白。2）pulldown使用细胞内的蛋白进行检测，如果细胞中目的蛋白表达量少的话，拉下来的互作蛋白也少，质谱打出来目的蛋白的可能性也很小。3）在不同组织、细胞、细胞器中，蛋白的表达丰度差异很大，传统的pulldown等实验很难发现低丰度蛋白，人类蛋白组芯片上的蛋白是酵母纯化表达的蛋白，可以保证每种蛋白的丰度，芯片实验容易发现潜在的结合蛋白。4）利用人类蛋白组芯片实验筛选互作蛋白，从蛋白质层面分析互作数据，避免了pulldown后质谱鉴定时，从多肽水平跨层分析互作蛋白的不确定性和复杂性。6.DARTS药物处理的浓度是单个浓度么，为什么不按照药效设置浓度梯度进行实验？DARTS实验我们设置的是一个偏饱和的药物处理浓度，进行3次重复实验可以尽量避免因为实验操作带来的假阳性。多浓度其实更建议在验证的时候设置，可以得到实验结果与药物浓度的关系（例如SPR）。DARTS这类以筛选为主要目的的实验若进行多浓度会不利于阈值的设置，因为药物结合降解的蛋白量与药物浓度并不一定呈梯度关系。7.前期药物的表型验证用的是小鼠模型，后续靶点筛选实验可以用20K芯片嘛？我们20k芯片筛选出的是与药物相互作用的蛋白，小鼠模型只是一个与人同源性较好的模型工具，最终大部分药物是服务于人的，这两者并不冲突。如果您担心物种的问题，我们芯片也有一些人和鼠之间同源性的数据供您参考，大部分蛋白在人和鼠中同源性都是比较强的。8.Pulldown筛选出来的药物结合蛋白用SPR验证的话有没有可能得到阴性的结果，怎么做才能提高阳性的概率？直接做SPR验证是会有阴性结果的，因为SPR是验证两者之间直接结合的金标准，而pulldown会筛选到很多间接结合的蛋白。在指标选择上，可以挑选与您研究方向密切