两面针5种成分含量测定 高效液相色谱一测多评法（征求意见稿） 编制说明

1《两面针5种成分含量测定高效一、项目来源本标准由广西壮族自治区药用植物园提出，深圳市中药制造业创新中心有限公司、华润三九医药股份有限公司和广西广林正山药业有限公司共同参与编制，经广西中药材产业协会批准立项，列入广西中药材产业协会2023年第3批团体标准制定项目计划。二、项目背景和目的意义L.）木质藤本植物两面针（Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.）的干燥根，具有活血化瘀、行气止痛、祛风通络、解毒消肿的功效，可用于跌扑损伤、胃痛、牙痛、风湿痹痛、毒蛇咬伤及烧烫伤等。两面针作为一味传统中药，药用历史悠久，效果显著，经济价值高，是三九胃泰、正骨水、金鸡胶囊、两面针牙膏等医药、化工产品的重要原料。因此，两面针药才的质量、临床疗效和安全性备受关注。目前《中华人民共和国药典》（2020年版）规定两面针药材中氯化两面针碱含量不得少于0.13%。但两面针成分复杂，含有生物碱类、黄酮类、香豆素类、倍半萜类、木脂素类等多种化学成分，因此，制定一套科学、全面、高效的两面针多种成分质量检测2标准显得尤为必要。目的：一测多评技术可以在一次测定中实现多个成分定量分析，即降低成本又提高效率。标准编制工作组利用高效液相色谱检测法与一测多评分析方法建立同步测定两面针中5种成分的标准操作规程，实现对两面针质量全面评价，以解决传统测定方法中存在的评价指标单一、成本高等问题，为临床用药提供更加安全、有效的保障，能更好地满足大规模生产和临床应用的需求。意义：全面评价两面针整体药材质量，保障临床用药安全、推动中医药行业健康发展，也为更多从事中医药研究和使用两面针的人士提供参考依据和指导作用。三、项目编制过程（一）成立标准编制工作组团体标准《两面针5种成分含量测定高效液相一测多评法》项目任务下达后，由广西药用植物园牵头，深圳市中药制造业创新中心有限公司、华润三九医药股份有限公司和广西广林正山药业有限公司共同参与成立标准编制工作组，表1标准编制工作组人员与分工性别霞女娅女3云女德男华男江男莉女娥女胜男男洪男快男文男郎女通男（二）收集整理文献资料标准编制工作组经查阅，收集了国内有关两面针成分含量测定方法的相关文献资料。主要有：《中华人民共和国药典》2020年版；《广西壮族自治区壮药质量标准》第一卷（2008年版4《广西中药材标准》第二册（1996年版（三）研讨确定标准主题内容标准编制工作组对收集到的资料进行整理研究后，组织召开了标准编制工作会议，对标准的整体框架结构进行研究分析，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经工作组研究确定，标准主体内容主要包括：术语和定义、原理、试剂、仪器、测定步骤、结果计算、精密度。（四）编写标准草案及征求意见稿整合现有资料中有关两面针的5种成分的检验方法，按照简化、统一等原则编制完成团体标准草案及其编制说明。标准草案编制后，标准编制工作组多次组织召开座谈会后根据座谈讨论情况对标准草案进行反复修改完善，最终形成团体标准征求意见稿及其编制说明。四、标准制定原则5（一）实用性标准内容符合当前两面针药材质量标准和检验方法技术发展方向，满足两面针市场需求，标准条款切实可行，具有较强的实用性和可操作性。（二）协调性本标准编写过程中尊重知识产权，同时注重做好与相关法律法规、强制性标准的衔接，在内容上与现行法律法规、强制性标准协调一致。（三）规范性本标准严格按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，标准涉及的专业术语、方法原理、试剂和材料、仪器和设备、测定步骤、结果计算等内容表达准确，引用数据、检验方法来源真实可靠，指标科学、论证充分，标准质量有保证。（四）前瞻性本标准在充分考虑当前中药材市场需求、试验标准品研制及成本问题的基础上，体现了特色性和先进性条款，为两面针药材及其制剂质量控制研究提供技术支撑和指导。五、标准主要内容及依据来源（一）术语和定义1、一测多评法Quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker通过中药有效成分间存在的内在函数关系和比例关系,6通过测定中药中某个代表性成分的含量，依据相对校正因子可计算出该中药中其他多种待测成分的含量，使其计算值与实测值符合定量方法学要求的一种多指标同步质量控制方2、相对校正因子Relativecorrectionfactor是一种修正因子，它的主要作用是修正测量值，以获得更准确的实验数据，提高研究质量，它的计算公式为某组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。（二）方法原理在同时测定两面针多个指标质量成分的含量时，以两面针中典型成分氯化两面针碱做内参物，分别求出内参物与木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱等其它4个待测成分间的相对校正因子，并把相对校正因子作为一个常数用于相应成分的含量测定。（三）仪器设备Agilent1260Infinity型高效液相色谱仪（四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器、柱温箱，美国安捷伦公司Cary50型紫外分光光度计（美国Varian公司KQ5200E型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公CP225D型电子分析天平（十万分之一，德国Sartorius7（四）试剂盐酸血根碱标准品（批号510001-201101，纯度99.3%）购自中国食品药品检定研究院；购自中国食品药品检定研究院；白屈菜红碱标准品（批号111718-201402，纯度80.5%）购自中国食品药品检定研究院；橙皮苷标准品（批号160406，纯度98.0%）购自北京博艺汇科生物技术有限公司；木兰花碱标准品（批号P11A10L85442，纯度98.0%）购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯（美国赛默飞世尔科技有限公（五）实验方法AgilentEclipseC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm流动相20%乙腈-0.1%甲酸（三乙胺调节pH至4.5体积流量1.0mL/min；柱温30℃;检测波长273、284nm；进样量2、制备标准品溶液精密称取氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱和白屈菜红碱标准品分别约1.25mg、5mg、5mg、1.25mg8和5mg，加70%甲醇溶解并定容至25mL，制成混合标准品贮备液，置于4℃冰箱中保存备用。盐酸血根碱和白屈菜红碱的浓度分别为0.0456mg/mL、然后从混合标准品贮备液中分别精确量取5、2、1、0.4mL，用70%甲醇定容至10mL，即得不同浓度的混合标准品3、供试品溶液制备收集12批次的两面针药材作为本研究的供试品（经广西药用植物园黄宝优高级工程师鉴定为两面针Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.的根样品信息见表1。表1两面针供试样品信息精密称定供试样品粉末（粒径≤0.5mm）1.0g，置于具（料液比1:6合并提取液，用70%甲醇定容至50mL容量9瓶中，最后用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。4、制作标准曲线分别吸取10μL不同浓度的混合标准品溶液依次注入高效液相色谱仪，按“1”项的色谱条件，测定氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱和白屈菜红碱峰面积，以峰面积（As）为纵坐标，对照品浓度（Cs）为横坐标，绘制氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱和白屈菜红碱的标准曲线。结果见表2。5种标准品的高效液相色谱峰图见表2各成分的标准曲线1.木兰花碱；2.橙皮苷；3.盐酸血根碱；4.氯化两面针碱；5.白屈菜红碱。图1对照品高效液相色谱图5、精密度试验精密吸取5种标准品贮备溶液，在“1”项的色谱条件下分别进样5次，测得的木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱峰面积见表3，计算得出5种成分的RSD分别为0.45%、0.21%、0.63%、0.33%、0.29%，表明仪器精密度良好。表3精密度试验峰面积结果分析6、稳定性试验h在“1”项的色谱条件下进样，测得的木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱峰面积见表4，计表明溶液在24h内稳定性良好。表4稳定性试验峰面积结果分析7、重复性试验精密称取同一批两面针供试品（Z2）粉末6份，分别制备供试品溶液，在“1”项的色谱条件下进样，测得木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱含量2.36%，表明该方法重复性良好。表5重复性试验含量检测结果分析(mg/g)8、加样回收率试验以供试品（Z2）粉末为材料，制备供试品溶液45份，加入一定浓度的标准品贮备液，然后在“1”项的色谱条件表明该方法系统误差小。表6加样回收率分析结果成分称样量/g/mg/mg/mg/%平均回收率/%D木兰花碱 盐酸血根碱氯化两面针碱白屈菜红碱10、外标法测定12批次供试样品中5种成分含量分别精密称取12批供试品溶液吸取10μL，在“1”项的色谱条件下进样测定峰面积，根据“表2”的标准曲线计算出浓度，然后计算含量，结果见表7。表7外标法测定得5种成分的含量结果（mg/g）11、一测多评法检测供试样品中5种成分含量第一步：氯化两面针碱较易获得，价格低廉，而且在样品中的含量较高，故选择氯化两面针碱为内参，采用外标法检测12批次供试样品中内参的含量，结果见表7中第一列第二步：配制5种标准品的混合液，然后将母液依次稀释成2倍液、5倍液、10倍液和25倍液。第三步：吸取5个浓度的混合标准品溶液各10μL，依次注入高效液相色谱仪，按“1”项的色谱条件，分别测定得出氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的峰面积As、A1、A2、A3和A4。第四步：根据氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸应的峰面积，计算木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的相对校正因子f1、f2、f3、f4。计算公式如下：f1=(Cs×A1)/（C1×As）;f2=(Cs×A2)/（C2×As）;f3=(Cs×A3)/（C3×As）;四种成分的相对校正因子计算结果见表8。表8各成分的相对校正因子f1f2f3f412345第五步：在不同色谱柱下计算相对校正因子，检验重复性。吸取5个浓度的混合标准品溶液各10μL，依次注入高效液相色谱仪，在“1”项的色谱条件下改变色谱柱，分别选择5种不同的色谱柱（ShimadzuWondaCractODS-2、TianheKromasilC18、PhenomenexLunaC18、DalianElitehypersilBDSC18、AgilentZorbaxSB-aqC18分别测定得出氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的峰面积As、A1、A2、A3和A4，计算相对校正因子，结果见表可知该方法能满足定量分析要求。表9不同色谱柱测定得出的相对校正因子f1f2f3f4DalianElitehypersilBD093“1”项的色谱条件下进样测定氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的峰面积，以氯化两面针碱为内参，根据相对校正因子计算木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的浓度C1、C2、C3、C4。其中C1=f1×Cs计算结果见表10。表10一测多评法测定得5种成分的含量结果（mg/g）12、一测多评法与外标法的结果比较分别采用外标法和一测多评法检测得出12批