制药过程与工艺课件

绪论*1.1制药工艺学课程地位和性质*一课程性质和地位*制药业发展与挑战•90年1752亿USD•00年4775亿USD•增长大于8%全球•4496亿元,年增长大于12％•制药业集中度↑•原料药生产大国•制药技术和装备整体水平低中国国外制药工程教育1995年，NSF—新泽西州立大学Rutgers分校—制药工程研究生教育密西根大学等高校也相继设立制药工程专业：TheCaliforniaStateUniversity,Fullerton;NewJerseyInstituteofTechnology;ColumbiaUniversity,NewYork;EcolePolytechniqueofMontreal;TheUniversityofLeeds;UniversityofPennsylvania;UniversityofAlabama除美国外，加拿大、英国和德国、日本和印度等国家的部分高校也已设立制药工程教育计划。*国内制药工程教育*1998年中国教育部调整新设置《制药工程》工科本科专业化学制药生物制药中药制药……制药工程制药工程专业与原专业的关系*制药工程制药工艺学、制药分离工程、药品质量管理工程、制药设备等厚基础，宽口径，注重培养全面素质与创新能力制药过程共性规律、技术、学科基础、发展需求化学制药生物制药微生物制药中药制药工业制剂生物化工二研究对象与内容*制药工艺：从发现-药物上市发现临床前临床毒理注册生产GLPGCPGMP化学化学生物生物中药剂型开发过程开发工业制药工业制药技术开发技术开发GLP—药物非临床研究质量管理规范GCP—药物临床试验质量管理规范GMP—药品生产质量管理规范1研究对象药物生产过程共性规律及其应用，包括制备原理+工艺路线+质量控制重要性：“安全、有效、均匀、可控”的保证药物产业化的桥梁与瓶颈贯穿整个药物研发过程*2主要内容综合应用化学系列、生物系列、机械设备与工程单元操作等课程的专门知识深化理解并掌握工艺原理，去分析和解决研发和生产过程的实际问题。从工业生产角度，改造、设计和开发药物的生产工艺，制定相应的操作规程。*主要内容实验室（小试）工艺中试放大工艺在车间生产若干批号后，制定生产工艺规程*制药工艺的类别（药物分类）化学合成药物(syntheticdrug)布洛芬、雷尼替丁、氧氟沙星…生物合成药物(biosyntheticdrug)重组人胰岛素、重组人红细胞生成素…中药(traditionalchinesemedicine)速效救心丸、复方丹参滴丸…*按照典型药物生产过程,分为4类：化学制药工艺学生物制药工艺学中药制药工艺学制剂工艺学*1.2天然提取制药技术发展*天然提取制药是指直接从天然材料中使用分离纯化等技术制备药物。现代药物最初来源于植物、动物和微生物，而且以提取分离为先导。*发展历史15～17世纪，欧洲有了金鸡纳、愈创木、药喇叭根、古柯果和可可等。

19世纪，掀起了天然提取分离药物的热潮，从植物中分离出纯的有效化学物质。从鸦片中提取出吗啡结晶；从吐根中分离得活性成份吐根碱。从金鸡纳树皮分离得到了奎宁，成为最早用于治疗疟疾的药物。从莨菪中提取了阿托品，从古柯叶取得了可卡因；从洋地黄叶子获得洋地黄甙晶体。20世纪50年代后，对动物脏器的有效成分和生理活性物质的全面了解，生产技术提高，改变了原来的混合制剂，生产单一特异性组分的生化药物制剂。如猪牛胰岛素、前列腺酶及辅酶、激素、脂类、蛋白质和核酸及其降解产物等。生化药物品种迅速增加，已成为一类重要的药物。*由于合成工艺、技术等因素的限制，仍然有些氨基酸、维生素、核苷酸、酶、多糖、脂类等仍然不能合成生产，必须直接从天然材料中提取。还有一些手性药物和半合成药物的中间原料也必须从天然材料中直接提取。*1.3生物技术制药发展*一相关定义生物技术药物（biotechnologymedicine）是利用生物机体、组织、细胞，生产制造或从中分离得到的具有预防、治疗和诊断功能的药品，包括多肽、蛋白质、酶和核酸以及具有生物活性的初级代谢和次级代谢产物、天然活性化合物及其类似物。生物技术药物（biotechnologymedicine）、生物技术产品（biotechnologyproduct）、生物技术制品（productofpharmaceuticalbiotechnology）有时候也互换使用。在相关法规中，经常出现的术语是生物制品

(biologics，biologicproduct,中国、美国使用)、生物医药产品（biologicalmedicinalproduct，欧盟使用）。*中国生物制品规程对生物制品的定义：以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织为起始材料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备，并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂，包括菌苗、疫苗、毒素、类毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、抗体、变态反应原、细胞因子、激素、酶、发酵产品、单克隆抗体、DNA重组产品和体外免疫诊断制品等。分为预防用生物制品、治疗用生物制品和诊断用品三类。预防用生物制品包括疫苗、菌苗和类毒素；治疗用生物制品包括抗血清与抗毒素、血液制品、细胞因子与抗体；诊断用品包括细菌学试剂、免疫试剂、临床化学试剂。*二生物制药的类型微生物发酵制药采用微生物发酵生产药物。第二次世界大战期间诞生了以抗生素为代表的次级代谢产物的工业发酵，很快应用到其他药物的发酵生产，如氨基酸、维生素、甾体激素等。微生物药物主要为抗生素(antibiotic)、氨基酸(aminoacid)、维生素(vitamin)、核苷酸和核苷(nucleotide,nucleoside)、酶(enzyme)、酶抑制剂(enzymeinhibitor)、免疫调节剂(immunomodulator)和受体拮抗剂(receptorantagonist)等。酶工程技术制药酶工程技术在制药工业上的主要应用是（1）生物酶用于制备手性药物；（2）生物转化，给已有药物添加基团，增加药效和功能。*细胞培养技术制药动植物细胞培养(cellculture)是在离体条件下人工培养基上培养动植物细胞，使之生长繁殖并发育。主要应用于生产人畜病毒疫苗、单克隆抗体、重组基因工程产品等。基因工程技术制药基因工程（geneengineering）制药是在体外通过重组DNA技术，对生物的遗传物质基因进行剪切、拼接、重新组合，与适宜的载体连接，构成完整的基因表达系统，然后导入宿主生物细胞内，与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中繁殖，并表达活性蛋白质、多肽或核酸等药物。通过基因工程改造微生物细胞的代谢过程，还可提高抗生素、维生素、氨基酸、核酸、辅酶、甾体激素等药物的生产能力。*三、生物药物的用途1作为治疗药物按药理作用主要有以下：内分泌障碍治疗剂：胰岛素、生长素、甲状腺素等。维生素类药物：主要起营养作用，用于维生素缺乏症。中枢神经系统药物：L－多巴，人工牛黄、脑啡肽。血液及造血系统药物：常见的有抗贫血药（血红素）、抗凝药（肝素）、纤溶剂－抗血栓药（尿激酶）等。呼吸系统药物：平喘药（PGE、肾上腺素）、祛痰剂（乙酰半胱氨酸）、镇咳药（蛇胆、鸡胆）。心血管系统药物：抗高血压药（激肽释放酶）、降血脂药（弹性蛋白酶，猪去氧胆酸）、冠心病防治药（硫酸软骨素A）*消化系统药物：助消化药（多酶片）、溃疡抑制剂（胃膜素、维生素U）、止泻药（鞣酸蛋白）。抗病毒药物：抑制病毒核酸的合成，如碘苷抑制病毒合成酶，如阿糖腺苷调节免疫功能，如干扰素抗肿瘤药物：主要有核酸类抗代谢物（阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶）、抗癌天然大分子（天冬酰胺酶，香菇多糖PSK，灰树花多糖）、提高免疫力抗癌剂（白介素－2,干扰素）抗辐射药物：如超氧歧化酶（SOD）计划生育用药：口服避孕药（复方炔诺酮）生物制品类治疗药：各种免疫蛋白、抗毒素、抗血清（蛇毒抗血清）。*2作为预防药物常见的预防药物有菌苗、疫苗、类毒素及冠心病防治药物。3作为诊断药物（1）免疫诊断试剂利用高度特异性和敏感性的抗原机体反应，检测样品中有无相应的抗原或抗体，可作为临床诊断的依据。主要有诊断抗原和诊断血清。诊断抗原：细菌类，如伤寒病毒类，如SARS，乙肝病毒毒素类，如链球菌溶血素O*

诊断血清：细菌类病毒类肿瘤类抗毒素类激素类血型及人类白细胞抗原诊断血清其它（2）酶诊断试剂利用酶反应的专一性和快速灵敏的特点，定量测定体液内的某一成分变化作为病情诊断的参考。目前有40余种酶诊断试剂盒。*（3）器官功能诊断药物利用某些药物对器官功能的刺激作用，排泄速度等已检查器官的功能损害程度。如甘露醇等。（4）放射性核素诊断药物放射性核素诊断药物有聚集于不同组织或器官的特性，故加入体内后，可检测其在体内的吸收、分布、转运、利用及排泄等情况，从而显示器官功能及其形态，以供疾病的诊断。（5）诊断用单克隆抗体（McAb）McAb的特点之一是专一性强，一个B细胞所产生的抗体只针对抗原分子上的一个特定抗原决定族。*（四）用作其它生物医药用品生化试剂如细胞培养基、电泳试剂等生物医学材料手术缝合线、人造骨头等。营养保健品和美容化妆品*1.4化学合成制药技术发展*全合成制药磺胺嘧啶、阿司匹林…半合成制药多烯紫杉醇、头孢类抗生素…手性制药阿托伐他汀、阿奇霉素…*化学制药工艺的要求最安全：易燃易爆、有毒的原料与中间体最经济：成本最低最便捷：工艺路线最短，最简，易于组织生产绿色工艺：三废，废水、气、渣*1.5制药工业的发展*一全球制药工业的发展制药工业（pharmaceuticalindustry）的历史大约70多年，但一开始就发展很快，目前全世界制药企业超过10000家，生产制造5000多种药物，其中约100家为跨国公司。20世纪初所用药物只有四种：洋地黄用于治疗各种心血管疾病，奎宁用于治疗疟疾，吐根属植物提取物（活性成分为生物碱）用于治疗痢疾，水银用于治疗梅毒，但当时缺乏安全性和有效性。20世纪70年代以后，出现现代生物技术制药公司。目前，全世界生物技术公司4400多家，主要集中在欧美，美国1444家，欧洲1815家，加拿大472家，亚太地区685家。年产值超过10亿美元的生物技术公司有20余家。*世界制药行业具有以下特征并购风云不断，重组形成更大集团，强强联合优势互补，战略性驱动，企业经营的专业化，企业间的合作。并购数量增加，药品生产的集中度不断提高。研发费用持续上升，投入继续增大，国际10大制药公司的年均投入占销售额的16％左右。1个新药的研发费用约8－10亿美元，但新药批准上市的数目在下降。研发的难度越来越大，新产品是行业的希望。重磅炸弹药物数目持续增加，从1995年到2004年，增长了近4倍。跨国公司更多依赖于重磅炸弹药物，是企业的主要利润来源。生物技术药物异军突起。20世纪80年代以前是治疗性药物，20世纪90年代是改善生命质量的药物，而进入21世纪，将是靶向的蛋白质、多肽和核酸类治疗性药物。*二我国制药工业发展中国制药工业的发展经历了从药店到厂房，再到现代化企业和集团的过程。20世纪20～30年代，上海、广州是我国近代制药工业的发祥地，但制药工业十分落后。1949年新中国成立初期，重视医药工业的发展，确定了“以发展原料药为主”的方针。同时，积极发展药物制剂生产。1951年试制出第一批结晶青霉素，1958年，以生产抗生素为主的华北制药厂建成投产；至1959年，中国建立起化学制药工业。20世纪80年代后，走上了按正规制药工业管理和发展的道路。*1.6制药技术展望*制药行业是一个集约化、国际化程度极高的产业。国外公司在中国设立研发机构，并把生产制造中心向中国转移。“十一五”时期乃至更长时间我国医药市场需求将继续保持旺盛势头。中国医药市场今后5年内将以15％～20％的速度发展，到2010年将达到240亿美元，成为继美国、日本、德国和法国之后的世界第5大医药市场，2020年将达到1200亿美元，超过美国成为全球第一大市场。从制药业各子行业看，未来5～10年期间，我国医药市场将继续保持以化学药为主，生物技术制药已经成为制药行业的新领域，天然提取制药有很大发展空间。主要途径为：创新药物研究、抗体工程制药技术、制药工艺新技术及其改造。*创新药物研究加大制药的科研开发投入，研究并拥有自主知识产权的药物和技术。我国现有常用西药4000多种，其中97％属于仿制国外产品或进口药。采用组合生物化学、生物分子芯片、细胞组织和动物模型等高通量的方法筛选天然药物，发现新型治疗药物。利用人类基因组和蛋白质组以及病原生物体的基因组的最新成果，计算机技术，把生物信息学、分子生物学、基础医药学、药物化学、药理学等的技术综合起来，通过突变、生物展示、嵌合、质谱分析等，进行新型药物的辅助设计和药物筛选，获得创新性药物。通过基因工程技术，改变重组蛋白类药物的结构，从而增强活性，延长体内的半衰期。利用生物分子修饰化学药物。如利用人白蛋白制成的纳米颗粒结合紫杉醇注射制剂，代替传统的紫杉醇制剂可避免过敏反应，加强了紫杉醇的临床效果和安全性。*抗体工程制药技术FDA批准上市的生物药物中，抗体类药物所占比例越来越大，2004年有11个，3个为全新药物，其它为新适应症。抗体类药物一上市就成为年销售额逾亿美元的重磅炸弹药(blockbusterdrug)。基于单克隆抗体的治疗剂主要的应用领域是癌症，上市的抗体药物一半都在营利。预计单抗药物的全球销售额将从2004年的50多亿美元增至2010年的150亿美元，平均年增长30%。*制药工艺新技术及其改造应用现代科学技术改造我国传统的医药工业，使我国制药行业的经济实现由速度型向效益型、由粗放型向集约型的根本转变，用先进的制造技术进行药物生产。研究适用于大规模药物生产的动植物和微生物表达系统，提高药物生产效率的新途径。大力开发手性药物及外消旋药物的手性转化。加强环境保护与质量意识。*

微生物发酵制药工艺2.1微生物发酵与制药*一发酵概念发酵概念：通过微生物培养而获得产物的过程。发酵种类：用产品说明，冠以产物名而成，如青霉素发酵，维生素发酵；发酵工程按需氧分为好氧发酵和厌氧发酵。初级代谢产物：在初级代谢过程中形成的产物，包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核酸等。生长所必须的。几乎所有生物初级代谢基本相同。氨基酸，核苷酸，有机酸。次级代谢产物：比较复杂的化合物，不是细胞生长必需的，对生命活动有意义（抗逆境条件）。抗生素，毒素，色素。*发酵制药种类微生物菌体发酵微生物菌体发酵是以获得微生物菌体为目的，如：面包的酵母发酵、单细胞蛋白发酵（利用各种碳源）、真菌类（各种蘑菇、冬虫夏草）、生物防治剂（苏云金杆菌，伴孢晶体可以毒杀鳞翅目、双翅目害虫）。微生物酶发酵微生物酶发酵是以获得酶为目的的发酵，如青霉素酰化酶，用于半合成青霉素时，制备中间体6－氨基青霉烷酸。微生物代谢产物发酵初级代谢产物：氨基酸，核苷酸，维生素，有机酸。次级代谢产物：最主要的是抗生素。微生物转化发酵利用微生物的一种或多种酶把一种化合物转变为结构相关的更有价值的产物的生化反应为转化发酵。*制药微生物的种类生产药物的天然微生物主要包括细菌、放线菌和丝状真菌三大类。细菌主要生产环状或链状多肽类抗生素，如芽孢杆菌(Bacillus)产生杆菌肽（bacitracin），多黏芽孢杆菌（Bacilluspolymyxa）产生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。细菌还可以产生氨基酸和维生素，如黄色短杆菌（Brevibacteriumflarum）产生谷氨酸，大小菌生产维生素C。放线菌主要产生各类抗生素，以链霉菌属最多，诺卡菌属较少，还有小单孢菌属。生产的抗生素主要有氨基糖苷类（链霉素、新霉素、卡那霉素等）、四环类（四环素、金霉素、土霉素等）、放线菌素类（放线菌素D）大环内酯类（红霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大环内酯类（制霉菌素、抗滴虫霉素等）。酸性、碱性和中性，但以碱性为多。真菌的曲菌属产生桔霉素，青霉素菌属产生青霉素和灰黄霉素等，头孢菌属产生头孢霉素等。脂环芳香类或简单的氧杂环类，多为酸性化合物。*发酵制药的基本过程*菌种选育发酵工段提炼工段成品工段孢子制备种子制备发酵控制预处理分离提取浓缩纯化成品工段包装原料药实验室、种子库发酵车间提炼车间包装车间2.3制药微生物菌种的建立*新药生产菌的选育自然分离自然选育诱变育种杂交育种基因工程技术育种基因组shuffling技术*2.8抗生素生产工艺*以青霉素为例一概述－发现1929:Fleming在葡萄球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药物。

1939：牛津病理家HowardFlorey化学家ErnstChain,NormanHeatley。发酵瓶培养霉菌，培养里提取，测活性，青霉素结晶。*发展1940：8只鼠注射链球菌，提取物对4只治疗。未经治疗鼠在24小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。1941年2月开始治疗第一批人类病人。1943：威斯康辛大学小组，取得突破生产菌表面培养：几十个单位。深层培养产黄青霉：100U/ml。X、UV诱变育种：1000－1500U/ml。不产色素变种：66000－70000U/ml目前：85000U/ml。*概述－作用机理细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。生长中的细胞有效，静止细胞无效高效、安全的抗细菌感染药物*概述－应用临床抗感染治疗：大多数革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体等。毒性小，但需要皮试。各种半合成抗生素的原料：氨苄青霉素，磺苄青霉素，乙氧萘青霉素头孢菌素母核。*二青霉素生产菌的生物学特性产黄青霉：Penicilliumchrosogenum孢子:绿色和黄色菌落：平坦或皱褶，圆形。*青霉穗:分生孢子链状深层培养菌丝：球状和丝状两种。发酵条件下的生长过程第1期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。第2期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。第3期：形成脂肪包涵体，机理贮藏物，没有空泡，嗜碱性很强。第4期：脂肪包涵体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。第6期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状。释放游离氨，pH上升。第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。*镜检规定时间取样，显微镜观察7个时期的形态变化，控制发酵。1－4期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。4－5期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。在第六期到来之前结束发酵。*三发酵工艺过程*1生产孢子制备工斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基进行培养。米孢子：移植到小米或大米固体培养基上，生长7天，25℃。注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。*2种子罐培养工艺一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。空气流量1：3（体积比）；300-350rpm；pH自然，温度27±1℃,40h二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10％培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，25±1℃。10-14h质量：菌丝致密，菌丝粗壮，III期，倍增期6-8h*3生产罐培养工艺三级罐：生产罐；接种量20％。培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油。参数条件：通气量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小时:pH6.4-6.6，26℃；60小时后:pH6.7,24℃。*4发酵培养与过程控制操作方式：反复分批式发酵。发酵罐：100M3，装料80M3。带放:6-10次，带放量10％，间隔24h。发酵周期：180-220h。*（1）过程控制——补料分批操作控制基质浓度前40小时：培养基中的主要营养物40小时后：低速连续补加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。半饥饿状态：延长合成期，提高产量。碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。糖与6APA结合形成糖基-6APA，影响青霉素产量。*流加碳源控制根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。残糖0.3-0.6％左右，pH开始升高时流加糖。浓度：500kg/m3，流速:1.0-2.5kg/m3·h。*流加氮源控制玉米浆:最好，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素。氨基氮浓度：0.01-0.05%。*盐离子控制无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁对青霉素合成有毒，30-40ug/ml以下。罐壁涂环氧树脂保护层。*（2）添加青霉素侧链前体时期：合成阶段。种类：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸。毒性：抑制细胞生长和青霉素合成。策略：低浓度流加。浓度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%。控制：保持供应速率略大于生物合成需要。*提高产量的其他物质流加表面活性剂：新洁尔灭、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他：剪切保护剂；分散剂*（3）温度控制适宜菌丝生长温度30℃，分泌青霉素20℃。20℃青霉素破坏少，周期很长。变温控制，不同阶段不同温度。生长阶段:较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降温控制24℃。*（4）pH控制合成适宜pH6.4－6.6左右，避免超过7.0直接加酸或碱：自动控制流加葡萄糖：恒速；变速，依赖pH变化快慢。pH下降：补加CaCO3、通氨、尿素或提高通气量pH上升：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）*（5）溶氧控制＜30％饱和度，产率急剧下降；＜10％，造成不可逆的损害。临界溶氧浓度：30％。通气比：1：0.8－1.5。适宜的搅拌速度:保证气液混合，提高溶氧。调整搅拌转速:各阶段的生长和耗氧量不同。*（6）消沫天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影响呼吸代谢。*四提炼工艺过程青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定易溶于有机溶剂，水中溶解度很小青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性防止降解，条件温和、快速。*1预处理青霉素的存在部位：发酵液。浓度较低：10－30kg/m3。含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等。目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白。*2过滤鼓式真空过滤机过滤：一次滤液：pH6.2-7.2，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量0.5-2.0%。板框式过滤机过滤：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土为助虑剂。二次滤液：澄清透明，用于提取（收率90％）*3、溶剂萃取原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而霉素盐易溶于水。萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白质：加0.05-0.1%乳化剂PPB。萃取：2－3次。*逆流萃取过程正相萃取：酸化pH1.8-2.0，滤液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式离心机分离（浓缩1.5-2.1）反相萃取：pH6.8-7.4（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。反复萃取2－3次，达到结晶要求。萃取条件：10℃下。萃取罐冷冻盐水冷却。*4脱色萃取液中添加活性炭，除去色素。过滤，除去活性炭。*5结晶——直接结晶加醋酸钠－乙醇溶液反应：得到结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液：得到青霉素钾盐。*5结晶——共沸蒸馏结晶萃取液，再用0.5MNaOH萃取pH6.4-6.8下得到钠盐水浓缩液。加3-4倍体积丁醇，16-26℃，真空0.67-1.3KPa）下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥（60℃真空16h），磨粉，装桶，得到青霉素产品。*2.9氨基酸发酵生产工艺*一氨基酸类药物得基本概念*α氨基酸氨基酸及其衍生物在医药中的应用氨基酸的营养价值及其与疾病治疗的关系必需氨基酸—人和哺乳动物自身不能合成，需要由食物供应，称为必需氨基酸。赖氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，苏氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸等8种。治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸及其盐酸盐，谷氨酰胺，乙酰谷酰胺铝，甘氨酸及其铝盐，硫酸甘氨酸铁，维生素U及组氨酸盐酸盐等。治疗肝病的氨基酸及其衍生物精氨酸盐酸盐，磷葡精氨酸，鸟天氨酸，谷氨酸钠，蛋氨酸，乙酰蛋氨酸，瓜氨酸，赖氨酸盐酸盐，及天冬氨酸等。*治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸钙盐及镁盐，氢溴酸谷氨酸，色氨酸，5－羟色氨酸、左旋多巴等。用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物偶氮丝氨酸，氯苯丙氨酸，磷天冬氨酸及重氮氧代正亮氨酸等。其它氨基酸类药物的临床应用*二氨基酸类药物的生产方法1发酵法2水解法3酶法转化*1发酵法L－异亮氨酸的制备*培养液灭菌灭菌培养液菌种培养接种发酵发酵液过滤上层液酸化滤液离子交换洗脱液减压蒸馏浓缩液活性炭脱色滤液减压浓缩浓缩液氨水中和沉淀水结晶干燥L－异亮氨酸成品工艺过程1）菌种培养种子培养基组成（％）为：葡萄糖2，尿素0.3，玉米浆2.5，豆饼水解液0.1，pH6.5。二级种子培养基加菜籽油，其余同一级种子培养基。一级种子培养：1000ml三角烧瓶中培养基装量为200ml，接种一环牛肉膏斜面AS1.998菌种，摇床30℃16h。二级种子培养：接种量3.5％，培养8h。逐级放大。2）灭菌、发酵发酵培养液组成（％）：硫酸铵4.5，豆饼水解液0.4，玉米浆2.0，碳酸钙4.5，pH7.2，淀粉水解还原糖粗糖浓度11.5。灭菌，接种1％菌种（v/v），搅拌，发酵。*3）除菌体，酸化发酵结束后，发酵液加热至100℃并维持10min，冷却过滤，滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5，过滤除沉淀。4）离子交换、吸附分离上述滤液每分钟以树脂量1.5％的流速进H＋型732离子交换柱（φ40×100cm),以100L去离子水洗柱，再以60℃,0.5mol/L氨水按3L/min的流速进行洗脱。分部收集洗脱液。5）浓缩赶氨6）脱色、浓缩、中和7）精制，烘干*1水解法（一）基本原理蛋白质水解方法酸水解法、碱水解法、酶水解法氨基酸分离方法溶解度法、特殊试剂沉淀法、吸附法、离子交换法氨基酸精制方法结晶，重结晶*水解法举例L－胱氨酸的制备：*人发或猪毛水解液L－半胱氨酸粗品滤液L－半胱氨酸粗品滤液L－半胱氨酸盐酸水解氢氧化钠中和盐酸，活性炭氢氧化钠中和盐酸，活性炭中和，氨水3酶法转化*延胡索酸＋NH3固定化天冬氨酸酶转化转化液L－Asp粗品分离L-Asp精品转化液固定化L－Asp－β－脱羧酶浓缩结晶L－Ala粗品L－Ala精品精制天冬氨酸和丙氨酸的制备工艺过程1）菌种培养大肠杆菌（E.coli）AS1.881的培养斜面培养基为普通肉汁培养基摇瓶培养基成分（％）：玉米浆7.5，反丁烯二酸2.0，硫酸镁（7水）0.02，氨水调pH6.0，煮沸后过滤，500ml三角烧瓶中装液量50-100ml。从新鲜斜面上或液体中培养种子，接种子于摇瓶培养基中，37℃振摇培养24h，逐级扩大培养至1000～2000ml规模。培养结束后用1mol/LHCl调pH5.0，升温至45℃并保温1h，冷却至室温，离心收集菌体。德阿昆哈假单胞（Pseudomonasdacunhae）68变异株的培养斜面培养基组成（％）为蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaCl0.5，pH7.0，琼脂2.0。种子培养基与斜面培养基，不加琼脂，250ml三角烧瓶中培养基装量40ml。摇瓶培养基组成（％）为L－谷氨酸3.0，蛋白胨，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氢钾0.05，MgSO4.7H2O0.01，用氨水调pH7.2，500ml三角烧瓶中培养基装量为80ml。将培养24h的新鲜斜面菌种接种于种子培养基中，30℃振摇培养8h，再接种于摇瓶培养基中，30℃振摇培养24h，逐级放大。*2）细胞固定化Ecoli的细胞固定化取湿菌体20kg，悬浮于生理盐水中，保温至40℃，再加入90L保温至40℃的12％明胶溶液及10L1.0％戊二醛溶液，充分搅拌均匀，放置冷却凝固，再浸入0.25％戊二醛溶液中。于5℃过夜后，切成3～5mm的立体小方块，浸入0.25％戊二醛溶液5℃过夜，蒸馏水充分洗涤，滤干得含天冬氨酸酶得固定化。假单胞菌体固定取湿菌体20kg，加生理盐水搅拌至稀释至40L，另取溶于生理盐水的5％角叉菜胶溶液85L，两液均保温至45℃后混合，冷却至5℃成胶。浸于600L2％KCl和0.2mol/L已二胺的0.5mol/LpH7.0的磷酸缓冲液中，5℃下搅拌10min，加戊二醛至0.6mol/L浓度，5℃搅拌30min，取出切成3～5mm的立体方块，用2％KCl溶液充分洗涤后，滤去洗涤液，即得固定化脱羧细胞。*3）生物反应堆的制备4）转化反应5）产品纯化与精制*4化学合成法L－脯氨酸**L－谷氨酸＋乙醇硫酸三乙胺L－谷氨酸－γ－乙酯KBH4还原L－Pro反应液五氯酚沉淀氨水解析滤液活性炭滤液乙醚固形物精制L－脯氨酸成品2.10维生素生产工艺*一概述维生素是一类生物生长发育起调节作用的、化学结构不同的、小分子有机化合物，人体内不能合成，必须从食物等中摄取。人体需求量很少，但不足时，出现相应的缺乏症。已知维生素13种，根据溶解性，一般分为水溶性和脂溶性维生素两类。主要维生素的生产有三种方法。2002年我国维生素原料产量达8.2万吨，其中维生素C超过5万吨，成为世界上最大的原料药生产国和出口国。维生素制剂年产量260－280亿支/片/瓶，以片剂、注射液和胶囊为主。*2维生素C生产工艺目前，工业上生产维生素C采用二步发酵法，此法是在1975年由中国科学院上海生物技术研究所研究出来的，属我国首创。发酵法生产维生素C可以分为发酵、提取和转化三大步骤。即先从D-山梨醇发酵，提取出维生素C前体2-酮基-L-古龙酸，再用化学法转化为维生素C。第一步发酵黑醋酸菌（Acetobactersuboxydans）经种子扩大培养，接入发酵罐，种子和发酵培养基主要包括山梨醇、玉米浆、酵母膏、碳酸钙等成份，pH5.0~5.2。醇浓度控制在24~27%，培养温度29~30℃，发酵结束后，发酵液经低温灭菌，移入第二步发酵罐作原料。D-山梨醇转化L-山梨糖的生物转化率达98%以上。*第二步发酵氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans，小菌)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium，大菌)混合培养。生产维生素C的发酵罐均在100m3以上，瘦长型，无机械搅拌，采用气升式搅拌。种子和发酵培养基的成份类似,主要有L-山梨糖、玉米浆、尿素、碳酸钙、磷酸二氢钾等，pH值为7.0。大、小菌经二级种子扩大培养，接入含有第一步发酵液的发酵罐中，29~30℃下通入大量无菌空气搅拌，培养72h左右结束发酵，L-山梨糖生成2-酮基-L-古龙酸的转化率可达70~85%。

2-酮基-L-古龙酸的分离提纯经二步发酵法两次发酵以后，发酵液中仅含8%左右的2-酮基-L-古龙酸，且残留菌丝体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等杂质，常采用加热沉淀法、化学凝聚法、超滤法分离提纯。传统工艺是加热沉淀法，发酵液经静置沉降后通过732氢型离子交换树脂柱，调节pH至蛋白质等电点，并加热使蛋白质凝固，然后用高速离心机分离出菌丝、蛋白和微粒，清液再次通过阳离子交换柱，酸化为2-酮基-L-古龙酸的水溶液，浓缩结晶后得到2-酮基-L-古龙酸。*2-酮基-L-古龙酸的化学转化将维生素C前体2-酮基-L-古龙酸转化为维生素C，常采用碱转化法。2-酮基-L-古龙酸在甲醇中用浓硫酸催化酯化生成2-酮基-L-古龙酸甲酯，加NaHCO3转化生成维生素C钠盐，经氢型离子交换树脂酸化得到维生素C。粗品经结晶精制得维生素C成品。*3维生素B2生产工艺维生素B2（vitaminB2）又称核黄素(riboflavin)，国内约有l0家核黄素生产商。目前国内外广泛采用微生物发酵法工业生产维生素B2。能够产生维生素B2

的微生物有细菌、真菌和霉菌，工业生产中主要以阿舒假囊酵母(Eremothereciumashbyii)为生产菌种。维生素B2

的工业发酵一般为二级发酵，发酵液先沉淀再氧化进行分离提纯。*发酵培养基中以植物油、葡萄糖、糖蜜或大米等作为主要碳源，植物油中以豆油对维生素B2产量的促进效果最为显著,有机氮源以蛋白胨、骨胶、鱼粉、玉米浆为主，无机盐有NaCl、K2HPO4、MgSO4。种子扩大培养和发酵的通气量要求均比较高，通气比一般在1.0，罐压0.05MPa左右，搅拌功率要求比较高。阿舒假囊酵母的最适生长温度在28~30℃，种子培养34~38h后接入发酵罐，发酵培养40h后开始连续流加补糖，发酵液的pH值控制在5.4~6.2,发酵周期为150~160h。维生素B2的产量在50g/L左右。维生素B2的分离提取与纯化发酵液酸化后加热,然后加入黄血盐、硫酸锌沉淀蛋白，过滤后滤液调pH1.5~2.0酸化，静置20~40h沉淀，压滤后将沉淀物酸溶，加入硝酸铵，氧化抽提，氧化液经结晶、过滤后，湿晶在80℃以下干燥20h，得到维生素B2成品。*

基因工程制药工艺3.1基因工程制药微生物表达系统*基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。种类：细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。*一大肠杆菌表达系统1大肠杆菌（Eschericliacoli）形态特征*细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。2生化与遗传特性能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。基因组：4.6Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。*3质粒载体*复制起始点选择标记多克隆位点质粒类型严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几个拷贝的质粒，pSC101；松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百个拷贝数的质粒，pMB1和colE1；克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因；测序质粒：用于基因测序；整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合；穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在；表达质粒：能表达基因产物*4产物表达形式不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体；可溶性蛋白质：存在于细胞质；周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸；胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。*5优点和不足发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70％），培养周期短，抗污染能力强。不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。*6应用大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)细胞因子类：5种干扰素α（1种PEG化）、干扰素β和γ，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂溶栓酶类：rPA白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。*二酵母表达系统1形态特征*细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。2生长与遗传特征孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景已相当清楚。基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约6000个基因。*3优点与不足优点五种类型的载体，——安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。*4应用1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子多肽类：高血糖素2种乙肝疫苗等。8种产品*3.2基因工程大肠杆菌的构建技术*一工程菌构建流程*目标基因克隆表达载体构建遗传转化与筛选工程菌PCR、文库、化学合成酶切、连接外源基因导入与培养二表达载体构建表达载体设计目标基因的定位克隆酶切反应连接反应转化筛选与鉴定*三基因工程菌的建立过程适宜宿主菌的转化筛选鉴定，遗传稳定性等。目标获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载体，确保药物的生物活性。*表达筛选与产物鉴定不同菌种的表达筛选诱导表达时间和诱导强度的筛选产物存在形式和存在场所的鉴定表达部位胞外，周质，胞内；包涵体，可溶性蛋白表达产物结构与活性鉴定电泳，SDS－PAGE，等电点电泳免疫杂交，末端测序，质谱分析分析与目标产物的同一性*3.3基因工程菌的发酵培养与控制*一培养基组成与控制碳源氮源无机盐选择剂诱导物*1碳源大肠杆菌：蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源；酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等对菌体生长具有一定的促进作用。浓度稍高后就表现出底物抑制作用。葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化。*2氮源直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高的选择性。大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸为氮源*3、无机盐磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态基因工程菌生长提供必需的矿物质。*4选择剂selectiveagent维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。发酵培养过程中质粒容易丢失，使之成为宿主菌。为了保证质粒的稳定性、不丢失，根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加或缺陷选择剂。*选择剂种类营养缺陷互补和抗生素抗性。工程大肠杆菌：卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等抗生素作为选择剂；工程酵母菌：氨基酸营养缺陷型，缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。*5

诱导物诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。诱导物成为产物表达必不可少的。Lac启动子表达系统：IPTG诱导。甲基营养型酵母：加入甲醇进行诱导。*6培养基组成对质粒稳定性的影响营养较丰富的培养基，质粒稳定性高于合成培养基；限制性基质对基因工程菌的比生长速率有不同影响；大肠杆菌对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定，有一些质粒对氮源、钾、硫等表现不稳定；对于酵母，极限培养基比丰富培养基更有利于维持质粒稳定性；培养基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高质粒稳定性。*二培养工艺与控制温度溶解氧pH*1温度对工程菌发酵的影响生长大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度为10℃；大肠杆菌生长最适温度为37℃，最高温度为45℃；酿酒酵母生长最适温度为30℃，最高温度为40℃。生产生长与生产温度不一致；较高温度表达包涵体，较低温度下有利于表达可溶性蛋白质；对于热敏感的蛋白质，生产期可采用先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。*温度控制两段变温发酵培养：前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度；后期：较低温培养发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长期维持37℃，生产期提高温度42℃。*2pH值对发酵的影响细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.5～7.5，真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.0～6.0。影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同。干扰素是在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利于发挥菌株生产能力。乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。*pH控制了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，需要进一步设法控制pH在合适的范围内。分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。*3溶解氧控工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力。考虑溶氧对质粒稳定性的影响通过调节搅拌转速和通气量来调控*三终点控制根据目标基因产物的表达模式而定。适宜的诱导时间：非常重要诱导物的浓度及其发酵温度：影响表达量，产物存在形式在生产中应严格控制。*1

化学诱导表达化学诱导型启动子：lac、tac、T7等诱导时间：对数生长期细菌：IPTG诱导甲基营养型酵母：甲醇诱导。*2温度诱导表达温度诱导型启动子：PL、PR启动子两段培养发酵：诱导时间：菌体生长的对数期或稍后一些，升高温度，合成产物。*3.4重组人干扰素生产工艺*一干扰素概述概念：（interferon，IFN）机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类似、功能接近的细胞因子功能：干扰病毒在细胞内的繁殖天然干扰素分类：I干扰素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNε、IFNω

II干扰素：IFNγ上市重组干扰素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ研发中的重组干扰素：IFNω，临床阶段*重组干扰素的临床应用广谱抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ）多发性硬化症rhuIFNβ*干扰素生产工艺路线体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞人源转化细胞系培养生产工艺基因工程大肠杆菌假或单胞杆菌发酵生产工艺动物无限细胞系培养生产工艺*二生产过程工程菌的构建发酵过程产物分离和纯化*1工程菌的构建第一步：干扰素α-2b基因的克隆第二步：表达载体的构建第三步：工程菌的构建*2干扰素的发酵工艺过程*工作菌种库药瓶培养种子培养发酵培养菌体收集3干扰素的分离纯化工艺过程(1)菌体裂解裂解缓冲液：纯化水，2℃～10℃（pH7.5）；使用保护剂：EDTA，PMSF；破碎－20℃菌体：2厘米；搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2h；冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。*(2)预处理加絮凝剂聚乙烯亚胺:2℃～10℃，搅拌，对菌体碎片进行絮凝。加凝聚剂醋酸钙溶液:2℃～10℃,搅拌，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。离心连续流离心机：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀：121℃、30min蒸汽灭菌,焚烧处理。*(3)初级分离盐析:4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀静置过夜。离心：连续流离心机，16000r/min。保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃。*(4)干扰素纯化工艺过程溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装*

动物细胞培养制药工艺4.1制药动物细胞*一动物细胞的结构与功能动物细胞的结构与功能*细胞膜细胞质细胞核没有细胞壁亚细胞器动物细胞培养的代谢特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代谢的前体。葡萄糖限制葡萄糖限制：通过增加谷氨酰氨消耗得以补偿，反之通过增加谷氨酰氨消耗得以补偿，反之亦然。葡萄糖代谢：糖酵解为主，，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。另一条途径为TCA循环，彻底氧化产生CO2和水。一小部分为戊糖磷酸途径，生成生成4、5、7碳糖和NADPH。中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞有毒性。*Gln代谢：脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。Gln氮源，Gln受限，增加其他氨基酸消耗以补偿。离体动物细胞系，转氨作用是主要代谢途径。谷氨酰胺在脱氨酶的催化下，脱氨产生氨，对细胞有毒性。谷氨酰氨与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入培养液并积累。Gln能量：Glu转化为α-酮戊二酸，进入TCA循环。流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物的积累。*蛋白质糖基化与分泌表达蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体糖基化场所：内质网合成各种糖类，粗糙内质网腔内和高尔基体，加工修饰。不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞系。对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。*二制药动物细胞的种类目前用于制药的动物细胞有4类：原代细胞系二倍体细胞系异倍体细胞系融合的或重组的工程细胞系*细胞系分类来源：原代细胞，传代细胞。寿命：有限细胞系，无限细胞系。染色体数目：二倍体细胞系，异倍体细胞系。获得方式：工程细胞系，癌变细胞系。生长特性：贴壁依赖型，非贴壁依赖型细胞系。*4.2动物细胞的生产特征*一对培养条件要求严格动物细胞对周围环境十分敏感无细胞壁保护，细胞膜直接接触外界。物理化学因素：渗透压、pH、离子浓度、剪切力等耐受力很弱，容易受伤害。与细菌和植物细胞相比，动物细胞培养条件要求严格地多。*1温度哺乳动物细胞最佳培养温度为37℃鸡细胞为39℃～40℃；昆虫类细胞为25℃～28℃。耐受温度范围较窄，35℃～37℃细胞受伤：39℃～40℃1小时，但能恢复。受伤严重：41℃～42℃，部分可恢复。死亡：43℃以上。*2氧气动物细胞生长必须有氧气，缺氧时不能生存。离体培养的气体：含有5％CO2和95％空气，其中氧浓度为中氧浓度为21％。高氧环境：O2浓度60%以上，对细胞毒性较大，抑制生长和增殖，出现染色体异常等现象。有时充以有时充以N2气稀释O2浓度。*3pH值低于6.8或超过7.6会对细胞产生严重影响甚至使细胞死亡。机体细胞的pH范围为6～8，而且在血液和体液中，变化范围很小。人体：血液pH比较恒定，7.36～7.44。低于7.05发生酸中毒，高于7.45发生碱中毒。*4渗透压正常血浆渗透压为280～310mOsm/kg高渗溶液：高于310mOsm/kg低渗透压溶液：低于280mOsm/kg。动物细胞对渗透压有较强的耐受性离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液。增减NaCl的浓度调整渗透压，每增加1mg/mlNaCl，渗透压增加32mOsm/kg。*二对培养基组成要求高动物细胞对培养基的要求高完全异养，容易利用、相对低分子量的营养物12中必需氨基酸8种以上维生素多种无机盐和微量元素多种附加成分：生长类、细胞因子和贴壁因子因子及激素、结合蛋白质能源：单糖，葡萄糖，谷氨酰氨氮源：氨基酸单体化合物*三天然结构与活性的药物完善的翻译后蛋白质修饰功能游离核糖体：合成细胞质基质内的蛋白质。与膜结合的核糖体：合成分泌性和膜整合蛋白，多数为糖蛋白。修饰：内质网加工，高尔基体加工、转运、分泌，糖链。糖基化、磷酸化、酰胺化等。活性分子：装配折叠形成精确的三维结构。*四生产工艺特征产品与天然的产物一致：适于临床使用动物细胞生产：70％蛋白质药物。培养工艺：难度大，产量低，成本高。胞外分泌产物：分离纯化简单。有潜在的血源性污染危险。*4.3动物细胞培养技术*一细胞生长和基质依赖性生长基质接触抑制贴壁依赖性细胞非贴壁依赖性细胞兼性贴壁细胞*1生长基质概念：growthsubstratum把改变生长表面特性，促进细胞贴附的物质。胞外基质成分：多聚赖氨酸胶原*2接触抑制概念：contactinhibition细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。特点：保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加。有：大多数细胞无：少数悬浮培养细胞（癌细胞）*3贴壁依赖性细胞概念：anchoraged-dependentcell需要有适量带电荷的固体或半固体支持表面才能生长的细胞。大多数动物细胞都属于此类。*4非贴壁依赖性细胞概念：anchoraged-independentcell不依赖于固体支持物表面生长的细胞，可在培养液中悬浮生长，被称为悬浮细胞。举例：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞，Namalwa细胞。*5兼性贴壁依赖性细胞概念：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。举例：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。理想的药物生产细胞系。*二动物细胞培养基本过程1原代细胞分离与培养2传代细胞培养*1原代细胞培养－过程*动物组织或器官洗涤粉碎酶解消化离心或过滤洗涤培养液稀释细胞接种培养从体内取出组织或器官经过粉碎、消化而获得单细胞进行体外接种培养。37℃消化，胰蛋白酶，胶原酶工作浓度：0.1-0.3mg/ml2传代细胞培养－过程概念：对长满表面的细胞进行消化分离，接种到新的培养基上，进行新一轮培养。传代时期：刚刚全部汇合的细胞。消化方法：过程与原代细胞相同。传代的次数：不能无限次传代，保证特性。防止细胞系之间、非细胞生物的污染。要领：适宜的时期和方法，不要过度。*三动物细胞大规模培养方法1单层贴壁培养2悬浮培养3微载体培养4固定化培养*1单层贴壁培养——概念与过程细胞贴附于一定的固体支持表面上，形成单层细胞的培养过程。生长过程：接种，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面；进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。数天就长满整个表面，形成致密单层细胞。*单层贴壁培养——特点优点：容易更换培养液，灌注培养时，能达到高细胞密度；有利于产物的分泌表达，可改变培养液与细胞的比例。缺点：操作较繁杂，检测受到限制，培养条件难以均一，传质和传氧差，放大培养是瓶颈。*2悬浮培养细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培养过程优点：操作简单，培养条件相对均一，传质和传氧较好，容易放大培养。缺点：细胞体积小，密度低，培养病毒易失去标记而降低免疫能力。适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性*3微载体培养概念：细胞贴附于微载体上伸展和增殖，再悬浮于培养液中的培养过程。优点：细胞生长的环境均一，培养基利用率高，重复性好，减少了劳动强度，容易放大。兼具贴壁和悬浮培养的双重优点微载体，多孔微载体应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原。*4固定化培养概念：用物理、化学方法将细胞固定在载体介质上，然后进行悬浮培养。应用：贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞。优点：细胞密度高、抗剪切力和污染，生产首选方法共价交联：双功能试剂处理，细胞之间交联。吸附：物理吸附使细胞贴附在固体载体表面。包埋：细胞包埋在载体内部。微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内。*4.4重组人红细胞生成素生产工艺*一概述天然红细胞生成素的发现与种类理化性质重组人红细胞生成素及其临床应用重组人红细胞生成素表达研究*1天然红细胞生成1890：现象，低氧压下红细胞增多1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出红细胞生成素（erythropoietin，EPO）。形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸组成及顺序相同，166aa，活性类似。糖基化及其含量不同：EPO-α含有较多的N-乙酰葡糖胺，总含糖量比EPO-β高。*2EPO的理化性质大小：166aa糖链占分子量的39%。糖基化程度与准确性对活性影响很大。pI4.2～4.6，对热和pH变化相对稳定。*3重组人红细胞生成素第一代：两种，rhEPO-α和rhEPO-β。1989：Amgen,Epogen；1990,OrthoBiotech,ProcritCHO、BHK细胞系生产第二代：EPO突变体，2001,Amgen,Arasnep长效。二联体或三联体EPO：高活性，长效（3－5倍）适应症：肾性贫血、艾滋病患者贫血、癌症相关贫血等。隔日注射一次，长效EPO：每周一次。*4rhEPO的表达研究由再生障碍性贫血患者的尿液中纯化而得，人源的红细胞生成素。产量极其有限。SV40病毒启动子驱动表达载体，在COS-1中瞬时表达红细胞生成素昆虫SF9细胞中杆状病毒系统表达rhEPO。产率有所改善，但糖基化程度较小干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，BALL-1细胞，产生较高量的rhEPO。*大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。家蚕体内的表达系统，糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。在CHO、BHK细胞系统中稳定表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。*二CHO培养工艺工程CHO细胞系建立种子细胞制备反应器培养工艺培养过程控制*1工程CHO细胞系*共转染，筛选稳定表达的细胞系稳定转染的筛选培养胰蛋白酶消化，1：5稀释，在含有1nMMTX培养基上培养，3－4d更换培养基，培养10～14天，至性克隆出现。胰酶消化，1：5稀释，按1nM→5nM→25nM→100nM→200nM→1000nM使MTX浓度逐次升高，筛选抗性克隆。抗性克隆培养于100mm培养皿中，按1：500稀释，继续培养3～5天，集落2-4mm。酶联免疫分析：确认表达人红细胞生成素*2种子细胞制备冻存的细胞株37℃水浴，无菌离心。加适量DMEM培养基（10%小牛血清）。37℃、CO2培养箱培养，连续传三代。细胞消化后接种，制成接种细胞浓度。*3灌流培养反应器灭菌：加纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，高压灭菌1.5h。接种：排出PBS缓冲液，加DMEM培养基，接种。贴壁培养：pH7，<50r/min，37℃，DO50-80%。扩增培养：80－100r/min。灌流培养：控制温度、DO、pH值等培养条件，进行无血清培养基连续培养。收获培养物，4℃－8℃保存。*4培养工艺过程控制搅拌控制：接种后,搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度。温度控制：较为严格，恒定37℃pH值控制：7.2-7.4,输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。溶解氧控制：在50％-80％的范围内，通入氧气、空气或氮气的比例混合气体。葡萄糖控制：流加补料代谢废物控制：监测氨、乳酸盐类等，维持较低浓度，减少对细胞损害。*三rhEPO的分离纯化工艺初级分离精制纯化产品质量控制*1初级分离收获培养液：离心过滤：滤膜亲和色谱：NaCl－Tris平衡，梯度洗脱，收集活性洗脱峰透析：0.1mMTris，过夜，换液4次。过滤：0.22μm滤膜。*2纯化精制DEAE离子交换：NaCl-Tris梯度洗脱，收集活性峰。RP-HPLC：乙腈梯度洗脱，收集活性洗脱峰。凝胶过滤：柠檬酸盐缓冲液洗脱，收集活性峰过滤：0.22μm滤膜。rhEPO产品：蛋白含量为1.2mg/ml，其比活可为2×105IU/mg。*3EPO的质控与活性检测纯度，蛋白质含量，分子量等体外活性：ELISA测定（原理免疫沉淀），单位unit（IU）体内活性：网织红细胞计数法，注射BALB/c小鼠，眼眶取血，染色，涂片计数网织红细胞数。比活性(specificactivity,U/mg)：单位重量蛋白质(mg)中所含的活性*

药物合成工艺研究6.1概述*在设计和选择了合理的合成路线后，就需要进行生产工艺条件研究。合成路线通常可由若干个合成工序组成，每个合成工序包含若干个化学单元反应。这些化学单元反应往往需要进行实验室工艺研究（小试），以便优化、选择最佳的生产条件，也为中试放大作制备。药物的生产工艺也是各种化学单元反应与化工单元操作的有机组合与综合应用。*现代有机合成反应特点:反应条件温和，反应能在中性、常温和常压下进行；高选择性（立体、对映体）；需要少量催化剂（1%1%）；无“三废”或少“三废”。*one-potreaction(一勺烩）即多个化学单元反应合并成一个合成工序的生产工艺。也称一锅法。后处理：包括产物的分离、精制。它是药物工艺研究的重要组成部分，只有经过后处理才能最终得到符合质量规格的药物。*探讨药物工艺研究中的实践及其有关理论，需要研究反应物分子到生成物分子的变革及其过程，包括：反应过程的内因（物质的性能）反应过程的外因（反应条件）合成药物工艺研究需要探索化学反应条件对反应物所起作用的规律性。只有对化学反应当内因和外因，以及它们之间的相互关系深入了解后，才能正确地将两者统一起来考虑，才有可能获得最佳的工艺。*新药合成工艺研究的七个重大课题配料比参与反应当各物料相互间物质量的比例称为配料比。通常物料以摩尔为单位，则称为投料的摩尔比。溶剂化学反应的介质、溶剂化作用催化酸碱催化、金属催化、