大学课程：反义RNA技术

反义RNA技术反义基因技术（antisensetechnique）是19世纪80年代发展起来的一项基因表达调控技术，它为植物基因工程在农业上及相关产业上的应用开辟了广阔的前景。反义基因技术的基本概念和原理所谓反义RNA是指有义DNA链转录成的，与特异的靶RNA互补结合并能抑制靶RNA表达的一段序列。转录产生反义RNA的基因称之为反义基因（antisensegene）。所谓植物反义RNA技术是指把一段DNA序列以反义方向插入到合适的启动子和终止子之间，然后把此基因构建体转化到植物中去（通常用农杆菌转化的方法）进行选择培养以获得转化植株的技术。反义基因转录生成的mRNA可以抑制具有同源性的内源基因的表达，用这种方法可获得特定基因表达受阻而其他不相关基因的表达不受影响的转基因植株。一般认为，在原核细胞中反义RNA与靶RNA具有特异互补性，通过碱基配对结合的方式在复制(replicate)、转录(transcript)、翻译(translation)等过程中对目的基因起着负调控作用（图2-3），但详细的机理还不清楚。真核生物尚未找到天然存在的反义RNA，但有一些小RNA分子可能起类似反义RNA的作用，反义RNA在真核细胞中的作用机制目前尚不清楚。研究发现，不仅与靶5`端互补的反义RNA有抑制作用，而且与3`端互补的反义RNA有抑制作用，而且反义RNA在真核细胞中的抑制作用具有高度的专一性。进一步研究认为反义RNA或DNA与形成RNA·DNA或DNA·DNA杂交链,或抑制翻译起始，或抑制RNA多聚/酶体上的翻译，或抑制从核内向胞质的转运。图2-3反义RNA对mRNA翻译过程的调控作用（闻伟等，1990）2．反义基因技术的特点经过20多年的研究和应用发现，反义基因技术有许多特点使其能够很好地应用于实践，总结起来有以下一些特点：（1）反义RNA可以高度专一地调节某一特定基因的表达，不影响其它基因表达。反义基因的不同区段抑制效率不同，基因的部分片段（小至41bp）就可起到抑制效果，抑制程度理论上从0%到100%，这不同于基因的完全致死抑制，因此可从转基因个体中筛选到所需要的基因型。（2）转化到植物中的反义RNA的作用类似于遗传上的缺陷型，表现为显形。所以被转化的植物材料不必为纯合体就可表现相应的性状，从而避免了二倍体内等位基因的显隐性干扰。（3）反义基因整合到植物的基因组中可独立表达和稳定遗传，后代符合孟德尔遗传规律(MendelianGeneticsRule)。用反义基因不必了解其目的基因所编码的蛋白质结构，可省去对基因产物的研究工作。反义基因不改变目的基因的结构，在应用上更加安全。3．反义基因技术的应用反义基因技术已经是相对比较成熟的技术，利用反义基因技术人为地控制生物体内某些基因的表达是植物基因工程中有巨大应用前景的研究。世界上第一个基因工程商业化园艺产品，就是利用反义基因技术将反义PG基因转入番茄得到的耐贮运的番茄。具体的应用实例可见本章4。可以说，反义基因技术为食品生物技术的发展开辟了广阔的应用前景。

1988年美国sheehy和英国smith分别独立地构建了PG反义RNA系统，smith1990年所获得的转PG反义基因番茄经研究表明：一个反义基因的转入可以99/100的效率抑制PG的产生，PG活性的降低有效的抑制了细胞壁果胶的降解，而反义RNA只专一的抑制PG活性，对番茄果实成熟的其它指标如乙烯产生，转化酶活性无影响，有效的促使番茄果实延熟，并使其在贮藏期间较少的感受真菌感染。实验表明转反义PG基因的番茄虽然在硬度上与对照组没有区别，但很明显地延长了贮藏寿命和增加了运输过程的抗破坏的能力。转反义PG基因的果实用冷破粹的方法处理的番茄汁与对照组相比黏度增加，有力的提高了番茄加工的品质。因此PG基因也被称为黏度基因。由于乙烯是促使番茄成熟的激素，利用反义基因技术抑制生物合成的研究也已获得突破性进展，这种转基因番茄能99。5/100的抑制乙烯合成，果实不能正常成熟，不出现呼吸高峰，室温放置90--120天不变红，不变软。只有通过外源乙烯或丙烯诱导才能成熟，成熟的果实的品质和正常番茄相同，这说明通过反义基因技术控制乙烯的生物合成有可能获得耐贮的番茄品种。反义PG基因技术意义反义基因技术已经是相对比较成熟的技术，已经为在基因水平研究果蔬成熟衰老机制开拓了一片广阔的领域，如前所述已经在很多领域有了具体的应用。而PG在果实成熟衰老中的地位也正为人们所认识，所研究。当然，对于PG许多方面的认识更多的还是未知数。还需要我们做很多的工作去揭开PG神秘的面纱如PG在果实衰老过程中的作用时间：是整个过程还是在特定阶段出现并起作用，再如PG对果实的有效最低作用量：是12/100还是0.05/100等。反义基因技术与PG的结合恰是认识PG的一条可行的捷径。而反义PG表达载体的构建则是其中的关键步骤和中心环节。同时PG与乙烯在很多方面有相关性，对PG的深入研究也有助于进一步理解乙烯作用的机理。

对PG受阻后基因表达载体及果实品质改变的研究，不仅对于系统地，全