生物化学-王镜岩版-上省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

第七章蛋白质分离、纯化与表征分离纯化之前确保蛋白质一定纯度依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体亲和性若要研究蛋白质功效则要求高级结构完整第1页1、蛋白质理化性质：酸碱性质、胶体性质与沉淀、颜色反应、变性2、分离纯化方法：盐析、电泳、等电聚焦、层析等第2页蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质溶解度最小，在电场中不移动。在不一样pH环境下，蛋白质电学性质不一样。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳1、酸碱性质第3页PCOOHNH3+PCOO-NH3+PCOO-NH2阳离子PH<PI阴离子PH>PI兼性离子PH=PIH+OH-H+OH-可解离基团有末端和侧链故pI与酸性、碱性氨基酸数目相关如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性有些球蛋白可解离基团只有变性后才能完全滴定没有盐类干扰时等电点叫等离子点第4页蛋白质分子颗粒直径已达1-100nm，处于胶体颗粒范围。所以，蛋白质含有亲水溶胶性质。因为胶体溶液中蛋白质不能经过半透膜，所以能够应用透析法将非蛋白小分子杂质除去。2、蛋白质胶体性质：第5页蛋白质胶体性质布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，含有吸附能力蛋白质溶液稳定原因：1）表面形成水膜（水化层）2）带相同电荷。第6页蛋白质胶体溶液稳定性与它分子量大小、所带电荷和水化作用相关。改变溶液条件，将影响蛋白质溶解性质在适当条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。蛋白质沉淀作用第7页加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。分段盐析：调整盐浓度，可使混合蛋白质溶液中几个蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。2.加有机溶剂加重金属盐加生物碱试剂单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。第8页在温和条件下，经过改变溶液pH或电荷情况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生改变，在适当条件下，能够重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。可逆沉淀第9页在强烈沉淀条件下，不但破坏了蛋白质胶体溶液稳定性，而且也破坏了蛋白质结构和性质，产生蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。因为沉淀过程发生了蛋白质结构和性质改变，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。不可逆沉淀第10页一、蛋白质在一些理化原因作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质变性。二、变性实质是破坏了蛋白质空间结构，并不引发一级结构改变。变性恢复3、蛋白质变性第11页蛋白质性质与它们结构亲密相关。一些物理或化学原因，能够破坏蛋白质结构状态，引发蛋白质理化性质改变并造成其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质变性(denaturation)。第12页在一些物理或化学原因作用下，蛋白质严格空间结构被破坏（不包含肽键断裂），从而引发蛋白质若干理化性质和生物学性质改变第13页蛋白质变性变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所含有性质。所以，蛋白质变性通常都伴伴随不可逆沉淀。引发变性主要原因是热、紫外光、激烈搅拌以及强酸和强碱等。第14页变性蛋白质主要标志是生物学功效丧失。溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分子形状改变，肽链涣散，反应基团增加，易被酶消化。变性蛋白质分子相互凝集为固体现象称凝固。有些蛋白质变性作用是可逆，其变性如不超出一定程度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。第15页引发蛋白质变性原因有：①物理原因：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等；②化学原因：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。第16页变性蛋白质性质改变：①物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。③生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。第17页蛋白质变性可逆性：蛋白质在体外变性后，绝大多数情况下是不能复性；如变性程度浅，蛋白质分子构象未被严重破坏；或者蛋白质含有特殊分子结构，并经特殊处理则能够复性。第18页核糖核酸酶变性与复性第19页蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出现象称为沉淀。变性后蛋白质因为疏水基团暴露而易于沉淀，但沉淀蛋白质不一定都是变性后蛋白质。加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。所以，凡凝固蛋白质一定发生变性。第20页反应名称试剂颜色反应相关基团有此反应蛋白质或氨基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键全部蛋白质米伦反应AgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物红色

Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色

Trp坂口反应(Sakaguchi反应)α-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基α-氨基酸

4、蛋白质颜色反应—OHN第21页大部分蛋白质均含有带芳香环苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸在280nm附近有最大吸收。所以，大多数蛋白质在280nm附近显示强吸收。利用这个性质，能够对蛋白质进行定性判定。5、蛋白质紫外吸收第22页蛋白质分离与纯化方法（一）盐析与有机溶剂沉淀：盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。第23页惯用中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时，溶液pH在蛋白质等电点处效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引发蛋白质变性。第24页分段盐析：

半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。

第25页2.有机溶剂沉淀蛋白质：凡能与水以任意百分比混合有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。沉淀原理是：①脱水作用；②使水介电常数降低，蛋白质溶解度降低。第26页（二）电泳：带电粒子在电场中移动现象称为电泳（electrophoresis)蛋白质分子在溶液中可带净负电荷或带净正电荷，故可在电场中发生移动。不一样蛋白质分子所带电荷量不一样，且分子大小也不一样，故在电场中移动速度也不一样，据此可相互分离。第27页电泳蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质电泳现象，能够将蛋白质进行分离纯化。第28页自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液支持物上进行电泳，不一样组分形成带状区域。（1）纸上电泳：用滤纸作支持物。（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。第29页1）圆盘电泳：玻璃管中进行凝胶电泳。+—2）平板电泳：铺有凝胶玻板上进行电泳。-+两种凝胶电泳第30页等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。++－－－－+－－－－－5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－第31页SDSPAGE中SDS作用：阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态屏蔽蛋白质电荷，都带负电荷使得蛋白质形状趋于一致所以在这种特殊电泳中，迁移率与蛋白质电荷无关，与蛋白质形状无关，取决于蛋白质大小（分子量）第32页（三）层析：层析（chromatography)是一个利用混合物中各组分理化性质差异，在相互接触两相（固定相与流动相）之间分布不一样而进行分离分析技术方法。主要层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。第33页凝胶过滤分离蛋白质第34页（四）超速离心：利用物质密度不一样，经超速离心后，分布于不一样液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质分子量，蛋白质分子量与其沉降系数S成正比。第35页蛋白质相对分子量在10000-1000000之间。测定分子量主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25-50*104g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里沉降速度。

s=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心距离（cm）沉降系数单位惯用S，1S=1×10