类糖胺聚糖改性的纳米金表面对胚胎干细胞神经分化的影响分析研究 功能材料学专业

目录第一章前言 31.1胚胎干细胞神经分化概述 31.2类糖胺聚糖对胚胎干细胞神经分化的影响 31.3金纳米粒子（AuNPs）的性能 41.4课题提出 5第二章实验部分 62.1试剂与仪器 62.2金纳米粒子聚合物的制备 82.2.1MAG的制备 82.2.2MAG的RAFT聚合 82.2.2.1PMAG的胺解 92.2.3SS的RAFT聚合 92.2.3.1PSS的胺解 102.2.4AuNPs的制备 102.2.5类糖胺聚糖改性AuNPs的制备 112.3聚合物及其改性AuNPs的表征 112.3.1核磁共振氢谱（1H-NMR）测试 112.3.2气相凝胶渗透色谱（GPC）测试 122.3.3动态光散射（DLS）测试 122.3.4透射电镜（TEM） 122.3.5紫外可见光测试（UV-visible） 122.4细胞实验 122.4.1细胞毒性测试 122.4.1.1L929细胞复苏 132.4.1.2L929细胞传代与计数 132.4.1.3L929细胞种植 142.4.1.4L929细胞毒性测试 142.4.2胚胎干细胞（MECs）培养 142.4.2.1小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞的复苏、传代与冻存 152.4.2.2MEF饲养层细胞的准备 152.4.2.3MES细胞的复苏 162.4.2.4小鼠胚胎干细胞的分化培养 162.4.2.5免疫荧光染色 162.4.2.6聚合链式反应（PCR） 17第三章结果与讨论 193.1单体以及聚合物的核磁图 193.1.1MAG的表征 193.1.2PMAG的表征 203.1.3PSS的表征 203.2PMAG与PSS的GPC测试 213.3PMAG-SH与PSS-SH的紫外可见光测试 213.4金纳米粒子及其聚合物的性能表征 223.4.1金纳米粒子的透射电镜（TEM）测试 223.4.2金纳米粒子及其聚合物的动态光散射（DLS）测试 233.4.3金纳米粒子及其聚合物的可见光测试 243.5金纳米粒子及其聚合物的细胞毒性测试 253.6金纳米粒子及其聚合物对胚胎干细胞神经分化的检测 263.6.1胚胎干细胞的免疫荧光染色 263.6.2胚胎干细胞PCR测试 27结论及展望 28参考文献 29致谢 32摘要胚胎干细胞（ESCs）的多向分化潜能可以为神经系统疾病提供细胞替代治疗，即诱导ESCs向神经细胞方向分化，从而获得具有神经干细胞特性的细胞来代替坏死细胞。ESCs可以由特定生长因子或其他生物活性分子在体外诱导分化为特定的细胞类型，如：糖胺聚糖（GAG）作为一类生物活性分子可诱导ESCs定向分化为神经细胞。本论文基于糖胺聚糖促进神经分化的生物活性，采用苯乙烯磺酸钠（SS）（含磺酸基团）和N-甲基丙烯酰胺基葡萄糖（MAG）（含糖环）两种单体的可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合方法来制备类糖胺聚糖聚合物，通过聚合物末端基团的胺解还原来获得巯基末端，并进一步将两种聚合物组装到金纳米粒子（AuNPs）表面，利用AuNPs与细胞的相互作用将类糖胺聚糖聚合物富集到细胞表面，从而提高类糖胺聚糖诱导ESCs神经分化的能力。该策略以AuNPs作为类糖胺聚糖聚合物的富集载体，可以有效的调控磺酸基团和糖环两种结构单元在AuNPs表面的比例，从而系统的研究糖胺聚糖中糖单元与磺酸单元组成比例对其促进神经分化功能的影响规律。关键词：胚胎干细胞、神经分化、类糖胺聚糖、金纳米粒子

AbstractEmbryonicstemcells(ESCs)ofmulti-directionaldifferentiationpotentialcanprovidecellreplacementtherapyfordiseasesofthenervoussystem,Inthisway,ESCsareinducedtodifferentiateintonervecells,thusobtainingcellswiththecharacteristicsofneuralstemcellsinsteadofnecroticcells.ESCscanbyspecificgrowthfactorsorotherbiologicallyactivemoleculesinvitrodifferentiationforaparticularcelltypes,suchas:sugarglycosaminoglycans(GAG)asakindofbioactivemoleculescanbeinduceddirectionaldifferentiationofESCsintonervecells.Inthispaper,basedonsugarglycosaminoglycanspromotethebiologicalactivityofnervedifferentiation,usingsodiumstyrenesulfonate(SS)(containingsulfonicacidgroup)andN-methylacrylamideglucose(MAG)(sugaryloop)reversibleadditionoftwokindsofmonomer-breakingchaintransfer(RAFT)polymerizationmethodtothepreparationofaminesugarchitosanpolymer,byaminesolutionofpolymerendgroupsalsooriginalthiolend,andfurthertotwokindsofpolymerassemblytothesurfaceofgoldnanoparticles(AuNPs),usingtheinteractionofAuNPsandcellaminesugarglycanenrichmentofpolymertothecellsurface,ToimproveclasssugarglycosaminoglycansinducedESCsneuraldifferentiationability.ThestrategytoAuNPsasclasssugarenrichmentofglycosaminoglycansofpolymercarrier,caneffectivelycontrolandsugarsulfonicacidgroupstwokindsofstructuralunitsintheproportionofthesurfaceofAuNPs,thussystemresearchofglycosaminoglycansinsugarsugarunitswithsulfonicacidcompositiononitspromotingfunctionofneuraldifferentiationregularity.Keywords:Embryonicstemcells、Neuronaldifferentiation、Glycosaminoglycans、AuNPs

第一章前言1.1胚胎干细胞神经分化概述胚胎干细胞（Embryonicstemcell，ESCs）是从附置前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外抑制分化培养的一种全能性细胞系，它既具有细胞系可扩增、遗传和冻存的特点；又类似胚胎细胞，具有发育的全能型。近些年来，中枢神经退行性疾病（例如：帕金森病、阿尔兹海默氏病和脊髓损伤等）严重危害了人类的健康，而胚胎干细胞的多向分化潜能可以为这些疾病提供细胞替代治疗，即诱导ESCs向神经细胞方向分化，从而获得具有神经干细胞特性的细胞来代替坏死细胞。一般来说，诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞有很多种方法，由于胚胎干细胞可以由特定生长因子或其他生物活性分子在体外诱导分化为特定的细胞活组织[1-3]，所以我们可以在培养基中加入生长因子（例如：神经生长因子（NGF）、表皮生长因子（EGF）以及成纤维细胞生长因子（FGF））来促进ESCs进行神经分化[4-6]，但是这些生长因子的成本比较高，存放也比较困难，因此极大的限制了它们的应用。近年来，研究者们发现糖胺聚糖（GAG）具有促进ESCs进行神经分化的功能[7]，GAG是存在于体细胞中的活性大分子，即一类有特定重复二糖结构单元的线性多糖分子，其重复的二糖结构单元通常为一个氨糖（D-氨基葡萄糖或氨基半乳糖）与一个糖醛酸（葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸）残基组成，由于单糖不同程度的硫酸酯化结构，使重复单元具有结构多样性，因此GAG在结构上具有复杂性和异构性。硫酸乙酰肝素（heparansulfate,HS）是一种常见的GAG，它已经被证明可以促进神经细胞的分化[22-26]，但后续研究中，当HS无法正常硫酸酯化时，ESCs的神经分化受到了抑制[25]，因此证明硫酸酯化对干细胞分化有着重要的作用。与此同时，另外还有研究证明，特定的糖环骨架结构，如葡萄糖胺结构，对干细胞的分化也有不可缺少的作用[20]。因此我们将运用具有磺化单元和特定糖环的生物活性大分子来诱导ESc的神经分化。1.2类糖胺聚糖对胚胎干细胞神经分化的影响类糖胺聚糖是一种模拟GAG的化学结构并且具有与其相似生物功能的生物大分子。我们已知GAG对ESc的神经分化有很好的诱导作用，但是GAG是哺乳动物分泌的天然大分子，它有其固有的缺点，如：结构异质性、杂质以及其不受控制的多糖骨架和磺酸结构[8]，所以研究者们合成了一些具有GAG生物活性的GAG类似物[8-10]，这样既克服了GAG的固有缺点，又保留了它的生物活性。因此类糖胺聚糖对研究ESc的神经分化是至关重要的物质。近年来，陈红课题组基于糖单元（N-甲基丙烯酰胺基葡萄糖，MAG）和磺酸单元（苯乙烯磺酸钠，SS）的共聚构建了一种类糖胺聚糖聚合物结构，通过调节共聚物中糖单元和磺酸单元的比例获得了优于天然糖胺聚糖的促进神经分化的效果[11-12]，由此可见，类糖胺聚糖中的糖单元和磺酸单元的组成比例对其促进神经分化的功能至关重要。1.3金纳米粒子（AuNPs）的性能金纳米粒子是最早出现、研究最为深入的纳米材料之一，其独特的理化性质使其受到了越来越广泛的关注。目前各种金纳米粒的合成方法已经非常成熟，而对其应用性的研究则成为热点。由于金纳米粒子制备简便，而且具有良好的生物相容性，除此之外，它的粒径可控且稳定性好。因此金纳米粒子广泛应用于医学检测分析、生物传感以及疾病诊断和治疗等生物学领域[13-15]。金纳米粒子最为经典的应用便是其在生物检测中的应用，例如基于金纳米粒子的检测试纸条是发展非常迅速的一种快速检测蛋白质和核酸的方法[16-17]。而金纳米粒子修饰的电化学传感界面为DNA的识别与电化学信号的传输提供了更好的方案，为未来基因诊断的发展提供了新的机遇[18]。除此之外，金纳米粒子由于其高比表面积、易于修饰和多价态的特点被广泛应用于药物传输领域[19-20]，其作为药物运载工具的优势主要为依赖于它的高比表面积、可功能化、多价位、靶向性以及生物相容性，这些特点使得它具有比一般生物载体要高的载药量，还有与其他生物分子相互作用的能力以及较高的靶向功能等，所以金纳米粒子也被用作除载体以外的稳定剂。研究证明一定粒径的AuNPs与细胞之间具有较强的相互作用[21]，利用AuNPs这一特性可以实现其表面负载生物分子在细胞表面的富集，从而提高生物分子的利用度，促进生物分子功能的实现。1.4课题提出糖胺聚糖对ESCs神经分化的促进作用依赖于其结构中的糖单元和磺酸单元，其中糖单元和磺酸单元的组成比例对其促进神经分化的功能至关重要，本论文分别以苯乙烯磺酸钠（SS）（含磺酸基团）和N-甲基丙烯酰胺基葡萄糖（MAG）（含糖环）为单体，采用可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合方法来制备类糖胺聚糖聚合物PMAG与PSS，并通过胺解还原的方法在聚合物末端形成巯基，进而以AuNPs作为类糖胺聚糖的载体，利用AuNPs与细胞的相互作用将类糖胺聚糖聚合物富集到细胞表面。通过两者在AuNPs表面的组装对类糖胺聚糖分子中两种结构单元的比例进行精确和可控的调节，在保证良好细胞活性的基础上探讨这种经组成比例不同的类糖胺聚糖改性的AuNPs对ESCs神经分化的影响，从而系统研究糖胺聚糖中糖单元和磺酸单元组成比例对其促进神经分化功能的影响规律，为类糖胺聚糖分子的设计和合成提供实验依据和理论指导。

第二章实验部分2.1试剂与仪器本实验中所运用的所有仪器及试剂均在下列表格中。实验中所使用的氮气为高纯氮(99.999%)。细胞实验所用水质均为无菌超纯水，且经过实验室ELGA纯水系统纯化。小鼠成纤维细胞(L929)购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。表2-1原材料及辅助药品表2-2实验仪器2.2金纳米粒子聚合物的制备2.2.1MAG的制备将盐酸葡萄糖胺（5g）和无水K2CO3（5g）加入到无水甲醇（125ml）中，通氮气并在室温下搅拌15分钟至盐酸葡萄糖胺充分溶解，而后，在冰浴（冰甲醇和冰块）下将甲基丙烯酰氯（1.8ml）用注射器逐滴加入使其反应12h，得白色液体；抽滤瓶除去溶液中的无水K2CO3，然后通过真空旋蒸仪蒸至产物有微量的析出，使其过柱色谱（二氯甲烷：无水甲醇4:1），得白色粉末，放入真空干燥箱中得2.6242g（产率52.5%）。图2.1MAG合成图2.2.2MAG的RAFT聚合将MAG（0.7939g）、CTA（0.0090g）和AIBN（0.0026g）加入到3.2mlDMF/H2O(1:1)中，通氮气30min并在室温下搅拌使所有药品溶解,而后密封，将其置于手套箱中，在70℃的油浴下反应8h，；反应完毕取出，溶液呈粉色，将其置于液氮中急速冷却使反应停止，将溶液透析3天后冻干，得0.5988g(产率75.4%)。图2.2PMAG合成图2.2.2.1PMAG的胺解将超纯水加入到PMAG中使其刚好溶解，而后加入200ul乙醇胺，搅拌6h，反应结束后，溶液呈白色，将其装袋透析2天后冻干。图2.3PMAG胺解反应图2.2.3SS的RAFT聚合将SS（1.319g）、CTA（0.0180g）和AIBN（0.0052g）加入到6.4mlDMF/H2O(1:1)中，通氮气30min并在室温下搅拌使所有药品溶解,而后密封，将其置于手套箱中，在70℃的油浴下反应8h；反应完毕取出，溶液呈粉色，将其置于液氮中急速冷却使反应停止，将溶液透析3天后冻干，得0.6370g(产率48.3%)。图2.4PSS合成图2.2.3.1PSS的胺解将超纯水加入到PSS中使其刚好溶解，而后加入200ul乙醇胺，搅拌6h，反应结束后，溶液呈白色，将其装袋透析2天后冻干。图2.4PSS胺解反应图2.2.4AuNPs的制备将100ml的超纯水和516ul的HAuCl·4H20加入到用王水浸泡并烘干的250ml圆底烧瓶中，把圆底烧瓶放到130℃的油浴锅中并通冷凝水，冷凝管口放置保鲜膜防尘，沸腾后加入10%的柠檬酸钠，当溶液变红时，计时反应十分钟；反应完毕后，使其自然冷却，分装入50mlPE管（95%乙醇超声并烘干）中。2.2.5类糖胺聚糖改性AuNPs的制备将PSS-SH和PMAG-SH用超纯水配制为浓度2mg/ml，再将装有相同体积（10ml）的AuNPs溶液的离心管用离心机（12000rpm，4℃，15min）离心，移除上清液，随后将PSS-SH溶液和PMAG-SH溶液以每毫升AuNPs溶液40ul聚合物溶液的量分别加入到其中两支离心管中，然后再以每毫升AuNPs溶液20ulPSS-SH溶液和20ulPMAG-SH溶液的量加入到另外一支离心管中，将这三支离心管中的溶液混匀后，固定在摇床中，反应24h。取出离心管再用离心机（12000rpm，4℃，15min）将其离心，再用超纯水将其稀释至100ul。2.3聚合物及其改性AuNPs的表征在合成实验中，我们对所合成的单体MAG采用1H-NMR测试对其进行表征，对PMAG-SH与PSS-SH采用紫外光谱法进行表征，对聚合物PSS与PMAG采用1H-NMR以及水相GPC测试对其进行表征，对一系列金纳米粒子聚合物采用动态光散射（DLS）测试来对其进行表征。2.3.1核磁共振氢谱（1H-NMR）测试分别称取MAG、PMAG、PSS10mg于600ul的氘代试剂中，充分震荡使其溶解，然后将其全部转移至核磁管，进行送样测试。2.3.2气相凝胶渗透色谱（GPC）测试分别称取PMAG-SH与PSS-SH4mg于2ml的缓冲液中，震荡使其充分溶解，进行送样测试。2.3.3动态光散射（DLS）测试将制得的金纳米粒子及其复合物稀释配制成浅色偏透明的溶液进行包括粒径（size）和电势（Zetapotential）的测试。2.3.4透射电镜（TEM）将制得的金纳米粒子溶液稀释一定的程度，吸取6µl金纳米粒子悬液在专门测试的铜网上，在室温下放置，待液体挥发干即可送去测试（120kV）。2.3.5紫外可见光测试（UV-visible）将经过巯基化的两种聚合物及其未巯基化的聚合物分别配制成2mg/mL的溶液进行紫外可见光测试。2.4细胞实验2.4.1细胞毒性测试在本实验中，我们将采用L929细胞进行聚合物的毒性测试，这是因为L929细胞是由小鼠身上获得的成纤维瘤细胞，它往往贴壁生长，容易大量增殖且具有很强的环境适应性，所以在体外培养比较简单而且效果较好。2.4.1.1L929细胞复苏提前10min开启无菌操作台中的紫外灯进行消毒，从冰箱中取出小管胎牛血清（FBS）放入常温，取出1640培养液放在常温下预热；接下来依次：关紫外开灯、开风机、开舱门、放入废液杯、点酒精灯、清洁台面及器物，准备好离心管、移液管、培养液以及血清，转移到工作台的物品必须先喷酒精消毒后再用酒精棉擦拭。用镊子从液氮罐中取出一支L929细胞冻存管，液氮完全挥发后用手反复揉搓冻存管10-15s，再用封口胶将其封住放入37℃水浴锅中震荡，当冻存管中有少量冰残留时将其取出，用75%酒精擦拭表面后迅速转移至工作台内；吸取2-3ml已经预热的1640培养液逐滴加入到冻存管直至液满，再将其全部吸至移液管中，重复一次，加入到离心管中，将离心管放入离心机中离心（1200rpm）5min，同时，准备好T25培养瓶；等离心完毕后，弃上清，用适量1640培养液重悬细胞并反复吹打，将吹打好的细胞悬液加入到事先准备好的T25培养瓶中，补加1640培养液至4.5ml，再添加500ul的FBS，盖上瓶盖，写上标签，放入CO2含量为5%、湿度为95%以及恒温37℃的培养箱中进行培养，每天换液。2.4.1.2L929细胞传代与计数当培养瓶中细胞密度达到90%以上时需进行传代处理，首先胰蛋白酶、FBS、无菌PBS以及1640培养液放入常温，清洁台面后，将恢复到室温的培养液等物品转入操作台内；取出L929细胞，用显微镜观察细胞状态，随后将细胞移入操作台内，用移液管吸出瓶内培养基，弃之，再用移液管吸取2ml无菌PBS加入到培养瓶中进行清洗，轻轻震荡后弃之，然后加入适量胰蛋白酶，轻轻震荡，置于培养箱中消化2min，将培养瓶取出置于显微镜下，观察细胞有脱落的征兆时，将胰蛋白酶吸出，加入2ml的1640培养液并在瓶中反复吹打使细胞脱离瓶壁，将细胞悬液移至离心管中，离心（1200rpm）5min，弃上清液，用适量1640培养液重悬细胞，反复吹打。吸取20ul台盼蓝溶液与20ul细胞悬液于1.5ml的离心管中，震荡混匀，用移液枪将其移至用酒精消毒过的计数板上，将计数板放在显微镜台面上，调节显微镜进行计数；计数完毕后根据实验所需细胞量吸取一部分细胞至离心管中。剩余细胞进行传代，即：剩余细胞转移至T25培养瓶中，向培养瓶中补添1640培养液至4.5ml，再加入500ulFBS，盖上瓶盖，瓶身标记，将其转移至温度为37℃，CO2含量为5%以及湿度适中的培养箱中进行培养，每天换液。2.4.1.3L929细胞种植实验采用96孔板且每孔的细胞密度为1万，所以将计数时保留在离心管的细胞悬液按实验所需的量种于孔板中，每孔的细胞悬液和1640培养液总体积为180ul，FBS为每孔20ul，然后将孔板置于恒温37℃，CO2含量为5%的培养箱中培养24h，使其充分贴壁。2.4.1.4L929细胞毒性测试将前期合成的金纳米粒子及其聚合物转移至细胞房中，清洁操作台，然后把2ml的针管、水相滤膜、1640培养液、FBS以及金纳米粒子聚合物用酒精消毒并转至操作台面上，首先分别用四支针管吸取聚合物溶液，通过滤膜将其中的大分子以及细菌过滤掉，滤过的聚合物溶液置于新的1.5ml离心管中；由于聚合物溶液与1640培养液的总体积是每孔180ul，且每孔聚合物的浓度为0.5nmol/L，而原始聚合物溶液的浓度为1.2nmol/L，经计算配制出每种聚合物与1640培养液混合的总体积；接着从培养箱中取出孔板至操作台上，将其中的培养液吸出，弃之，并分别在相应孔中加入180ul的混合液，当混合溶液添加完毕后，再向每个孔中添加20µl的FBS，轻微震荡后放入培养箱中培养。孔板将在第1、3、5天取出，每次取出时，吸取相应部分的培养液，弃之，并用无菌PBS清洗一到两遍，再向其中加入200µl的1640培养基以及20µl的cck-8，之后放入培养箱中反应2h，2h后取出，将相应部分的溶液转移到新的孔板中，再将含有剩余细胞的孔板置于恒温细胞培养箱中培养，随后将新孔板置于多功能酶标仪中，在450nm的波长下测试每孔的吸光度（即检测细胞毒性）。2.4.2胚胎干细胞（MECs）培养2.4.2.1小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞的复苏、传代与冻存原代MEF细胞的复苏与L929细胞的复苏步骤基本一致，但其所用的培养基是MEF培养基，且MEF细胞的培养瓶是T75培养瓶，培养瓶中最终含有包括MEF细胞悬液在内的MEF培养液15ml，细胞培养过程中需每天换液。当培养瓶中的细胞密度达到90%时，以适当比例进行传代，即：弃废液，加入约5ml含10µl/ml丝裂霉素C的MEF培养液，将培养瓶在37℃的恒温细胞培养箱中培养2.5h，然后用无菌PBS清洗3-5次，在清洗时浸泡5min左右，接着加入1-2ml0.25%的胰酶，再将其置于37℃的恒温细胞培养箱中孵育3-5min，；孵育完成后，加入1-2mlMEF培养液，反复吹打，终止消化；再将细胞悬液转移到离心管中离心（1200rpm）5min，弃上清，加入适量MEF培养液，用血球计数板计数，计算细胞个数，再用离心机离心（1000rpm）5min，在离心期间配制MEF细胞冻存液（90%MEF培养液+10%DMSO），离心完毕后，向离心管中加入适量的冻存液使细胞密度为4.4×105/ml，每个冻存管中加入1ml的冻存液，随后将冻存管放入程序降温盒中，再将程序降温盒置于-70℃冰箱中过夜，最后将冻存管置于液氮中长期保存。2.4.2.2MEF饲养层细胞的准备MEF铺板前提前2h至一周向T25培养瓶中加入1ml的0.1%明胶溶液孵育30min以上，弃掉溶液吹干培养瓶或置于培养箱过夜，铺板前弃掉明胶溶液；从液氮罐中取出一支冻存的已经经过丝裂霉素C处理过的MEF细胞，用手反复揉搓冻存管10-15s，将冻存管放入37℃水浴锅中至冻存管中有少量冰残留时取出，用75%的酒精清洁冻存管表面，吸取约3ml预热的MEF培养液加至冻存管液满，再将其全部吸至移液管中，重复一次，加入到离心管中，将离心管放入离心机中离心（1200rpm）5min，同时，准备好T25培养瓶；等离心完毕后，弃上清，用适量MEF培养液重悬细胞并反复吹打，将吹打好的细胞悬液加入到事先准备好的T25培养瓶中，补加MEF培养液至5ml，摇晃瓶身使细胞均匀铺满整个培养瓶，将其置于恒温细胞培养箱中过夜后便可接种MECs细胞。2.4.2.3MES细胞的复苏用镊子从液氮罐中取出一支MES细胞冻存管，液氮完全挥发后用手反复揉搓冻存管10-15s，再用封口胶将其封住放入37℃水浴锅中震荡，当冻存管中有少量冰残留时将其取出，用75%酒精擦拭表面后迅速转移至工作台内；吸取3ml已经预热的MEF培养液逐滴加入到冻存管直至液满，再将其全部吸至移液管中，重复一次，加入到离心管中，将离心管放入离心机中离心（1200rpm）5min，同时，从培养箱中取出事先准备好的铺有MEF细胞的T25培养瓶，将废液吸出，弃之；等离心完毕后，弃上清，用适量MES培养液重悬细胞并反复吹打，将吹打好的细胞悬液加入到事先准备好的T25培养瓶中，补加MES培养液至5ml，摇晃瓶身使细胞均匀铺满整个培养瓶，然后将其放入温度为37℃，CO2含量为5%以及湿度为95%下培养箱中进行培养，每天换液。2.4.2.4小鼠胚胎干细胞的分化培养分化培养前一天需在48孔板上铺明胶，铺好后将孔板放入培养箱中，第二天按照每孔20000个干细胞的数量种下，分两个测试组：Day7和Day14，即一个在day7天进行测试，一个在day14天进行测试；每个测试组有4个实验组，每组4个平行样；第三天加样，保证每个实验组所加的金纳米粒子或者金纳米/聚合物的复合物的最终浓度为2nmol/L，且每个孔最终定容为0.5ml。所加的样品依次为AuNPs、AuNPs-pSS、AuNPs-pMAG和AuNPs-pSS/pMAG，并将加样的当天定为Day1；每隔一天（everyotherday）给饲养的细胞换液——RA培养基；在第七天时处理细胞，即：进行免疫荧光染色。第二个区域的细胞依旧保持每天换液，直至第十四天进行免疫荧光染色。2.4.2.5免疫荧光染色在进行免疫荧光染色前先用1%牛血清白蛋白（BSA）稀释200倍配制好一抗，再用1%BSA稀释64倍制备二抗；接着将测试组中的培养液吸出，用有菌PBS洗两遍，废液；然后，沿壁加入100µl的多聚甲醛溶液（起固定作用），固定5min；再用有菌PBS洗涤两遍，弃之，加入100µl的0.1%Triton，破膜5min；再用有菌PBS洗涤两遍，弃之，加入100µl的3%BSA，封闭30min；吸出BSA，加入80µl的一抗，用锡箔纸包好，避光放置在4℃冰箱过夜；第二天，吸出一抗，用有菌PBS洗涤三遍，每次5min；再加入80µl二抗，锡箔纸包好，避光，室温下放置一个小时；吸出二抗，用有菌PBS洗涤三遍，弃废液，每次5min；接着加入80µl的1mg/ml的DAPI染料，染色10~15min；吸出DAPI，用有菌PBS洗涤三遍，每次5min，弃废液；最后进行荧光拍照并保存实验数据。第一天给培养板铺明胶；第二天种细胞（6孔板），按照每孔250000个干细胞的数量种下，一共分化培养14天，其中包括4个实验组和一个对照组control；第三天加样，保证每个实验组所加的金纳米粒子或者金纳米/聚合物的复合物的最终浓度为2nmol/L，每个孔最终定容为2ml。所加的样品依次为GNP、GNP-pSS、GNP-pMAG和GNP-pSS/pMAG，并将加样的当天定为Day1；每隔一天（everyotherday）给饲养的细胞换液——RA培养基；到Day14可以处理细胞进行测试；2.4.2.6聚合链式反应（PCR）同2.4.2.4中的方法培养胚胎干细胞，但细胞培养在铺有明胶的6孔板中，且细胞密度为250000/孔，设置四个实验组和一个对照组，每天换液至第十四天进行细胞处理。首先将孔板从培养箱中取出，然后加入裂解液RZ，每10cm2面积加1mlRZ，用取样器抽打直至溶液透明，然后将处理好的样品在室温下放置五分钟，使核酸蛋白复合物完全分离，接着在4℃，12000rpm下离心五分钟，将200µl的氯仿置于一个全新的无RNase的离心管中，再加入离心好的上清液，盖好管盖，剧烈震荡15sec，室温放置适当时间，然后在4℃，12000rpm下离心十分钟，溶液将会变为三层，无色的水相、黄色的有机相以及中间层，将含RNA的水相转移到新的1.5mlPE管中，然后向管中计加入0.5倍水相体积的无水乙醇（缓慢加入），通过来回吹打使其混匀，将得到的悬液转移到吸附柱CR3中，再在4℃，12000rpm下离心30sec，离心后，向吸附柱中加入500µl蛋白液RD，在4℃，12000rpm下离心30sec，液体弃之并将吸附柱放入收集管中，再向吸附柱中加入600µl漂洗液RW，室温静置2min,在4℃，12000rpm下离心30sec，弃废液，然后再向吸附柱中加入600µl漂洗液RW，室温静置2min,在4℃，12000rpm下离心30sec，弃废液；接着将吸附柱放入2ml收集管中，在4℃，12000rpm下离心2min，去除残余液体，最后将45µlRNase-FreeddH2O以及吸附柱CR3均转入一个新的1.5ml离心管中，室温放置2min，在4℃，12000rpm下离心2min。将上述处理好的溶液送样检测。

第三章结果与讨论3.1单体以及聚合物的核磁图3.1.1MAG的表征单体MAG的1H-NMR结果如图3-1所示，糖环上的其中五个氢H2-H6出现在3.3-4.0ppm之间，另一氢原子H1则出现在5.25ppm左右，而双键两侧的氢原子H7、H8与H9分别出现在2.0ppm、5.5ppm与5.7ppm左右，经上述核磁数据表明合成的单体是纯净的的MAG。图3-1单体MAG的1H-NMR表征图

3.1.2PMAG的表征聚合物PMAG的1H-NMR结果如图3-2所示，聚合物糖环上的H2-H6出现在约3.3-4.1ppm之间，H1则出现在5.2ppm左右的位置，聚合物主链上的H7与H8则分别出现在1.7ppm和1.0ppm左右的位置。经上述核磁数据表明合成的单体是纯净的的PMAG。图3-2聚合物PMAG的1H-NMR表征图3.1.3PSS的表征聚合物PSS的1H-NMR结果如图3-2所示，聚合物主链的H3-H4出现在约1.1-2.3ppm之间，聚合物侧链H1和H2则分别出现在6.5ppm和7.5ppm左右的位置，经上述核磁数据表明合成的单体是纯净的的PSS。图3-3聚合物PSS的1H-NMR表征图3.2PMAG与PSS的GPC测试将合成的PMAG与PSS送到检测中心检测得出其分子量与PDI，如表3-4所示：聚合物Mn（GPC）PDIPSS76291．174PMAG67001．170表3-4PMAG与PSS的GPC测试结果3.3PMAG-SH与PSS-SH的紫外可见光测试PMAG-SH与PSS-SH的UV-visible的结果由图3-5所示，图3-5可以看出PMAG与PSS均在在310nm左右处有一明显的吸收峰，而PMAG-SH与PSS-SH在310nm处无吸收峰，这就可以证明PMAG与PSS的胺解成功接上了巯基。3-5聚合物PMAG-SH与PSS-SH的紫外可见吸收光谱3.4金纳米粒子及其聚合物的性能表征3.4.1金纳米粒子的透射电镜（TEM）测试通过TEM测试我们可以由图3-6看出所制备的金纳米粒子的粒径均匀且分散，基本没有出现团聚现象。通过粒径统计分析得出所制备的AuNPs粒径约为16nm。图3-6金纳米粒子的TEM测试3.4.2金纳米粒子及其聚合物的动态光散射（DLS）测试我们通过DLS对聚合物改性前后AuNPs的粒径和电势进行了测试，结果如图3-7和3-8所示。经PSS改性的AuNPs（AuNPs-PSS）粒径增大，且所带负电荷也有所增加。这是由于PSS含有磺酸基团，使得AuNPs-PSS带有更多的负电荷，而AuNPs外PSS的包裹使其粒径变大。而PMAG不含带电基团，其在AuNPs表面的包裹在一定程度上屏蔽了AuNPs自身的部分负电荷，使得AuNPs的电负性有所降低，电负性的降低导致AuNPs的水合层有所收缩，水合粒径变小。鉴于PSS和PMAG两者分别对AuNPs粒径和电势的影响，PSS和PMAG对AuNPs混合改性（AuNPs-PSS/PMAG）对粒径和电势的影响介于两者之间图3-7金纳米粒子及其聚合物的粒径测试结果图3-8金纳米粒子及其聚合物的电势测试结果3.4.3金纳米粒子及其聚合物的可见光测试金纳米粒子与聚合物相结合会使金纳米粒子本身的可见光谱发生变化，因此我们对金纳米粒子及其聚合物进行可见光的测试来表征金纳米粒子与聚合物的结合情况，即：与聚合物结合的金纳米粒子光谱带会出现明显的变宽与红移。

图3-9金纳米粒子及其聚合物的可见光测试结果3.5类糖胺聚糖改性AuNPs的细胞毒性测试为了验证合成的金纳米粒子及其聚合物对细胞生物活性的影响，我们选取L929细胞作为模型细胞，分别将AuNPs、AuNPs-PSS、AuNPs-PMAG和AuNPs-PSS/PMAG（浓度为0.5nmol/L）加入到L929细胞的培养基中，并依次在培养第一、三、五天时观察加入不同化合物的细胞生长情况并测试，同时对照组为不加化合物的细胞的生长情况。如图3-11所示，从一天到五天，样品组和对照组细胞活性均明显增加，表明细胞处于良好的增殖状态。无论是培养一天，还是三天和五天，样品组与对照组的细胞活性均无明显差异，金纳米粒子及其以及类糖胺聚糖改性的AuNPs均对L929细胞的增殖没有抑制作用，具有良好的生物相容性。图3-10金纳米粒子及其聚合物的细胞毒性测试结果3.6金纳米粒子及其聚合物对胚胎干细胞神经分化的检测3.6.1胚胎干细胞的免疫荧光染色我们分别对培养了7天和14天的胚胎干细胞进行β3-tubulin免疫荧光染色，以探究（a）AuNPs、（b）AuNPs-PSS-SH、（c）AuNPs-PMAG-SH以及（d）AuNPs-PSS-PMAG-SH对胚胎干细胞神经分化的影响，由第7天图中结果可知（b）、（c）与（d）中的分化结果要比（a）中的强，尤其是（b）与（c），而第14天的结果显示，四种胚胎干细胞的分化程度均变强，尤其以（c）为主，且（c）中细胞的增殖幅度也比较大，因此由以上两图可知，金纳米粒子修饰的类糖胺聚糖对胚胎干细胞的神经分化有促进作用。图3-11胚胎干细胞的免疫荧光染色结果3.6.2胚胎干细胞PCR测试为了更加精准的测定哪一种聚合物能够促进胚胎干细胞的神经分化，我们通过PCR技术来测定细胞中β微管蛋白（β3-tubulin）和巢蛋白（Nestin）的表达量，并以没有添加聚合物的胚胎干细胞作为参照得出图3-12的结果，在图中我们可以看出两种蛋白表达最多的都是AuNPs-PSS/PMAG，虽然由于实验问题，其并没有明显展示出其促进胚胎干细胞神经分化的结果，但它是四种聚合物中促进效果最为显著的一个。图3-12胚胎干细胞的PCR测试结果

结论及展望糖胺聚糖是一种可以促进胚胎干细胞进行神经分化的粘多糖，而金纳米粒子是目前最早出现、研究最为深入的纳米材料之一，它不仅可以作为载体同时也具有良好的生物相容性，所以本论文将制备的类糖胺聚糖PSS和PMAG组装到AuNPs表面研究这种类糖胺聚糖改性的AuNPs对胚胎干细胞神经分化的影响。研究结果表明，与未改性的AuNPs相比，PMAG和与PSS共同改性的AuNPs金纳米粒子确实对胚胎干细胞的分化具有一定的促进作用。由于时间有限，我们还没有对胚胎干细胞分化实验的条件进行系统和详细的筛选和摸索，接下来我们将从聚合物分子量、两种聚合物在AuNPs表面的组装比例、分化实验中纳米粒子加入的浓度等方面进行优化，以期筛选出最佳的条件用于诱导胚胎干细胞的神经分化。

参考文献[1]Mummery,C.L.;Zhang,J.;Ng,E.S.;Elliott,D.A.;Elefanty,A.G.;Kamp,T.J.DifferentiationofHumanEmbryonicStemCellsandInducedPluripotentStemCellstoCardiomyocytesAMethodsOverview.Circ.Res[J].2012,111,344−358.[2]Metallo,C.M.;Azarin,S.M.;Ji,L.;DePablo,J.J.;Palecek,S.P.EngineeringTissuefromHumanEmbryonicStemCells.J.CellMol.Med[J].2008,12,709−729.[3]Lee,J.H.;Lee,D.S.;Choung,H.W.;Shon,W.J.;Seo,B.M.;Lee,E.H.;Cho,J.Y.;Park,J.C.OdontogenicDifferentiationofHumanDentalPulpStemCellsInducedbyPreameloblast-DerivedFactors.Biomaterials[J].2011,32,9696−9706.[4]Ni,W.F.;Wu,A.M.;Li,Q.L.;Huang,Z.Y.;Xu,H.Z.;Yin,L.H.InducedHumanBoneMarrowStromalCellsDifferentiateintoNeuralCellsbybFGFandCoculturedwithOlfactoryEnsheathingCells.Curr.StemCellRes.Ther[J].2014,9,291−296.[5]Ostenfeld,T.;Svendsen,C.N.RequirementforNeurogenesistoProceedthroughtheDivisionofNeuronalProgenitorsFollowingDifferentiationofEpidermalGrowthFactorandFibroblastGrowthFactor-2-ResponsiveHumanNeuralstemcells.StemCells[J].2004,22,798−811.[6]Schuldiner,M.;Eiges,R.;Eden,A.;Yanuka,O.;Itskovitz-Eldor,J.;Goldstein,R.S.;Benvenisty,N.InducedNeuronalDifferentiationofHumanEmbryonicStemCells.BrainRes[J].2001,913,201−205.[7]M.Forsberg,K.Holmborn,S.Kundu,A.Daga¨lv,L.Kjelle´nandK.Forsberg-Nilsson,J.Biol[J].Chem[J].2012,287,10853-10862.[8]T.H.Nguyen,S.-H.Kim,C.G.Decker,D.Y.Wong,J.A.LooandH.D.Maynard,Nat.Chem[J].2013,5,221–227.[9]N.Sangaj,P.Kyriakakis,D.Yang,C.-W.Chang,G.AryaandS.Varghese,Biomacromolecules[J].2010,11,3294–3300.[10]K.L.Christman,V.Va´zquez-Dorbatt,E.Schopf,C.M.Kolodziej,R.C.Li,R.M.Broyer,Y.ChenandH.D.Maynard,J.Am.Chem.Soc[J].2008,130,16585–16591.[11]AnewavenuetothesynthesisofGAG-mimickingpolymershighlypromotingneuraldifferentiationofembryonicstemcells.Chem.Commun[J].2015,51(84),15434-15437.[12]DecipheringtheRoleofSulfonatedUnitinHeparin-MimickingPolymertoPromoteNeuralDifferentiationofEmbryonicStemCells.ACSAppl.Mater.Interfaces[J].2017,9(34),28209-28221.[13]Goldnanoparticlesinbiomedicalapplications:recentadvancesandperspectives.Chem.Soc.Rev[J].2012,41,6,2256-2282.[14]Goldnanoparticlesforbiologyandmedicine.Angew.Chem.Int.Ed[J].2010,49,19,3280-3294.[15]Goldnanoparticles:preparation,properties,andapplicationsinbionanotechnology.Nanoscale[J].2012,4,6,1871-1880.[16]Disposablenucleicacidbiosensorsbasedongoldnanoparticleprobesandlateralflowstrip.Anal.Chem[J].2009,