核酸检测技术

关于核酸检测技术核酸检测技术直接对动植物有害生物基因序列和结构进行测定。核酸的分离纯化PCR技术核酸杂交技术第2页,共140页，2024年2月25日，星期天第1节核酸的分离纯化第3页,共140页，2024年2月25日，星期天核酸的分离纯化的原则保持核酸一级结构的完整性提高核酸制品的纯度第4页,共140页，2024年2月25日，星期天技术路线的设计第5页,共140页，2024年2月25日，星期天破碎细胞的方法机械（匀浆、超声破、研磨等）非机械（化学处理、生化法）第6页,共140页，2024年2月25日，星期天沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。优点缺点乙醇对盐类沉淀少，易挥发除去，不影响后续实验需要量大，低温操作异丙醇需体积小，速度快，一般不需低温长时间放置易使盐类、糖类与DNA共沉淀；异丙醇难以挥发除去第7页,共140页，2024年2月25日，星期天核酸浓度检测与完整性测定方法浓度测定

紫外分光光度法260nm

荧光光度法

EB荧光完整性测定琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状；完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值第8页,共140页，2024年2月25日，星期天问题一：DNA样品不纯

抑制后续酶解和PCR反应DNA提取常见问题第9页,共140页，2024年2月25日，星期天DNA提取常见问题问题二：DNA降解第10页,共140页，2024年2月25日，星期天DNA提取常见问题问题三：DNA提取量少第11页,共140页，2024年2月25日，星期天真菌昆虫第12页,共140页，2024年2月25日，星期天第2节PCR扩增技术PCR,a‘DNAphotocopier’第13页,共140页，2024年2月25日，星期天PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……第14页,共140页，2024年2月25日，星期天1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明第15页,共140页，2024年2月25日，星期天KaryB.Mullis（1944－）1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第16页,共140页，2024年2月25日，星期天1.PCR的基础第17页,共140页，2024年2月25日，星期天PolymeraseChainReactionPCRTheonlyenzymeusedinthisreactionisDNApolymerase.第18页,共140页，2024年2月25日，星期天PolymeraseChainReactionTheproductsofthefirstreactionbecomesubstratesofthefollowingone,andsoon.PCR第19页,共140页，2024年2月25日，星期天PolymeraseChainReactionPCRComponents：ThermostableDNAPolymerase，TargetDNA，PairofPrimers，dNTPs，Mg++ions，Buffersolution

第20页,共140页，2024年2月25日，星期天Denaturation：ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing:Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesupdNTPsandrequiredMg2+.ThePCRcycle:ThreedifferentstepsineachPCRcycle第21页,共140页，2024年2月25日，星期天PCR的扩增？第22页,共140页，2024年2月25日，星期天HowdoesPCRworkThefirstcycleThesecondcycle第23页,共140页，2024年2月25日，星期天HowdoesPCRworkThethirdcycleThefourthcycle第24页,共140页，2024年2月25日，星期天2.PCR的类型第25页,共140页，2024年2月25日，星期天多重PCR（multiplexPCR）巢式PCR（nestedPCR）定量PCR（quantitativePCR）不对称PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）逆转录PCR（reversetranscriptionPCR）OverlapPCR……第26页,共140页，2024年2月25日，星期天PCRusingseveralprimerpairsSIMULTANEOUSLYTypicallygeneratesaproductbandforeachprimerpair多重PCR（multiplexPCR）:What2.1多重PCR（multiplexPCR）第27页,共140页，2024年2月25日，星期天MultiplexPCR:WhyDetectseveralgenesatonceeg.transgenicplantscreenInternalcontrolsVERYimportantTellsyouhowwellthePCRreactionworkedReduces“falsenegatives”Reduces“falsepositives”多重PCR（multiplexPCR）第28页,共140页，2024年2月25日，星期天MultiplexPCR:HowSameasregularPCRCareinprimerdesignMuchgreaterchanceofprimer-dimersMuchgreaterchanceofartifactsAnnealingtemperaturesmustbeclose多重PCR（multiplexPCR）第29页,共140页，2024年2月25日，星期天ATypicalMultiplexPCRReactionSterileWater34.0ul10XPCRBuffer5.0ulMgCl2(50mM)2.5uldNTP’s(10mMeach)1.0ulPrimer1FWD1.0ulPrimer1REV1.0ulPrimer2FWD1.0ulPrimer2REV1.0ulPrimer3FWD1.0ulPrimer3REV1.0ulDNAPolymerase0.5ulDNATemplate1.0ulTotalVolume50.0ul多重PCR（multiplexPCR）第30页,共140页，2024年2月25日，星期天MultiplexPCR:ExampleThreeprimerpairsControl,resistance,andtraitgenesControlgenefragmentislargestand(almost)faintestTraitgeneissmallestandbrightestResistanceGeneTraitGeneControlGenePrimers多重PCR（multiplexPCR）第31页,共140页，2024年2月25日，星期天MultiplexPCR:ExampleThreeprimerpairsResistanceGeneTraitGeneWhicharetransgenic?ControlGenePrimers多重PCR（multiplexPCR）第32页,共140页，2024年2月25日，星期天NestedMultiplexPCR2ndStagePCRDilute100foldBetween1st&2ndstagereactions1F1R2R3R5R6R3F2F6F4F5F4RPrimaryMultiplexRT-PCR多重PCR（multiplexPCR）第33页,共140页，2024年2月25日，星期天2.2定量PCR（quantitativePCR）实时荧光定量PCR（RealtimeQuantitativePCR）：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。Real-timePCRmonitorsthefluorescenceemittedduringthereactionasanindicatorofampliconproductionateachPCRcycle(inrealtime)asopposedtotheendpointdetection第34页,共140页，2024年2月25日，星期天荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测第35页,共140页，2024年2月25日，星期天第36页,共140页，2024年2月25日，星期天（1）定量原理三个概念：

扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析第37页,共140页，2024年2月25日，星期天荧光定量PCR原理——扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件第38页,共140页，2024年2月25日，星期天荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：基线期、指数增长期和平台期。Cycle（循环数）Rn（荧光强度）基线期平台期平台期第39页,共140页，2024年2月25日，星期天荧光定量PCR原理——荧光域值Cycle（循环数）Rn（荧光强度）基线期指数扩增期平台期荧光域值手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段第40页,共140页，2024年2月25日，星期天荧光定量PCR原理——Ct值PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)value第41页,共140页，2024年2月25日，星期天纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；

Ct值则极具重现性Ct值的重现性第42页,共140页，2024年2月25日，星期天定量原理理想的PCR反应：

X=X0*2n非理想的PCR反应：

X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数

X：第n次循环后的产物量

X0：初始模板量

Ex：扩增效率第43页,共140页，2024年2月25日，星期天扩增效率E（amplificationefficiency）一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值位于0到1之间。在PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该直线斜率）即可计算出E值。第44页,共140页，2024年2月25日，星期天在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)

CT=-klgX0+b（线性方程）LogX0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。第45页,共140页，2024年2月25日，星期天标准曲线：CT值对[DNA]0作图第46页,共140页，2024年2月25日，星期天

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。

Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration第47页,共140页，2024年2月25日，星期天（2）荧光定量PCR的化学原理1.Hydrolysisprobes（水解探针）(TaqMan,Beacons)2.DNA-binding(intercalating)agents（结合）(SYBRGreen,EvaGreen,LCGreen)3.HybridizationorFRETprobes（杂交）(LightCycler)第48页,共140页，2024年2月25日，星期天非特异性荧光标记：

1、SYBRGreen特异性荧光标记：

2、TaqMan3、MolecularBeacon4、AmplisensorQQRDNA产物的荧光标记第49页,共140页，2024年2月25日，星期天SYBRGreen法SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。信号强度与DNA分子总数目成正比。SYBRGreen第50页,共140页，2024年2月25日，星期天5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation第51页,共140页，2024年2月25日，星期天SYBRGreen法优缺点

对DNA模板没有选择性

适用于任何DNA

使用方便

不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点

容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点第52页,共140页，2024年2月25日，星期天Tm值：DNA解链一半时的温度将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)第53页,共140页，2024年2月25日，星期天第54页,共140页，2024年2月25日，星期天与目标序列互补TaqMan法TaqMan水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)

探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针第55页,共140页，2024年2月25日，星期天每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光第56页,共140页，2024年2月25日，星期天TaqMan法优缺点

对目标序列的高特异性

阴性结果确定设计相对简单

与目标序列某一区域互补重复性比较好优点

只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点第57页,共140页，2024年2月25日，星期天第58页,共140页，2024年2月25日，星期天Title=(Real-timePCR)Timespan=2009-2012.PublishedItemsinEachYear第59页,共140页，2024年2月25日，星期天ExamplesofSYBRGreenreal-timePCRassaysfordetectionofplantpathogenicfungi(last6years)第60页,共140页，2024年2月25日，星期天（3）定量方法

绝对定量（AbsoluteQuantification）确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常所说的拷贝数。相对定量（RelativeQuantification）测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的相对变化。

2-△C（t）双标准曲线法第61页,共140页，2024年2月25日，星期天相对定量中的内标内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA第62页,共140页，2024年2月25日，星期天第63页,共140页，2024年2月25日，星期天

相对定量：参照因子Calibrator

第64页,共140页，2024年2月25日，星期天

相对定量分析方法1-ΔΔCt

第65页,共140页，2024年2月25日，星期天第66页,共140页，2024年2月25日，星期天相对定量分析方法2：双标准曲线法

目标基因与内参基因扩增效率不同第67页,共140页，2024年2月25日，星期天特异性

重复性

灵敏度其他问题常见问题讨论第68页,共140页，2024年2月25日，星期天扩增的特异性引物？Tm，重新设计引物，优化条件Tm第69页,共140页，2024年2月25日，星期天重复性判断实验优劣的重要指标判断指标：主要为标准差（SD）和变异系数（CV）影响重复性的因素：PCR反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。目的基因的初始浓度：使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。标准曲线的影响：不少于5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与样本具有高同源性，质粒DNA或是体外合成、转录的RNA。第70页,共140页，2024年2月25日，星期天影响灵敏度的因素反应体系中形成的引物二聚体的影响可以用水解探针代替SYBRGreenI，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍。可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶要尽可能地优化引物设计如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。循环数

Mg2＋的浓度

第71页,共140页，2024年2月25日，星期天Q1:无Ct值（信号）出现可能性不大检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。第72页,共140页，2024年2月25日，星期天Q2:Ct值出现过晚（Ct＞38）扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。第73页,共140页，2024年2月25日，星期天Q3:标准曲线的线性关系不佳加样存在误差:使得标准品不呈梯度。标准品出现降解:应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针模板中存在抑制物，或模板浓度过高。第74页,共140页，2024年2月25日，星期天Q4:阴性对照也出现明显的起飞反应mix或水被污染。引物二聚体的出现：用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。反应过程中探针的降解：用PAGE电泳对探针进行检测。ROX校正的问题：如果使用了，则可能是ROX的降解所造成。第75页,共140页，2024年2月25日，星期天Q5:熔解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。第76页,共140页，2024年2月25日，星期天Q6:扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。第77页,共140页，2024年2月25日，星期天两步扩增反应Real-timeqPCR:循环数Step温度时间检测说明1195℃2minOff起始模板预变性35-45195℃15secOff模板变性260-68℃20-60secOn退火/延伸三步扩增反应Real-timeqPCR:循环数Step温度时间检测说明1195℃2minOff起始模板预变性35-45195℃10-20secOff模板变性255-65℃10-20secOff退火372℃20-60secOn延伸第78页,共140页，2024年2月25日，星期天3.提高PCR反应特异性的策略第79页,共140页，2024年2月25日，星期天巢式PCR（Nest-PCR）四种策略

递减PCR（TouchDownPCR）

热启动PCR（HotStartPCR）

使用PCR增强剂第80页,共140页，2024年2月25日，星期天策略之一巢式PCR（Nested-PCR）P1P2P3P4

巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。

巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。

第81页,共140页，2024年2月25日，星期天FirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterestNestedPCR:toincreasespecificity第82页,共140页，2024年2月25日，星期天策略之二递减PCR（TouchDownPCR）

递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm5℃。

特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。

递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。第83页,共140页，2024年2月25日，星期天策略之三热启动PCR（HotStartPCR）

热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度；

现在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；

热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。第84页,共140页，2024年2月25日，星期天策略之四使用PCR增强剂

甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。

其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。

增强剂浓度要适当

第85页,共140页，2024年2月25日，星期天4.PCR常见问题及分析第86页,共140页，2024年2月25日，星期天DenaturationTempAnnealingTempExtensionTempTimeNumberofCyclesReactionVolume“Odd”ProtocolsPCRCyclingParametersWaterBufferDNAtemplatePrimersNucleotidesMg++ionsDNAPolymeraseExtrasReactionComponents第87页,共140页，2024年2月25日，星期天IMPORTANT!BasicExperimentalDesignAwell-designedexperimentcankeepyoufromevergettingintotrouble!Apoorly-designedexperimentisaskingforproblems!!!!Mainpoint:AlwaysuseCONTROLSPositivecontrolSoyou’llknowwhatasuccessfulresultlookslike.NegativecontrolLetsyouknowifyouhavecontamination.第88页,共140页，2024年2月25日，星期天ExperimentalDesign:ControlsNopositiveornegativecontrols…Whatdoesthisresultmean??Onlyapositivecontrol…Howdoweknowtheresultisn’tduetocontamination?Bothpositiveandnegativecontrols…Resultscanbeinterpretedwithconfidence.UU+U-+第89页,共140页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题之一无扩增产物（假阴性）模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无；第90页,共140页，2024年2月25日，星期天第91页,共140页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题之二

非特异性扩增

现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。第92页,共140页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题之二引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多

原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数

非特异性扩增第93页,共140页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题之三

拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M12第94页,共140页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题之三模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多

原因对策纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数

拖尾第95页,共140页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题之四假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)

原因：靶序列或扩增产物的交叉污染

现象：空白对照出现目的扩增产物

对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。第96页,共140页，2024年2月25日，星期天PCR常见问题之五引物二聚体第97页,共140页，2024年2月25日，星期天5.分子检测的靶标基因第98页,共140页，2024年2月25日，星期天PurvisandHector,2000,Nature昆虫菌物昆虫和菌物的物种丰富度第99页,共140页，2024年2月25日，星期天ThemitochondrialcytochromeoxidasecsubunitI(COI)geneisoneofthemostpopularmarkersforpopulationgeneticandphylogeographicstudiesacrosstheanimalkingdom.第100页,共140页，2024年2月25日，星期天5`3`LCOF1490*Ag1718F°14012942COItRNACodingRegionsGeneCodingRegionsControlRegionBarcodingRegionForwardPrimerReversePrimerHCOR2198*Ag1859R°mtDNAGenomeTheorderofgenesonthemitochondrialgenome第101页,共140页，2024年2月25日，星期天RelativelywellstudiedatthebiochemicallevelSizeandstructureconservedacrossallaerobicorganismsMixofvariableandconservedregionsLargestofthethreeCOsubunitsBroadspectrumofsubstitutionalrates第102页,共140页，2024年2月25日，星期天菌物常用的靶标基因第103页,共140页，2024年2月25日，星期天第104页,共140页，2024年2月25日，星期天核糖体基因包括5S、5.8S、18S、28S在内的4个rDNA基因，是细胞核内染色体上的多拷贝、中度重复序列。编码18S、5.8S和28S的rDNA作为1个转录单元，以中等重复的串联形式存在于染色体上。第105页,共140页，2024年2月25日，星期天18S(SSU)5.8S28S(LSU)IGSITS1ITS2IGS5’3’IGS，基因间隔区（intergenicregionspacer）；ITS，内转录间隔区（internaltranscribedspacer）ITS5ITS1ITS3ITS2ITS4ITS4-BrDNA（核糖体DNA）基因的结构图第106页,共140页，2024年2月25日，星期天ITS作为DNA条形码的优点（1）ITS两侧序列保守便于设计通用引物，可广泛应用于PCR扩增；（2）ITS的高重复度有利于从微量DNA样品中进行检测（3）ITS可应用于同属近缘种及种内的进化关系研究；第107页,共140页，2024年2月25日，星期天IGS（Intergenicspacer，核糖体基因内间隔区）序列：分开每个重复序列的DNA片段。相对于ITS区，IGS是一个高变区,它们常用于属内种间比较或种内群体比较。第108页,共140页，2024年2月25日，星期天第109页,共140页，2024年2月25日，星期天betatubulinActinRNApolymeraseIIlargesubunit,RPB1Translationelongationfactor1-αYpt1…….菌物常用的靶标基因第110页,共140页，2024年2月25日，星期天ListofprimersreportedfortheidentificationanddetectionofPhytophthoraspeciesknowntothreatenforestsandothernaturalecosystems.第111页,共140页，2024年2月25日，星期天第112页,共140页，2024年2月25日，星期天线粒体DNA是真核生物细胞核外一种呈环状的小分子双链DNA，单拷贝，不含基因间隔区和内含子，进化历史简单明了，酶切位点少，易于分析。由于mtDNA的分子进化速度比细胞核DNA快，所以mtDNA分子的分析物种种内和种间的分类灵敏度高，应用PCR等分子生物学技术可将分类单位精确到种以下，可以用来对种、变种、个体菌株及杂交种进行检测。线粒体DNA（mitochondrialDNA，mtDNA第113页,共140页，2024年2月25日，星期天第114页,共140页，2024年2月25日，星期天第115页,共140页，2024年2月25日，星期天第116页,共140页，2024年2月25日，星期天第117页,共140页，2024年2月25日，星期天第118页,共140页，2024年2月25日，星期天第119页,共140页，2024年2月25日，星期天第120页,共140页，2024年2月25日，星期天第121页,共140页，2024年2月25日，星期天思考题：1.核酸沉淀常用的有机溶剂，他们的优缺点是什么。2.核酸提取不纯的原因是什么，如何改进。3.基因组提取过程中降解的原因及改进。4.1个PCR循环是有哪几步组成，分别是什么。5.不同PCR的类型，6.多重PCR如何进行，有什么优缺点7.定量PCR、扩增曲线、荧光阈值、Ct值、标准曲线、融解曲线、绝对定量、相对定量、-ΔΔCt、双标准曲线法

8.SYBRGreen法和TaqMan法9.Q2:Ct值出现过晚（Ct＞38）、阴性对照也出现明显的起飞、熔解曲线不止一个主峰的原因。10.TouchDownPCR是什么。11假阴性、非特异性扩增、拖尾、假阳性和引物二聚体出现的原因是什么，如何改进。12.COI、ITS、IGS指的是，有什么价值第122页,共140页，2024年2月25日，星期天第4节核酸杂交技术第123页,共140页，2024年2月25日，星期天核酸杂交技术核酸杂交（hybridization）是两条互补的核苷酸单链在特定的条件下退火形成异质双链的过程。核酸杂交技术是建立在以碱基互补为基础的、以双链核酸分子在特定条件下的变性和复性为手段的，对核酸分子进行定性和定量检测的技术。第124页,共140页，2024年2月25日，星期天核酸杂交既可以是DNA与DNA链、RNA与RNA链之间的杂交，又可以是DNA与RNA链之间的杂交。核酸杂交可进行染色体图谱分析，测定特异DNA序列的拷贝数（甚至可检测到哺乳动物基因组中的单拷贝基因），鉴定与疾病有关的限制性片段长度多态性标记，进行基因克隆的筛选，检测不同浓度的DNA，鉴别特异基因的表达部位，第125页,共140页，2024年2月25日，星期天核酸探针含有标记物的与待检测核酸片段具有高度同源性的特定核酸片段，可以对待检测核酸进行定性、定量和定位的工具。根据核酸探针分子性质的不同可分为DNA探针和RNA探针；根据核酸探针来源的不同又分为基因组DNA探针、人工合成的寡核苷酸探针和cDNA探针。第126页,共140页，2024年2月25日，星期天探针的标记放射性标记物32P、3H、35S、14C、125I、或131I非放射性标记物

地高辛(Digoxigenin,Dig)；荧光素(fluorecein)标记，如罗丹明或FITC；生物素

；第127页,共140页，2024年2月25日，星期天SouthernblotNorthernblot斑点杂交

斑点杂交是分子杂交