糖的提取分离结构测定

关于糖的提取分离结构测定一、提取

单糖、低聚糖及苷类化合物常用水或醇提取，然后用不同的有机溶剂萃取得到不同极性的化合物。多糖常用热水、稀碱或稀酸溶液进行提取。植物体内苷常与水解酶共存，所以要杀酶或抑制酶的活性。第2页,共38页，2024年2月25日，星期天提取流程第3页,共38页，2024年2月25日，星期天二、分离1.季铵盐沉淀法与酸性多糖形成不溶性沉淀，使其分离。常用季氨盐有十六烷基三甲胺溴化物及其氢氧化物和十六烷基吡啶。提高溶液PH值或加入硼砂缓冲液，也可沉淀分离中性多糖。第4页,共38页，2024年2月25日，星期天2.分级沉淀或分级溶解法按比例由小到大的顺序向多糖溶液中加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，反复溶解与沉淀。为了多糖的稳定，一般在PH7时进行，酸性多糖在PH2-4时进行。第5页,共38页，2024年2月25日，星期天分级沉淀法得到的多糖，常含有较多的蛋白质，需将其去除方法：选择使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的试剂（如酚、三氯醋酸、鞣质等）处理

sevag法：（用氯仿:丁醇5:1混合）酶解法：（蛋白水解酶，常与sevag法合用）三氟三氯乙烷法三氯醋酸法蛋白质的去除第6页,共38页，2024年2月25日，星期天3.离子交换色谱常用交换剂为阳离子或阴离子交换纤维素。阳离子交换纤维素适用于分离酸性、中性多糖和粘多糖。中性多糖与硼酸络合后可增加酸性，可被阳离子交换纤维素吸附酸性基团多的吸附力强，对于线性分子，分子量大的比小的吸附力强，直链分子比支链分子易吸附。第7页,共38页，2024年2月25日，星期天4.凝胶柱色谱

分子筛原理，按照分子量的大小不同进行分离。

常用葡聚糖凝胶（sephadexG）5.纤维素柱色谱（吸附＋分配）6.制备性区域电泳（分子大小、形状、电荷不同，在电场作用下的迁移速率不同）第8页,共38页，2024年2月25日，星期天第六节糖的核磁共振性质

第9页,共38页，2024年2月25日，星期天一、糖的1H-NMR性质

1.1H-NMR化学位移糖的端基质子信号在δ4.3~6.0甲基五碳糖的甲基信号在δ1.0左右糖上其余质子信号在δ3.2~4.2之间。第10页,共38页，2024年2月25日，星期天2.化学位移的应用根据糖的端基质子信号的个数和化学位移值可推测连有糖的个数、糖的种类。根据甲基质子信号的个数和化学位移值可推测甲基五碳糖的个数、糖的种类。第11页,共38页，2024年2月25日，星期天3.偶合常数质子的邻位偶合常数与二面角有关两面角90度J=0Hz；

两面角0或180度J=6~8Hz；两面角60度J=2~4Hz第12页,共38页，2024年2月25日，星期天当2-H为直立键时β-D-和α-L-型糖的1-H和2-H键为双直立键，φ=180，J=6~8Hz第13页,共38页，2024年2月25日，星期天α-D-和β-L-型糖

1-H为e键，2-H为a键，φ=60，J=2~4Hz第14页,共38页，2024年2月25日，星期天如D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿洛糖的2-H均为直立键当其成α苷时，端基质子与2-H的J约为4Hz；当其成β苷时，端基质子与2-H的J约为8Hz。第15页,共38页，2024年2月25日，星期天2-H为e键，1-H无论处于e键还是a键，与2-H的两面夹角均约60度，不能用J判断苷键构型。如D-甘露糖第16页,共38页，2024年2月25日，星期天L-鼠李糖优势构象为1C式，2-H为平伏键，1-H与2-H的两面夹角约60度，所以苷键的构型不能J来判断。第17页,共38页，2024年2月25日，星期天二、糖的13C-NMR性质

1.化学位移

CH3

~18ppm甲基五碳糖的C6

CH2OH~62ppmC5或C6

CHOH68~85ppm糖氧环上的C2~C4

-O-CH-O-95~105ppm端基C1或C2

环上的碳，带有a-OH的较带有e-OH的出现在较高场处（尤其是端基碳，但不适于甘露糖、鼠李糖的端基碳）；第18页,共38页，2024年2月25日，星期天D-葡萄糖苷C1——α型97~101ppmβ型103~106ppm在13C-NMR谱中：

第19页,共38页，2024年2月25日，星期天2.偶合常数

（吡喃糖中端基碳的碳氢偶合常数)

吡喃糖中端基质子处于横键（a-D或ß-L型苷键）时，其端基碳氢的偶合常数为170~175Hz；处于竖键（ß-D或a-L型苷键）时则为160~165Hz。鼠李糖相反（1C式）第20页,共38页，2024年2月25日，星期天3.苷化位移

糖与苷元成苷后，苷元的α-C、β-C和糖的端基碳的化学位移值均发生了改变，称为苷化位移。第21页,共38页，2024年2月25日，星期天

如：

C1

位移

β-D-葡萄糖

96.7

甲基-β-D-葡萄糖苷104.0+8.3

β-D-半乳糖

97.3

甲基-β-D-半乳糖104.5+8.3

α-L-鼠李吡喃糖

95.1

甲基-α-L-鼠李糖苷102.6+7.5第22页,共38页，2024年2月25日，星期天醇型苷：端基碳的苷化位移与苷元醇羟基种类有关

α-Glc

β-Glc端基碳δC-1ΔδδC-1Δδ伯醇100.0+7.1104.4+6.7仲醇98.5+4.4102.3+3.5叔醇94.6+0.598.9+0.1

伯醇>仲醇>叔醇第23页,共38页，2024年2月25日，星期天①伯醇苷（成苷后）苷元α-C向低场位移约8个化学位移单位β-C向高场位移约4个化学位移单位第24页,共38页，2024年2月25日，星期天②环醇苷

前手性碳：对称碳原子增加一个取代基后，变为非对称碳，这样的碳原子称之为前手性碳a.两个β-C均为仲碳的苷成苷后α-C向低场位移7个单位，端基碳向高场位移约1~4个单位（与甲苷比），β-C的前手性构型与端基碳构型相同时，向高场位移约2个单位；不同时，向高场位移约4个单位。

同小异大：指β碳第25页,共38页，2024年2月25日，星期天b.一个β-C为仲碳，另一个为叔碳或季碳的苷

α-C与糖的端基碳构型相同时，α-C向低场位移约5个单位；不同时α-C向低场位移约10个单位。β-C和端基碳的变化较复杂。同五异十其余七指：

α-C第26页,共38页，2024年2月25日，星期天③叔醇苷

成苷后α-C向低场位移约7个单位；β-C向高场位移约5个单位。④酯苷和酚苷苷元α-C向高场位移，区别于上述苷。

第27页,共38页，2024年2月25日，星期天第七节糖链的结构测定第28页,共38页，2024年2月25日，星期天一、纯度测定（多糖）

多糖纯品实质上是指一定分子量范围的均一组分。

测定方法：

超离心法、高压电泳法、凝胶柱色谱法、旋光测定法、官能团摩尔比恒定法等。第29页,共38页，2024年2月25日，星期天二、分子量测定

单糖、低聚糖及其苷的分子量测定主要采用质谱法。多采用化学电离质谱(CI-MS)、场解吸质谱(FD-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)等方法，ESI-MS及FAB-MS是目前测定苷类分子量常用的方法。应用甲基化法和过碘酸氧化法进行的末端分析法也常用来推算多糖的分子量第30页,共38页，2024年2月25日，星期天三、单糖的鉴定

一般是将苷键全水解，用PC检出单糖的种类，糖类的PC常用的展开剂大多为含水的溶剂系统，如正丁醇-醋酸-水(4:1:5)，EtOAc-吡啶-水(2:1:2)等，经显色后用薄层扫描法求得各种糖的分子比。用GC或HPLC对单糖定性定量，GC常以甘露醇或肌醇为内标，用已知单糖作为对照品。NMR谱，也可以有效地鉴定苷分子中糖的种类。第31页,共38页，2024年2月25日，星期天四、糖的连接位置的测定

1.甲基化法：

将被测物全甲基化，水解苷键，用GC定性定量分析，具有游离羟基的部位是糖的连接位点。2.1H-NMR法：

根据乙酰化后的质子化学位移判断糖的连接位点。3.13C-NMR法：

通过苷化位移，推断糖的连接位点。第32页,共38页，2024年2月25日，星期天五、糖链连接顺序的确定

1.部分水解法：将糖链水解成较小片段（低聚糖），然后分析片段推断糖链的结构。2.质谱法根据质谱中的裂解规律和裂解碎片推测糖链的连接顺序。3.NMR和2D-NMR法。第33页,共38页，2024年2月25日，星期天2.质谱法FDMS、FABMS等。优点：不必制备衍生物,用量小,准确,简便。第34页,共38页，2024年2月25日，星期天是将糖及其苷类衍生物全乙酰化后，测定观察两糖之间质子的远程偶合或NOE效应，确定糖的连接顺序。3.NMR和2D-NMR法。通过HMBC可确定糖的连接位点。第35页,共38页，2024年2月25日，星期天六、苷键构型及氧环的确定

1.苷键构型确定方法包括：

1H-NMR法、酶解法、分子旋光差法等。

1H-NMR法

1利用端基质子的偶合常数

2利用α-苷键和β