生物信息学与基因芯片

关于生物信息学与基因芯片117.04.20242第一节：概述什么是生物芯片（biochip）？生物芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固定于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。由于常用玻片/硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称为生物芯片技术。第2页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.20243根据芯片上固定的探针不同，生物芯片包括：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片，根据原理还有元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。第3页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.20244一、基因芯片简介（一）基因芯片的基本原理及生物信息学的作用基因芯片（genechip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。基因芯片把大量已知序列探针集成在同一个基片上，经过标记的若干靶核酸序列通过与芯片特定位置上的探针杂交，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。通过处理和分析基因芯片杂交检测图像，可以对生物细胞或组织中大量的基因信息进行分析。第4页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.20245基因芯片的类型（一）

基因芯片按其材质和功能，可以分为一下几类：元件型微阵列芯片生物电子芯片凝胶元件微阵列芯片药物控制芯片通道型微阵列芯片毛细管电泳芯片PCR扩增芯片集成DNA分析芯片毛细管电层析芯片生物传感芯片光学纤维阵列芯片白光干涉谱传感器芯片第5页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.20246基因芯片的类型（三）按基因芯片的支持物，可以分为：薄膜型：如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。其点阵通过“点膜”形式制作，并通过一定的方法使探针能够牢固地结合在上面。玻片型：其点阵通过原位合成技术制作，点阵密度很高，必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。微板型：一种具有高密度、小容量测试孔的小型酶联免疫检测板集成电路型

：将杂交技术与微电子技术结合于一体有目的地通过电子装置检测或控制DNA等生物大分子的作用过程。第6页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.20247基因芯片的类型（二）按基因芯片点阵的制备方法，可以分为：原位合成适用于寡核苷酸。根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子。两种途径：光刻法：可合成30nt左右，每步缩合率较低为95％左右，产率仅20％，

需要特殊的合成试剂。

压电打印法：可合成50nt左右，每步缩合率为99％以上，产率可达74％

不需要特殊的合成试剂。

直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。将合成好的探针、cDNA、基因组通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。优点：方法较原位合成简单，定量准确，重现性好，使用寿命命长。缺点：喷印的斑点大，探针密度低。第7页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.20248根据探针的类型和长度，基因芯片可分为两类。其中一类是较长的DNA探针（

100mer）芯片这类芯片的探针往往是PCR的产物，通过点样方法将探针固定在芯片上，主要用于基因的表达分析。另一类是短的寡核苷酸探针芯片其探针长度为25mer左右，一般通过在片（原位）合成方法得到，这类芯片既可用于RNA的表达监控，也可以用于核酸序列分析。根据探针的内容：寡核苷酸芯片、cDNA芯片和Genomic芯片根据探针模式：一是将靶DNA固定于支持物上，适合于大量不同靶DNA的分析；二是将大量探针分子固定于支持物上，适合于对同一靶DNA进行不同的探针序列的分析从应用方面：研究基因型和监控RNA表达。第8页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.20249基因芯片的相关技术包括：基因芯片的设计，基因芯片的制备、靶基因的制备、杂交和检测、检测结果分析等。第9页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202410（二）基因芯片制备基因芯片的制备主要有两种基本方法：基因芯片的制备中支持物有多种，如玻片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。第10页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202411一是在片合成法，在片合成法是基于组合化学的合成原理，它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。在片合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。关键步骤：首先使支持物羟基化，使其表面衍生出羟基，并与保护基建立共价连接。第11页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202412在片合成法主要优点：可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列，合成的阵列密度高，适合于制作大规模DNA探针阵列芯片，实行高密度芯片的标准化和规模化生产。缺点：探针长度受限制，去保护不彻底，容易导致信号模糊。主要应用公司：美国Affymetrix等。Affymetrix公司制备的基因芯片产品在1.28×1.28cm表面上可包含30万个20-25mer寡核苷酸探针，每个探针单元的大小为10微米×10微米。第12页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202413点样法的优越性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸的方法和仪器或cDNA探针库，探针的长度可以任意选择，且固定方法也比较成熟，灵活性大适合于研究单位根据需要自行制备科研型基因芯片，制作点阵规模较小的商品基因芯片。第13页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202414（三）靶基因样品的制备及芯片杂交根据基因芯片的检测目的不同，可以把样品制备方法分为：用于表达谱测量的mRNA样品制备用于多态性(或突变)研究的基因样品的制备靶基因的制备需要运用常规手段从细胞和组织中提取模板分子，在模板扩增过程中对靶基因进行标记。要根据基因芯片探针阵列设计的方式和研究对象选择基因扩增和标记方法。第14页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202415另一种方法是点样法。基因芯片点样法首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头，分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点，并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。支持物的前处理：为使其带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸。现已有成型的点样装置出售。第15页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202416常规的分子杂交过程是，将待检测样品固定于滤膜上，与同位素标记的探针在一定杂交液及温度下进行杂交，一般需较长时间才能完成分子杂交过程，且一般每次只能检测为数不多的一个到几个探针。基因芯片将已知序列的DNA探针，固化于玻璃等基片的表面，而将待检测样品进行标记并与微集成阵列进行杂交。这种方式不仅使检测过程平行化，也可以同时检测成百上千个基因序列，而且由于集成的显微化，使得杂交所需的探针及检测样品均大为减少，杂交时间明显缩短，一般的分子杂交过程可在30分钟内完成。第16页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202417二、基因芯片对于生物分子信息检测的作用和意义在生命科学领域中，基因芯片为分子生物学、生物医学等研究提供了强有力的手段。利用基因芯片技术，可研究生命体系中不同部位、不同生长发育阶段的基因表达，比较不同个体或物种之间的基因表达，比较正常和疾病状态下基因及其表达的差异。基因芯片技术也有助于研究不同层次的多基因协同作用的生命过程，发现新的基因功能，研究生物体在进化、发育、遗传过程中的规律。第17页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202418基因芯片应用可分为两大类：一是用于研究基因型，是利用基因芯片进行序列分析，其中包括识别DNA序列的突变和研究DNA的多态性；一是用于监控RNA表达，利用基因芯片研究基因的功能。随着分子生物学的发展，我们将进一步的了解和认识疾病，基因芯片作为一种大规模并行序列分析技术，将有利于深入了解基因。除此以外，基因芯片最令人振奋的应用是药物基因组学，可以促进新药的发现过程。第18页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202419四、基因芯片的应用（一）疾病的诊断与治疗1、遗传病相关基因的定位HGP使得许多遗传病的基因得以定位，因此，可以应用基因芯片技术筛查遗传病，且方便可靠。2、肿瘤诊断已用基因芯片可检测人鼻咽癌、肺癌基因表达谱、肿瘤原癌基因和抑癌基因的定位。例：人类恶性肿瘤中，约有60%与人类P53抑癌基因的突变有关，现研究人员研制成功了可检测P53基因所有编码区错位突变和单碱基缺失突变的基因芯片。第19页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.2024203、感染性疾病的诊断利用基因芯片对一些感染性的疾病疾病如HIV的诊断现已成为事实。4、耐药菌株和药敏检测例：据WHO报告，全球每年约有800万的结核病患者，有300万人死亡，死亡人数超过艾滋病和疟疾的总和。主要原因是菌株对不同的药物产生了抗药性（俄国80%TB对一种药物产生抗性，美国50%为多重耐药）。对每例患者进行菌株和药敏鉴定是控制TB的关键。因此，俄美两国科学家共同开发了此种功能的基因芯片，并且该种芯片可清洗反复使用50次。第20页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202421（二）药物研究中的应用1、新药开发高通量的DNA芯片可发现众多的新基因和新的靶分子用于新药的设计，同时，有时同一种药物的作用是多方面的，基因芯片有助于发现一种药物的新的功能，原先设想的作用是针对某一靶标的，但在全基因或广范围筛选中却发现该药物在另一方面具有很强的抑制作用，从而开发成另一种新药。2、调查药物处理细胞后基因的表达情况这类研究既有利于阐明药物的作用机制，也有助于确定药物作用的靶基因，为新药研究提供线索。第21页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.2024223、对药物进行毒性评价应用芯片查找药物的毒性或副作用，进行毒理学研究，尤其是慢性毒性和副作用，往往涉及基因或基因表达的改变。如果药物能抑制重要基因的表达，则对它的深入研究就值得考虑。用芯片做大规模的表达研究可省略大量的动物试验。第22页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202423（三）在中医领域的应用中医学中应用基因芯片技术，还处于初始阶段，目前主要集中以下三方面：1、中药的研究在中药学中引入基因芯片技术，可大大推动中药研究的国际化进程，为阐明中药的作用机理，具有重要的意义。2、中医“证”本质的研究中医“证”是中医药的临床治疗核心，但“证”的本质研究一直难以有重大进展。主要因为中医理论涉及到生命的整体，牵涉到许多基因和蛋白质，传统的方法无法弄清“证”的实质，而利用基因芯片技术，对不同“证”状态下的基因组进行扫描，再绘出不同“证”的基因表达谱，通过相关分析，可以从分子水平揭示“证”的本质。第23页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.2024243、针灸原理研究针灸的原理涉及全身各个部分、针灸不同方法、不同穴位、经络是否具有不同的作用，也即是经脉与脏腑间的相关联系是否具有相对特异性。通过基因芯片测量不同组织中基因表达的差异，判断基因表达是否具有特异性来解决这一问题。另外，基因芯片还有助于揭示针灸的作用机制。针灸的作用是与神经内分泌网络系统密切相关的，它涉及到细胞信使、神经递质、调质、神经肽、细胞因子、内分泌激素等多种因子，但针灸的信号是如何在细胞间和细胞内传递的过程仍不明朗，如果引入基因芯片，可以高通量的检测细胞内基因表达的时空特征，有助于了解针灸促进基因表达的时空特征，有助于了解针灸促进基因表达的特点，进而再利用蛋白组学相关技术，揭示针灸作用机理。第24页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202425（四）其他应用1、环境化学毒物的筛选采用毒物检测芯片可对环境中众多化学物质对人类基因的潜在毒性进行筛选，探查毒物“开启”或“关闭”哪些基因，研究“环境如何改变我们的基因”并建立化学物质指纹库，通过检测特定基因的突变与否判断新的合成物质的生物毒性。2、体质医学的研究体质医学关系到个体化治疗的核心问题，通过基因芯片来研究每个个体的差异，已达到个体化治疗的目的。第25页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202426第二节：基因芯片设计及优化一、基因芯片设计的一般性原则基因芯片的设计在整个过程中是关键的一步，将影响后续的工作-检测和分析结果。基因芯片设计主要包括两个方面：(1)探针的设计指如何选择芯片上的探针(2)探针在芯片上的布局指如何将探针排布在芯片上。第26页,共30页，2024年2月25日，星期天17.04.202427根据芯片的目的、作用来进行设计，如基因表达比较分析和基因组规模的DNA变异。确定芯片所要检测的目标