鸡胚成纤维细胞的制作与培养-(2)课件

鸡胚成纤维细胞的制作与培养实验八实验目的：了解原代细胞培养的原理，掌握鸡胚成纤维细胞的体外培养方法。实验用途：细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疾病诊断必不可少的工具。病毒能在易感的组织和单层细胞内增殖，并可产生细胞病变。细胞培养可分为原代细胞培养、传代细胞培养。实验原理：原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程，自供体体内取出组织分散单个成单个细胞接种于培养液中为初次培养，从初次培养到第一次传代培养为原代细胞培养。由组织刚刚分离出来的细胞能够分裂增殖，形成单层细胞。实验仪器：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、水浴箱、37℃培养箱实验材料：蛋架、酒精灯、酒精碘酊棉球、试管架、消毒水等。已灭菌的材料：细胞培养瓶(5-7mL)、吸管(巴氏吸管)、三角瓶、平皿若干、漏斗、4层纱布（在漏斗里面）、手术剪、镊子（装在铝饭盒）、烧杯、离心管、注射器等。鸡胚：9~11日龄

消化液：含0.25％胰蛋白酶（预先置于37℃温箱中）

培养基：用DMEM培养基(含5-10%胎牛血清,100单位双抗）

Hanks液：洗胚及吹打用实验方法

1.取胚及剪碎：将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊酒精棉消毒气室，以镊子击破卵壳，撕开卵膜、撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，Hanks液洗去体表血液，移入灭菌烧杯中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1立方毫米大小的碎块，加入2-5mLHanks液轻摇洗去体表血液，静止1～2min，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗2次，吸干Hanks液，留组织。

2.消化：先将胰酶放在37℃温箱中预热。将组织块移到三角瓶中，加入量约3~5倍的0.25%胰酶（一个鸡胚约5mL胰酶），然后将三角瓶放入水浴箱中消化约15-30min左右，每隔5min轻轻摇动和观察一次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此时再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时或组织块棱角变模糊则需中止消化。如再继续消化下去，可破坏细胞膜而不易贴壁生长（细胞死悼），如果消化不够，则细胞不易分散。3.洗涤：取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用3-5mL的Hanks液反复清洗3次，吸去胰酶，吸干上清液，留组织块。4.吹打：加2mL含血清DMEM培养液，以吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊，即为细胞悬液。静置1min后，使未冲散的组织块下沉。5.过滤：用4层纱布将吹打后的细胞过滤到离心管中。6.离心：

2000rpm，10~15min，弃上清液，用DMEM约2ml重悬沉淀的细胞（吹打均匀）。7.细胞计数与稀释：用血细胞计数法计数，把细胞液稀释成50万~70万个/mL。8.分装培养：先加入约5mLDMEM培养液在细胞培养瓶中，然后将重悬的细胞移至细胞培养瓶中，轻轻均匀（注意不要溢到瓶盖）。盖好瓶塞，置37℃温箱进行培养。在瓶上注明组别，日期，4h后细胞即可贴壁，24~36h生长成单层细胞，此时可更换培养液，并接种病毒。注意事项细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水冲洗3次，再用双蒸水冲洗3次，干燥后灭菌备用。所有的溶液都要用双蒸水配制，所用药品试剂要用分析纯试剂，严格要求无菌操作。制备细胞的整个过程严格无菌操作培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要。放入CO2培养箱培养时，不要将盖子拧的特别紧，并将CO2浓度控制在5%。一般2d换一次培养液，细胞长成单层后要及时进行细胞传代。试剂配制Hank’s液配制：

KH2PO40.06g

Nacl8.0gNaHCO30.35g

KCl0.4g

葡萄糖1.0gNa2HPO4·7H2O0.06g

酚红0.1％1ml

加H2O至1000ml

0.1％胰酶的配制传代细胞：0.25％原代细胞：0.1％

胰蛋白酶：0.25gHank’s100ml

用NaHCO3

调pH＝7.8（胰酶作用的最适pH）

0.02％EDTA协助消化过滤除菌DMEM培养基制备：

DMEM培养基

1000双蒸水用滤膜过滤除菌，用前用NaHCO3调PH到7.2～7.4，并加10％犊牛血清。DMEM培养基

无水氯化钙硝酸铁.9H2O氯化钾无水硫酸镁氯化钠

无水磷酸二氢钠D-泛酸钙

丁二酸酒石酸胆碱

丁二酸钠叶酸肌醇烟酰胺甘氨酸核黄素盐酸硫胺盐酸吡哆辛葡萄糖甲硫氨酸

L-丝氨酸

L-色氨酸

L-苏氨酸

L-酪氨酸

L-缬氨酸

L-盐酸精氨酸