因工程制药工艺

关于因工程制药工艺第六章基因工程制药工艺6.1基因工程制药微生物表达系统6.2基因工程大肠杆菌的构建6.3基因工程菌的发酵培养与控制第2页,共61页，2024年2月25日，星期天基因工程技术—基因重组示意图DNA片段经酶切、连接，形成重组DNA分子导入宿主细胞系统中扩增目标基因表达，生成新产物，出现新性状第3页,共61页，2024年2月25日，星期天6.2基因工程大肠杆菌的构建技术6.2.1构建流程6.2.2目标基因的克隆6.2.3表达载体构建6.2.4工程菌构建第4页,共61页，2024年2月25日，星期天6.2.1工程菌构建流程目标基因克隆PCR、文库，化学合成表达载体构建酶切、连接遗传转化与筛选外源基因导入与培养工程菌新性状、功能、物质工作内容方法第5页,共61页，2024年2月25日，星期天6.2.2目标基因的克隆策略目标基因：编码蛋白质或多肽的DNA序列正确克隆的重要性：只要有一个碱基发生（错义、无义、移码）突变，就导致编码氨基酸的变化，影响产物蛋白质的功能和生物学活性。只要一个碱基发生同义突变，就可能导致生产过程和效率变化。第6页,共61页，2024年2月25日，星期天基因克隆方法的选择方法优点缺点PCR扩增简便快速，高效，数kb，单基因克隆DNA聚合酶活性和保真性限制文库筛选长片段，无碱基错误，未知序列基因克隆繁琐，过程复杂，耗时，昂贵化学合成简便，准确，已知序列，引物合成受合成仪器性能限制，长度很短第7页,共61页，2024年2月25日，星期天PCR技术PCR（Polymerasechainreaction，聚合酶链式反应）：由DNA聚合酶催化下，对特定DNA序列进行的复制反应。本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因。发明者：Mullis，生物技术革命性象征，1993年获得诺贝尔化学奖。第8页,共61页，2024年2月25日，星期天在引物指导下，以DNA为模板，由DNA聚合酶催化的扩增特定DNA序列聚合延伸形成互补序列的反应。3’AGCGAGGCATCG5’5’TCGCTCCGTAGC3’第9页,共61页，2024年2月25日，星期天PCR单反应原理与过程(1)变性（94℃）(2)退火（55℃）(4)完成一个循环(3)延伸（72℃）第10页,共61页，2024年2月25日，星期天PCR扩增的反应体系组成成分浓度用量作用缓冲液10x5ul提供反应环境dNTPs20mmol/L1ul反应的底物正向引物20umol/L2.5ul扩增的起始点反向引物20umol/L2.5ul扩增的终止点DNA聚合酶1-5U/ul1-2U催化，热稳定性MgCl21.5-5.0mmol/L1ulMg2+是辅酶模板DNA5-10ul含目标基因序列H2O27-33ul稀释总体积50ul第11页,共61页，2024年2月25日，星期天PCR扩增产物电泳PCR仪水平电泳槽凝胶电泳第12页,共61页，2024年2月25日，星期天6.2.2RT-PCR克隆目的基因流程提取RNA转cDNA设计合成引物基因片段的3’/5’末端扩增RT-PCR扩增全长基因基因片段扩增第13页,共61页，2024年2月25日，星期天6.2.2RT-PCR克隆目的基因流程第14页,共61页，2024年2月25日，星期天1提取RNA从表达基因的组织中提取总RNA，或mRNA可以用RNA提取kit,Unizol,Trizol大量提取时可以用传统的一步法提取--Unizol或Trizol是总RNA提取试剂，在配制过程中加入了异硫氢酸胍，能够在组织匀浆过程中迅速灭活RNA酶，保持RNA的完整性。第15页,共61页，2024年2月25日，星期天总RNA提取操作步骤：1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。2、12,000rpm离心5min，弃沉淀。3、按200

l氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。4、4℃12,000g离心15min。5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。第16页,共61页，2024年2月25日，星期天6、按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5~10min。7、4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。8、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。9、4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。10、室温晾干或真空干燥5~10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。11、可用50

lH2O，TEbuffer溶解RNA样品，55~60℃,5~10min。注：H2O、TE须用DEPC处理并高压。第17页,共61页，2024年2月25日，星期天RNA提取注意事项严格防止RNA酶污染1.佩戴一次性手套2.玻璃器皿可以在250℃烘箱中烘烤3小时3.枪头、Eppendorf管用0.1%DEPC（搅拌搅匀）水中浸泡。通风橱中室温过夜，扣去液体，高压灭菌30分钟。DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。4.DEPC处理的水：0.1%DEPC处理，高压灭菌30分钟脱毒5.防止环境中RNA酶污染第18页,共61页，2024年2月25日，星期天2.转cDNA（防RNA酶）逆转录:

将mRNA转录成为cDNA逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)

禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶

鼠白血病病毒(MLV)反转录酶,降解RNADNA杂交体中的RNA的能力较弱,对热的稳定性较AMV反转录酶差cDNA合成:1.总RNA2.底物，dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.引物,起始DNA的合成,oligo(dT)4.逆转录酶

5.DEPC处理水温浴，按试剂盒说明书。第19页,共61页，2024年2月25日，星期天3.引物设计特异性引物设计Specificprimer简并引物设计Degeneratedprimer嵌套引物Nested

Primer第20页,共61页，2024年2月25日，星期天1）长度15~30bp2）AT:GC约50%，两引物Tm值接近，55~88℃之间。退火温度＝Tm(4GC＋2AT)－53）引物3’末端以G/C结尾较好4）不形成引物二聚体5）特异性,作BLAST搜索6）简并引物：保守序列；简并度低；具单一密码子的氨基酸放在3’端7）逆向引物要用互补序列引物设计原则第21页,共61页，2024年2月25日，星期天1）特异性引物设计基因序列已知时,可以设计特异性引物特异性引物：有准确的碱基序列第22页,共61页，2024年2月25日，星期天第23页,共61页，2024年2月25日，星期天第24页,共61页，2024年2月25日，星期天

F：XXXF，5’-

XXXXXXatggccgcttcgcgtgcaacg-3’

atggccgcttcgcgtgcaac

gtttgttgcgctcgtgtgcgctctcgcgctcgccgccgccgatgtgcagaatccgctcagtgacgatttcatcaatctcatcaacacaaagcaaaactctaacgaagtcagggaccagggatcttgtggtagctgctggggttcggtgctgtggaggccatgaccgaccggtactgtacatactccaatggaactcaac

acttccatttctccgctga

tcagcggagaaatggaagtgt-3’R：XXXR，5’-

XXXXXX第25页,共61页，2024年2月25日，星期天2）根据蛋白质同源序列设计简并引物DNAMAN当基因序列未知时,利用软件进行同源比对,设计间并引物第26页,共61页，2024年2月25日，星期天第27页,共61页，2024年2月25日，星期天用DNAMAN进行同源比对,设计引物将蛋白质序列保存为seq文件格式比对、系统树拷贝、保存第28页,共61页，2024年2月25日，星期天4.RT-PCR扩增目的基因cDNA模板RNA/mRNAPCR扩增目的基因cDNAPrimerFPrimerR第29页,共61页，2024年2月25日，星期天PCR循环94°C2’94°C30’’55°C45’’72°C1’72°C10’

25

lvolume10Xbuffer(含MgCl2)，2.5

l

2.5mMdNTP，2

lTemplatecDNA，1

lForwardPrimer，1

l

ReversePrimer，1

lDistilledWater，17.375

l

Taq酶，0.125

l

35第30页,共61页，2024年2月25日，星期天6.2.3酶切、连接、转化、筛选1.酶切反应概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。5’突出端3’突出端平末端第31页,共61页，2024年2月25日，星期天分析基因的限制性内切酶谱，确定插入质粒的限制性内切酶位点

atgaactgtgtttgccgcctggtcctggtcgtgctgagcctgtggccagatacagctgtcgcccctgggccaccacctggcccccctcgagtttccccagaccctcgggccgagctggacagcaccgtgctcctgacccgctctctcctggcggacacgcggcagctggctgcacagctgagggacaaattcccagctgacggggaccacaacctggattccctgcccaccctggccatgagtgcgggggcactgggagctctacagctcccaggtgtgctgacaaggctgcgagcggacctactgtcctacctgcggcacgtgcagtggctgcgccgggcaggtggctcttccctgaagaccctggagcccgagctgggcaccctgcaggcccgactggaccggctgctgcgccggctgcagctcctgatgtcccgcctggccctgccccagccacccccggacccgccggcgcccccgctggcgcccccctcctcagcctgggggggcatcagggccgcccacgccatcctgggggggctgcacctgacacttgactgggccgtgaggggactgctgctgctgaagactcgg第32页,共61页，2024年2月25日，星期天/第33页,共61页，2024年2月25日，星期天第34页,共61页，2024年2月25日，星期天酶切反应操作酶切体系组成：DNA，缓冲液，限制性内切酶反应条件：适宜温度（37℃），1小时以上终止反应：加热，加入EDTA，螯合镁离子电泳检查：酶切完全性超螺旋第35页,共61页，2024年2月25日，星期天3.连接反应概念：在连接酶的催化下，将DNA双链上相邻的3’羟基和5’磷酸基团共价结合形成3-5磷酸二酯键，使两条断开的DNA链重新连接起来。第36页,共61页，2024年2月25日，星期天连接反应操作连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶连接反应：16~26℃，数小时，或过夜终止反应：在70℃加热10分钟第37页,共61页，2024年2月25日，星期天4.转化概念：把外源基因导入宿主细胞的过程。第38页,共61页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌转化—CaCl2法感受态细胞融化：置冰上，缓慢加入连接反应产物：混匀，置冰上30min热击：42℃，90s置冰上，1~2min扩增培养：加入LB培养基，37℃，45min涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上筛选培养：倒置平板，37℃，出现菌落。第39页,共61页，2024年2月25日，星期天5.筛选与鉴定转化后的细胞类型非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞转化子：导入外源DNA的转化细胞非重组子：仅含有空载体分子的转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子非目标重组子：连接不正确的重组子目标重组子：含有连接正确的重组子（目的）第40页,共61页，2024年2月25日，星期天（1）筛选策略与方法基于载体抗生素筛选法抗生素抗性基因氨苄青霉素被Bla基因编码产物β-内酰胺酶分泌到培养基水解。卫星菌落：大菌落具有抑制抗性，周围产生了相对抗性区，允许一些没有抗性的原菌生长。第41页,共61页，2024年2月25日，星期天蓝白斑筛选-α互补原理质粒lacZ标记基因，编码产物为

β-半乳糖苷酶N端146aa，无活性，α受体。大肠杆菌染色体DNA：编码C端部分序列，无酶活性，α供体。受体与供体结合，恢复β-半乳糖苷酶的活性，从而将无色X-gal底物水解成蓝色产物。有外源基因，白色菌落；无外源基因，蓝色菌落.第42页,共61页，2024年2月25日，星期天（2）鉴定方法菌落PCR：含有目标基因载体大小：电泳检测酶切鉴定：目标基因插入及插入方向测序验证：目标基因的序列准确无误，阅读框通读。第43页,共61页，2024年2月25日，星期天6.2.3表达载体构建表达载体设计目标基因的定位克隆DNA重组筛选与鉴定这里重点介绍表达载体的设计（构建过程与技术与目标基因克隆相似）。第44页,共61页，2024年2月25日，星期天表达载体的设计表达载体概念：在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因表达盒所构成。外源基因表达盒（操纵子模型）：启动子目标基因终止子第45页,共61页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌lac启动子受环腺苷酸（cAMP）激活蛋白（CAP）的正调控和lac

Ⅰ负调控。CAP-cAMP复合物与操纵子结合，促进了RNA聚合酶与启动子结合，开启基因转录。lacⅠ形成四聚体，与操纵基因结合，阻止转录起始。lac操纵子的诱导物：IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）等乳糖类似物IPTG与lacⅠ结合，解除了lacⅠ的阻遏作用，激活基因转录。LacⅠCAP-BSPromoterOperatorlacZlacYlacATerminatorRNA聚合酶lacⅠ糖苷酶，转移酶，透过酶阻遏蛋白第46页,共61页，2024年2月25日，星期天启动子功能：启动子与RNA聚合酶结合，起始基因转录最关键的元件：决定着表达的类型和产量序列特点：-35位，TTGACA序列；-10位，TATAAT序列；强启动子：UP元件第47页,共61页，2024年2月25日，星期天终止密码设计UAA/TAA，UAG/TAG，UGA/TGATAA：真核和原核，广泛使用，高效TGA：高效过量表达时，能被tRNAtrp通读。TGAT可阻止通读。为了防止通读，在终止密码子之后的加强序列，成为四联终止密码子：TAAT>TAAG>TAAA和TAAC第48页,共61页，2024年2月25日，星期天6.2.4基因工程菌的建立过程：适宜宿主菌的转化筛选鉴定，遗传稳定性等目标：获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载体，确保药物的生物活性。第49页,共61页，2024年2月25日，星期天表达筛选与产物鉴定不同菌种的表达筛选诱导表达时间和诱导强度的筛选产物存在形式和存在场所的鉴定

--胞外，周质，胞内；包涵体，可溶性蛋白表达产物结构与活性鉴定

--电泳，SDS，等电点电泳

--免疫杂交，末端测序，质谱分析

--分析与目标产物的同一性第50页,共61页，2024年2月25日，星期天1、不同菌株的表达能力不同同一菌种的不同转化细胞之间存在表达差异。对宿主菌必需进行筛选目的：获得最大表达量的菌种对转化细胞的对数期进行诱导，收集菌体，裂解，提取总蛋白质，进行SDS电泳。第51页,共61页，2024年2月25日，星期天2、不同诱导时间下的表达在不同诱导时间，取样，电泳随着诱导时间的延长，表达量增加第52页,共61页，2024年2月25日，星期天3、蛋白质存在形式分析大肠杆菌M109结果：在上清，可溶性蛋白质可溶性表达第53页,共61页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌DH5α结果：蛋白质存在于沉淀中，以包涵体形式表达第54页,共6