亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座

血浆病毒灭活的必要性亚甲蓝病毒灭活血浆的制备亚甲蓝病毒灭活的技术原理病毒灭活血浆的质量控制亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第1页血浆病毒灭活必要性伴随血液检测技术进步和血液管理办法完善，当前HBsAg、抗-HCV、抗-HIV检测在很大程度上降低了输血造成病毒传输几率，但因为1病毒变异造成免疫反应性改变；2免疫静默感染；3检测技术存在窗口期漏检不足；4检测病原体种类局限；

输血引发艾滋病病毒（HIV、HCV、HBV）风险尚不能完全杜绝；不常见病毒如人类T淋巴细胞白血病病毒（HTLV）、西尼罗病毒（WNV）、EB病毒等在大多数国家均未被列入血液常规检测。现有检测伎俩不能完全排除血浆中可能存在未知病毒。

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血浆制品病毒去除方法：乙醇沉淀深层过滤离子交换色谱和亲和层析色谱纳米膜过滤

纳米膜过滤技术单一病毒灭活/去除方法即使能很好起处处理病毒效果，不过无法灭活和去除全部病毒，如细小病毒B19、VIR918、PARV4、SV40和PrPSc。主要在血浆蛋白分离工艺中应用亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第3页血浆病毒灭活方法有机溶剂/去污剂（S/D）法热处理蒸汽处理法以上方法多用于从原料血浆生产血浆蛋白制品，均需要将大量的不同人份的血浆混合处理，不但容易增加某些不能被灭活病原体（如朊病毒prion等）的扩散风险，且处理难度大，费用高。亚甲蓝光化学法能对单人份血浆进行病毒灭活，适用于采供血机构对临床用血浆的病毒灭活处理，更适合于我国的国情和临床实际应用。

终端干热法

低pH孵放法辛酸处理法亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第4页亚甲蓝病毒灭活技术原理

亚甲蓝又名美蓝，分子量319185，是一个光敏剂，吩噻嗪类染料，其最大吸收峰为670nm，临床上常作为解毒剂，用于治疗亚硝酸盐中毒引发高铁血红蛋白血症和氰化物中毒。亚甲蓝表面携带正电荷，与病毒核酸结合后能够嵌入DNA/RNA中，与病毒核酸带负电荷G-C碱基对相结合。在有光照条件下，亚甲蓝分子吸收光能后可激发产生单态分子氧，这种单态分子氧经过修饰鸟嘌呤碱基而影响核酸，使其产生缺口，引发核酸链断裂或造成碱基位点丢失，从而阻止其复制,到达灭活病毒目标。亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第5页

与脂膜和蛋白质结合对核酸有较高亲和性亚甲蓝为多靶点光敏剂，光照射产生单线态氧和羟自由基引发广泛损伤亚甲蓝可与病毒核酸与脂质包膜相结合，在可见光作用下，可使病毒核酸断裂，包膜破损，因而能杀灭包含艾滋病病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）等脂质包膜病毒和部分非脂质包膜病毒。

对亚甲兰光化学法病毒灭活有效性研究显示，血浆中指示病毒滴度显著下降，血浆中病毒含量下降了6个数量级，可能残留病毒量低于百万分之一，到达了国际公认血浆病毒灭活有效性指标，也符合卫生部关于血浆制品病毒灭活相关要求。

亚甲蓝病毒灭活技术原理

亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第6页美国AABB技术手册描述了病原体灭活血浆制品，介绍了欧盟开展三种病毒灭活方法，其中包含亚甲蓝、核黄素和补骨脂素。但美国未开展。欧盟指南中描述了病原体灭活FFP制品质量要求，同时也介绍了三种方法。英国指南中明确描述了亚甲蓝处理和去除FFP制品质量要求，质量要求中对亚甲蓝残留量要求为≤0.3umol/L

，与我们国家标准一致。亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第7页1992年，德国最早将依靠该项技术处理的新鲜冰冻血浆应用于临床。90年代中期，上海血液中心开发以荧光照射光源和配置亚甲蓝去除滤器为特点的亚甲蓝光化学血浆病毒灭活技术，随后该项技术在我国被逐步推广。2004年，世界卫生组织将亚甲蓝光化学血浆病毒灭活技术列入

“人血浆制品病毒灭活或去除指南”，

欧盟和英国也纳入“输血指南”。2007年乌鲁木齐市血液中心引进该技术,截至2014年底使用亚甲蓝光化学病毒灭活血浆13万单位以上。亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第8页一次性使用血浆病毒灭活输血过滤器Depasse最早提出了“过滤器应用”，极大地简化和改进了MB-P法操作，为MB-P法由试验室走向临床迈出了主要一步。当前使用一次性使用血浆病毒灭活输血过滤器主要由亚甲蓝添加元件、光照袋、过滤器、血浆储存袋和连接管路组成，是一个简便、实用血浆灭活器材。亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第9页亚甲蓝作为一个外来物质进入人体后，对人体潜在影响尚不可知。若病毒灭活血浆中残留过多亚甲蓝，还会造成血浆外观和色泽显著改变，使病人输注时可能产生心理负担。在确保灭活所需有效浓度下，要尽可能降低其残留量，因而对病毒灭活血浆中亚甲蓝残留量/率进行控制很有必要。选择适当亚甲蓝含量测定方法很主要。亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第10页医用病毒灭活箱应用当前医用病毒灭活箱是用于光照灭活时专用设备，它集光源、温控、机械摆动等装置于一身，能够依据需要设定照射强度、照射温度、照射时间和摆动频率等很多条件，使用方便。光源选择：荧光灯（1）单位时间内照射所释放热量较低；（2）到达相同灭活效果照射时间最短；（3）波长接600~700nm。照射方式：有效光照强度范围在30000~40000lx。（1）放置血袋托盘为钢丝结构，有较大空隙，使血袋两面都能够接收照射；（2）照射过程中托盘以60±2次/分钟频率摆动；（3）箱内面为镜面，能够将灯管直射光源和镜面反射光源从360度全方位地照射血浆。亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第11页亚甲蓝病毒灭活血浆在我国开展近十年，各种关于病毒灭活对血浆主要成份影响情况报道可归纳为：血浆经过MB-P法灭活后，血浆总蛋白回收率90%以上；但部分不稳定凝血因子(Ⅴ，Ⅷ)和纤维蛋白原（Fg）改变显著，Ⅷ因子回收率普通在80%左右。血浆免疫原性、各种电解质、酶稳定性等改变不显著，PH值也未受影响。亚甲蓝浓度与血浆病毒灭活效果有直接关系，只有到达一定释放量才能起作用，但亚甲蓝若残留过多会影响血浆外观色泽，且亚甲蓝存在致突变可能性，因而必须对灭活前后亚甲蓝含量进行测。亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第12页血浆中亚甲蓝残留量检测固相萃取小柱将亚甲蓝从血浆中提取出。分光光度计检测。不能直接用分光光度计测定血浆中亚甲蓝含量,因为血浆本身为复杂混合物,含有各种蛋白,在亚甲蓝最大吸光波优点血浆蛋白亦有吸光,而且血浆蛋白个体差异很大,所以无法取得准确检测结果,要想准确检测血浆中亚甲蓝含量,必须排除干扰,既将亚甲蓝提取出来,再进行测定。亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第13页亚甲蓝检测依据《血站技术操作规程》年版：14附录F血液质量控制检验方法—F.19

亚甲蓝残留量。《全血及成份血质量标准》

GB18467-—5.16病毒灭活冰冻血浆质量标准，亚甲蓝残留量≤0.30µmol/L。亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第14页15血浆中亚甲蓝残留量检测所需试验仪器、试剂试验仪器:固相萃取富集装置及配套固相萃取耗材：推荐使用WatersOasis产品（）真空泵分光光度计试管离心机试剂：亚甲蓝标准品粉剂、甲醇、乙酸、蒸馏水其它耗材：容量瓶、移液器、试管等亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第15页亚甲蓝残留量检测原理固相萃取-分光光度法

利用固相小柱内吸附介质是一个大孔聚合物，对血浆中亚甲蓝含有很强选择性吸附，可排除血浆蛋白、脂肪和其它杂质干扰，当血浆标本经过小柱时，血浆中血浆中亚甲蓝被柱子中大孔聚合物吸附，最终用洗脱液洗脱液洗脱亚甲蓝，采取柱子提取血浆中残留亚甲蓝，用含1%醋酸甲醇溶液调零，在653nm检测标准、质控、测定管，其吸光度与浓度呈正比。亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第16页WatersOasis小柱特征:-大孔聚合物.对化合物保留强

-是一个通用性吸附剂（pH范围较宽1-14）-

30%甲醇清洗,可完全去除血浆中蛋白、脂质和其它杂质

-亚甲蓝在不一样溶剂中,最大吸收峰不一样：甲醇溶液为653nm,故本法选653nm为测试波长.

-

可用1％乙酸甲醇溶液,快速将柱床顶亚甲蓝洗脱.亚甲蓝酸性染料，（pH3.51％乙酸甲醇溶液）亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第17页18主要检测设备：固相萃取富集装置亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第18页亚甲蓝残留量检测方法使用WatersOasis小柱萃取血浆中亚甲蓝使用前Waters小柱1、用6ml甲醇活化Waters小柱2、加入6ml供试血浆亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第19页亚甲蓝残留量检测方法将萃取出亚甲蓝洗脱后进行比色

Waters小柱萃取出血浆中亚甲蓝3、萃取亚甲蓝4、用30％甲醇6mL清洗5、用含1％乙酸甲醇溶液2ml洗脱6、洗脱液离心（3500rpm/10min）

7、用含1％乙酸甲醇溶液作试剂空白，在654±2nm波优点测定吸光度注：用一样方法萃取检测标准品亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第20页成品试剂盒组成小柱R1：活化液R2：清洗液R3：洗脱液亚甲蓝标准液：（100μmol/L)质控液：（0.300μmol/L）亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第21页操作方法（详读说明书、按说明书操作）1、柱预处理 取小柱三支表明测定、标准、质控，分别插入固相萃取装置过滤柱子中，加入3ml活化液活化小柱。2、加标准液（10μmol/L）：（取血浆0.36ml,加100μmol/L标准液0.04ml混匀）于标明标准小柱内加0.3ml标准液3、加质控液（0.300μmol/L）：

（取血浆0.36ml,加质控液0.04ml混匀）于标明标准小柱内加0.3ml质控液4、加样：于标明测定小柱内加6.0ml血浆亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第22页5、清洗

待血浆完全进入小柱后，用3ml清洗液清洗小柱，去血浆中蛋白质、脂质和其它杂质，血浆中亚甲蓝被吸附于吸附剂上。6、洗脱

换洁净试管，加2ml洗脱液洗脱小柱上亚甲蓝。

亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测专家讲座第23页7、检测

将洗脱液离心3000转/5分钟，取上清液于4040半自动生化分析仪检测洗脱液调零，654nm波长，分别测定标准管和测定管吸光