SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

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SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物生物化学试验技术教学中一个主要试验之一。

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能够带动生化试验技术综合型试验项目标开设。

如：蛋白质盐析沉淀提取→葡聚糖凝胶层析分离→DEAE-纤维素分离提纯蛋白质→蛋白质纯度判定、蛋白质分子量测定等。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第3页一、试验目标经过该试验使学生掌握SDS测定蛋白质分子量原理；掌握该技术操作方法（基础性很强，使用范围宽敞；利用SDS测定蛋白质分子量及染色判定。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第4页二、试验原理

带电质点在电场中向带有异相电荷电极移动，这种现象称为电泳。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第5页

区带电泳使用不一样支持介质，有滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。

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（一）分类

PAGE依据其有没有浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类：

1.连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第7页2.不连续系统：因为缓冲液离子成份、pH、凝胶浓度及电位梯度不连续性，带电颗粒在电场中泳动不但有电荷效应，分子筛效应，还含有浓缩效应，因而其分离条带清楚度及分辨率均较前者佳。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第8页

（二）特点：

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。

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蛋白质在一定浓度含有强还原剂SDS溶液中，与SDS分子按百分比结合，形成带负电荷SDS-蛋白质复合物。

蛋白质丧失了原有电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征负离子团块，降低或消除了各种蛋白质分子之间天然电荷差异，所以在进行电泳时，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第10页蛋白质分子移速度取决于分子大小。当分子量在15000Da到00Da之间时，蛋白质迁移率和分子量对数呈线性关系。合下式：，式中

将已知分子量标准蛋白质迁移率对分子量对数作图，可取得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，依据它电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第11页图1标准蛋白质与待测样品电泳图谱

图2电泳迁移率与logMW之间关系

940006200043000310002010014400胶槽123注：胶槽1标准蛋白；胶槽2、3样品蛋白得到同行教授赞SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第12页采取SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，必须完全打开蛋白质之间二硫键，使蛋白质分子被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上。所以在用SDS处理样品同时用巯基乙醇处理。巯基乙醇是一个强还原剂，它使被还原二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第13页三、试验试剂和器材

材料

试验试剂

1.低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌动蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制剂MW=20,100

鸡蛋清溶菌酶MW=14,400

开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保留，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。

样品1：称3mg样品1，加2ml蒸馏水溶解。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第14页

2.30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺

（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中

3.10%SDS（十二烷基磺酸钠）

4.1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g（PH计）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第15页（7）10%过硫酸铵(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+

溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-

HCl（2ml），最终定容至10ml。

（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。

（11）染色液：称取考马斯亮蓝R2500.125g，加上述固定液

250ml，过滤后备用。

（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。

（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第16页试验器材

垂直板电泳装置直流稳压电源电泳厚胶浓度后要做8各小时，薄胶5各小时）电泳仪标准型酸度计（TLD80-2B）离心机等SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第17页四、试验过程

如：免疫球蛋白G分子量测定

（一）血清γ-球蛋白提取

硫酸胺盐析沉淀法

（二）γ-球蛋白脱盐纯化

葡聚糖凝胶过滤（柱层析法）除去硫酸胺，得到γ-球蛋白（去年完成基金项目）

（三）纯化免疫球蛋白G

DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G。

（四）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定血液免疫球蛋白G分子量（连续四个单项试验）。

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（1）制胶（简单叙述）（双层胶，探索胶浓度）

A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个洁净锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。B.按百分比配好分离胶，溶液马上倾入制胶模板中(15ｍｍ模板)，加少许蒸馏水，待胶凝固后，倒出水并用滤纸把剩下水分吸干，按百分比配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，样梳需一次平稳插入，静置40分钟，待模板中胶定型后，轻轻取出梳形样品槽模具，梳口处不得有气泡，拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液。

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C.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,

D.加样（探索加样量）

取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10µl2倍样品缓冲液，上样量为20µl。

取10µl样品溶液，再加入10µl2倍样品缓冲液，上样量分别为5µl和10µl。

E.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。

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F.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在8mA，（电流、电压）当进入分离胶后改为16mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停顿电泳。

G.凝胶板剥离与染色电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标识后放在大培养皿内，加入染色液，染色过夜。

H.脱色染色后凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色。

※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第21页图1标准蛋白质与待测样品电泳图谱

图2电泳迁移率与logMW之间关系

五、试验结果分析

940006200043000310002010014400胶槽123注：胶槽1标准蛋白；胶槽2、3样品蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第22页六、分析计算绘制标准曲线：按下式计算

电泳迁移率=样品迁移距离/溴酚兰迁移距离

以每个蛋白标准分子量对数对它相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白迁移率即可测出其分于量，这么标难曲线只对同一块凝胶上样品分子量测定才含有可靠性。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第23页

标准蛋白分子量（标准试剂盒）：

97400kD、66200kD、43000kD、31000kD、0kD、14400kD。

采取不连续SDS电泳法对所分离纯化蛋白质进行纯度判定，发觉图中电泳图谱能够清楚看到两条蛋白带。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第24页

两条蛋白带代表绵羊免疫球蛋白G重链和轻链。

计算分析结果表明：

绵羊血清lgG重链和轻链分子量分别为50000和28000Kd。普通说来，当蛋白质分子量在00至15000kD之间时，电泳迁移率与分子量对数呈线性关系。试验结果各谱带所代表成份分子量范围均在此之间。用SDS垂直板电泳测得绵羊血清含有一定可信度。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第25页七、思索题在不连续体系SDS中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为何?在不连续体系SDS中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第26页十二、到达预期目标

1.SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物生物化学试验技术教学中一个综合性试验项目，且是一个较高水平一个试验项目。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第27页

蛋白质盐析沉淀提取→凝胶层析分离（上年基金项目已完成）→DEAE-纤维素分离提纯蛋白质→蛋白质分子量测定、生物分子纯度判定等综合项目（五个单项试验项目）。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量专家讲座第28页

2.该项目标完成对我们课程建设起到了促进发展作用，到达了我们预期目标。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋