免疫组织化学染色SP技术

武汉大学病理教研室免疫组织化学应用IHC经过检测细胞内、细胞表面或细胞间正常或异常物质，以研究组织细胞正常生理、代谢及疾病病因、发病机理，广泛用于各种蛋白质或肽类物质表示水平检测，细胞属性判定、淋巴细胞免疫表型分析、细胞增殖和凋亡研究，以及细胞周期和信号转导研究等。免疫组织化学染色SP技术第1页武汉大学病理教研室试验名称链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法(Streptavidin-PeroxidaseConjugatedMethod,简称S-P法)检测胃癌组织CK／Vimentin蛋白表示免疫组织化学染色SP技术第2页武汉大学病理教研室S-P法原理示意图过氧化物酶链酶亲和素生物素生物素化二抗特异性一抗待测抗原免疫组织化学染色SP技术第3页武汉大学病理教研室免疫组织化学基本试验流程组织、细胞标本

抗原修复

阻断内源性过氧化物酶

正常血清封闭

滴加特异性一抗滴加二抗

滴加三抗显色复染封片

免疫组织化学染色SP技术第4页武汉大学病理教研室详细步骤以下：1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；2．全部组织均采取微波修复抗原；3．室温冷却后，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒孵育10min；5．0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育10min；免疫组织化学染色SP技术第5页武汉大学病理教研室7．甩去多出血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵育过夜，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；8．滴加生物素标识二抗（试剂C），37℃湿盒孵育15min，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D），37℃湿盒孵育15min，甩去多出液体；10．每片滴加新鲜配制二甲基联苯胺（DAB）显色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来水充分冲洗，苏木素复染；11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；12．阳性对照采取已知阳性片为标准，阴性对照采取PBS取代第一抗体，其余步骤相同。免疫组织化学染色SP技术第6页武汉大学病理教研室试验流程中注意事项内源性过氧化物酶灭活血清封闭冲洗抗体选择及一抗孵育时间检测及显色系统复染免疫组织化学染色SP技术第7页武汉大学病理教研室染色前处理

－取材、脱水、浸蜡组织及时固定

固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林4%多聚甲醛常规下固定8-二十四小时取材厚度：2mm免疫组织化学染色SP技术第8页武汉大学病理教研室染色前处理

－预防脱片常选取多聚耐氨酸（poly-L-lysine）注意：1）应严格控制使用次数2）玻片洁净度免疫组织化学染色SP技术第9页武汉大学病理教研室染色前处理

－包埋与切片

包埋：选择低熔点石蜡，温度不超出62℃切片：厚度

3-4μm

烤片：温度60℃，时间1小时；或60℃2小时（迈新）；或60℃过夜免疫组织化学染色SP技术第10页武汉大学病理教研室染色前处理

－切片保留切片不宜长时间在常温下保留免疫组织化学染色SP技术第11页武汉大学病理教研室染色前处理

－脱腊标准：免疫组化脱蜡试剂应与常规HE脱蜡分开免疫组织化学染色SP技术第12页武汉大学病理教研室试验操作中应用抗原修复试验操作中注意事项免疫组织化学染色SP技术第13页武汉大学病理教研室抗原修复影响染色结果最关键原因抗原修复方法分类1）酶消化法2）加热法（高压法›水煮法›微波法）抗原修复液选择

1）柠檬酸盐缓冲液（PH7.2-7.4）2）Tris（PH7-8）3）EDTA（PH8.0）

免疫组织化学染色SP技术第14页武汉大学病理教研室内源性过氧化物酶灭活存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、单核细胞、肝细胞及肾细胞消除方法：3%H2O2浸泡10分钟免疫组织化学染色SP技术第15页武汉大学病理教研室血清封闭目标：降低非特异性着色时间：普通在加载一抗之前使用免疫组织化学染色SP技术第16页武汉大学病理教研室冲洗普通采取PBS（PH7.4-7.6）充分冲洗增加效果可加入Tween20免疫组织化学染色SP技术第17页武汉大学病理教研室一抗孵育时间及抗体选择应选择信誉高、质量好试剂企业抗体切忌重复冻融一抗为浓缩液时，需选择最正确稀释浓度按说明书可采取37℃1-2小时或4℃冰箱过夜免疫组织化学染色SP技术第18页武汉大学病理教研室检测及显色系统普通采取以生物素标识辣根过氧化物酶为基础检测方法。如SP、LSABC、ABC等显色方法：经常采取辣根过氧化物酶系统检测免疫组织化学染色SP技术第19页武汉大学病理教研室显色系统惯用酶1.辣根过氧化物酶(HRP)A:显色底物DAB-----棕黄色敏感度高、定位清楚、易于观察、保留B:显色底物AEC-----砖红色2.碱性磷酸酶(AP)显色底物:BCIP/NBT----蓝紫色免疫组织化学染色SP技术第20页武汉大学病理教研室复染标准：注意二者之间对比，突出阳性信号免疫组织化学染色SP技术第21页武汉大学病理教研室试验对照设计标准：全部检测指标均设阳性对照、阴性对照编号阳性片待检片阴性对照结论1－－－操作失误，抗体失效2＋＋＋非特异性着色3－＋－阳性片不含靶抗原4＋－－待检片不含定位抗原5＋＋