生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座

第十三章

生化药品和基因工程药品分析概念生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第1页1、了解生化药品、基因工程药品定义、种类。2、熟悉质量检验基本程序与方法。3、掌握生化药品、基因工程药品特点及惯用化学定量分析方法。本章学习关键点生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第2页人类用于预防、治疗和诊疗疾病三大主要药品第一节概述化学药品生物药品中药生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第3页生物药品定义：利用生物体、生物组织或器官等成份，综合利用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学原理与方法制得一大类药品。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第4页生物药品分类：生化药品生物技术药品生物制品从生物体分离纯化制得生化基本物质，以及用化学合成、微生物合成或当代生物技术制得一类药品。利用生物体或其组成部分发展产品技术体系即当代生物技术研制药品称之。应用普通或基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术取得微生物、细胞及各种动物和人源组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊疗药品。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第5页一、生化药品和基因工程药品定义1、生化药品定义从动物、植物及微生物提取，也可用生物－化学半合成或用当代生物技术制得生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子结构修饰物等。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第6页2、基因工程药品定义先确定对某种疾病含有预防和治疗作用蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程基因进行分离、纯化或人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最终将该基因导入能够大量生产受体细胞中不停繁殖或表示，并能进行大规模生产含有预防和治疗这种疾病蛋白质，经过这种方法生产药品称之。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第7页1、氨基酸、多肽与蛋白质类药品二、生化药品和基因工程药品种类（一）生化药品种类（1）氨基酸及其衍生物：①单氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸等。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第8页②氨基酸衍生物：N-乙酰-L-半胱氨酸、S-氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸、谷胺酰胺、S-羟色氨酸。③复合氨基酸注射液：3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S复合氨基酸注射液。（S代表氨基酸种类）生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第9页（2）多肽类药品：①垂体多肽：促肾上腺皮质激素、促胃液素、加压素。②消化道多肽：促胰液素（胰泌素）、胃泌素、抑胃肽。③下丘脑多肽：促甲状腺素释放激素、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第10页④脑多肽：由人及动物脑和脑脊液中分离出来多肽、蛋氨酸脑啡肽和亮氨酸脑啡肽等。⑤激肽类：血管担心肽I、II、III等活性肽。⑥其它肽类：谷脱甘肽、降钙素、睡眠肽、松果肽、血活素（分子量为3000肽为主成份)。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第11页（3）蛋白类药品猪或牛纤维蛋白原、纤维蛋白、胃膜素（糖蛋白）、水蛭素、肝细胞生长因子；属蛋白质类激素还有生长素、催乳素、促甲状腺素、促泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）；植物起源蛋白类药品有植物凝集素、天花粉蛋白、蓖麻和相思豆毒蛋白等。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第12页2、酶类药品（1）助消化酶类：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、麦芽淀粉酶。（2）蛋白水解酶类：溶菌酶、胰DNA酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶。（3）凝血酶及抗栓酶：凝血酶（猪、牛血）、纤溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第13页（4）抗肿瘤酶类：L-天门冬酰胺酶、甲硫氨酸酶、组氨酸酶、谷氨酸胺酶。（5）其它酶类：细胞色素C、超氧化物歧化酶（SOD）、RNA酶、青霉素酶。（6）辅酶：CoA、黄素单核苷酸（FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。

生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第14页3、多糖类药品（1）肝素、硫酸软骨素A和C、硫酸皮肤素（硫酸软骨素B）、硫酸角质素、透明质酸等。（2）类肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、壳聚多糖、右旋糖苷、灵芝多糖、猪苓多糖、人参多糖、黄芪多糖等。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第15页4、脂质类药品卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、麦角固醇、B谷固醇、胆汁酸（胆酸与甘氨酸或牛黄酸结合物）、鹅脱氧胆酸、胆红素、原叶琳、血叶琳、亚油酸、花生四烯酸、五-六烯酸、前列腺素系列（PGE1、PGE2、PGE2a和PG12）。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第16页5、核酸类药品RNA（包含iRNA-免疫核糖核酸）、DNA（脱氧核糖核酸）、聚肌苷酸、巯基聚胞苷酸、cAMP、AMP、肌苷。另外，有核酪制剂，6-巯基嘌呤、6-硫代嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-碘苷和无环鸟苷等。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第17页二、基因工程工药品种类1、激素类及神经递质类药品（1）人生长激素释放抑制因子（2）人胰岛素（3）人生长激素2、细胞因子类药品（1）人干扰素生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第18页（2）人白细胞介素（3）集落刺激因子（4）促红细胞生长素3、酶类及凝血因子类药品单克隆抗体、疫苗、基因治疗药品、白介素、生长因子、反义药品、肿瘤坏死因子等。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第19页1、共同特点：含有一定生物活性或生理功效，能够参加、影响和调控人体代谢和生理功效，对于一些疾病治疗含有针对性强、毒副作用小、易为人体所吸收等特点。三、生化药品和基因工程药品特点生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第20页2、分子量不是定值除氨基酸、核苷酸、辅酶及甾体激素等属化学结构明确小分子化合物外，大部分为大分子物质，其分子量普通几千至几十万。对大分子药品而言，即使组分相同，往往因为分子量不一样而产生不一样生理活性。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第21页

3、结构确证难在这类药品中，因为有效结构或分子量不确定，其结构确实证极难沿用元素分析、IR、UV、NMR、MS等方法加以证实，往往还要用生化法如氨基酸序列等法加以证实。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第22页4、全过程质量控制这类药品对热、酸、碱、重金属以及pH较敏感，需对原材料、生产过程和最终产品进行质量控制。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第23页5、生物活性检验在制备多肽或蛋白质类药品时，有时因工艺条件改变，造成蛋白质失活。所以，除了用通常采取理化法检验外：尚需用生物检定法进行检定，以证实药品生物活性。

生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第24页6、安全性检验因为这类药品性质特殊，生产工艺复杂，易引入特殊杂质和污染物，故常需做安全性检验。7、效价测定对酶类药品需进行效价测定或酶活力测定，以表明其有效成份含量高低。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第25页第二节质量检验基本程序与方法

一、判别试验（一）理化判别法利用化学法、物理法及生物学方法来确证生化药品真伪。用标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第26页1、化学反应法通常利用药品与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色产物或沉淀进行判别。比如，溶菌酶判别采取呈色法；胃蛋白酶判别采取沉淀法。2、HPLC法生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第27页3、UV法三磷酸腺苷二钠分子中含有共轭系统，能吸收紫外光。本品0.01mol／L盐酸水溶液（20μg／ml），在（257±1）nm波优点有最大吸收。A250nm／A260nm值应为0.17～0.27。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第28页（二）生化判别法

1、酶法：尿激酶是专属性较强蛋白水解酶，依据尿激酶能激活牛纤维蛋白溶酶原，而含有相同作用链激酶不能激活牛纤维蛋白溶酶原而加以区分，并用直接观察溶解纤维蛋白作用气泡上升法作为判断指标。

生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第29页2、电泳法肝素判别采取糖凝胶电泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成酸性粘多糖，其水溶液带强负电荷，于琼脂凝胶板上，在电场作用下，向正极方向移动，与肝素国家标准品对照，其移动位置应相一致。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第30页3、样品脱盐后等电点聚焦法测定测定药品等电点（为出现多条区带多个等电点），同批次同一产品等电点应相同，表明其工艺稳定。（三）生物判别法：利用生物体进行试验来判别药品。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第31页二、杂质检验（一）普通杂质检验检验项目包含氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液澄清度或溶液颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第32页（二）特殊杂质检验许多药品是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得，药品中易残余一些杂质或其它成份。1、原料药纯度分析2、生产过程中杂质检验生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第33页三、安全性检验（一）热原检验法（家兔、鲎试剂）（二）异常毒性试验：用一定剂量药品按指定操作方法和给药路径给予要求体重某种试验动物，观察其急性毒性反应。反应判断以试验动物死亡是否为终点。

生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第34页（三）过敏试验（检验异性蛋白）药品中若夹杂有异性蛋白，在临床使用时易引发病人各种过敏反应，轻者皮肤出现红斑或丘疹，严重者可出现窒息、发结、血管神经性水肿、血压下降，甚至休克和死亡。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第35页（四）降压物质检验法降压物质是指一些药品中含有能造成血压降低杂质，包含组胺、类组胺或其它造成血压降低物质。起源：用动物脏器或组织为原料制备生化药品，正常组织内存在组胺及部分氨基酸脱羧形成组胺、酪胺等胶类物质。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第36页（五）无菌检验法（检验活菌）因为许多药品是在无菌条件下制备，且不能高温灭菌。所以，无菌检验就更有必要。中国药典中几乎全部注射用药如注射用尿激酶等，均做无菌检验。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第37页1、无菌检验基本步骤：①培养基制备，为细菌生长、繁殖提供所必需营养物质─碳源、氮源、维生素、矿物质等。②选择对照用菌液，供对照试验用。③详细检验，如接种、培养等操作。④结果判断，得出阴性或阳性结论。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第38页2、注意事项：①无菌检验全部过程应严格恪守无菌操作法，包含对操作环境、试验材料及用具酶灭菌等，预防微生物污染。②应防止在有抑菌条件下操作。③从事无菌操作人员应具备微生物学基础知识及一定工作经验，不然要经过无菌技能培训，方能从事此工作。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第39页（六）基因工程药品中可能杂质与污染物检验可能杂质：残留DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素等；主要污染物：微生物、热原、病毒等。主要检验项目：外源性DNA、其它外源性杂质测定生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第40页（七）致突变试验包含：微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微核试验等。（八）生殖毒性试验包含：普通生殖毒性试验、围生期毒性试验。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第41页四、含量（效价）测定含量表示方法百分含量，适合用于结构明确小分子药品或经水解后变成小分子药品。生物效价或酶活力，适合用于酶类、蛋白质类等药品。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第42页（一）含量测定1、HPLC法2、SDS法（二）效价测定：采取国际或国家参考品，或经国家检定机构认可参考品，以体内或体外法测定其生物学活性，并标明其活性单位。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第43页第三节惯用定量分析方法及其应用一、理化法（一）化学分析法1、重量法：依据样品中分离出单质或化合物重量测定所含成份含量。（1）提取法（2）挥发法（3）沉淀法生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第44页（二）电化学分析法

离子选择性电极：测量离子活度指示电极。

2、滴定分析法：依据样品中一些成份与标准溶液能定量地发生酸碱中和、氧化还原或络合反应等进行测定。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第45页（三）光谱分析法1、比色法：样品与显色剂可发生颜色反应，依颜色反应强度测定含量。如蛋白质含量测定，可利用蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应，而进行定量测定。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第46页2、UV法：样品或转化后产物在某一波优点有最大吸收，在一定浓度范围内，其浓度与吸收度成正比，则可进行定量测定。如蛋白质在280nm左右有最大吸收

。3、荧光分光光度法：依据物质被UV光照射后产生荧光强度进行定量测定。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第47页（四）色谱分析法1、HPLC法（1）RP-HPLC法：适合用于肽类、氨基酸、蛋白质和多糖测定，如生白能。固定相：C8、C18烷基硅烷键合相流动相：甲醇-水、乙腈-水（甲醇）、乙腈-缓冲液生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第48页（2）高效离子交换色谱法（HPIEC）HPIEC特点以下：①蛋白质、多肽分离是依据其对应离子化程度而进行。②分离过程是以盐浓度增大梯度洗脱法进行③柱效中等并具较高质量活性回收。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第49页（3）高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）HPGFC特点以下：①活性蛋白质可得以回收。②分离是在固定百分比水溶液中进行。③分离是依据蛋白质或多肽在溶液中对应有效粒径而进行。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第50页2、高效毛细管电泳法（HPCE）HPCE是依据带电组分在管中因为其所带电荷和分子量大小，即荷质比不一样产生不一样迁移速度而分离。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第51页类型酶活力测定法：以酶为分析对象，测定样品中某种酶活力或活性，并用活力单位和比活性表示

。酶分析法：以酶为分析工具或分析试剂，测定样品中酶以外其它物质含量。二、酶法生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第52页（一）酶活力测定法1、定义：酶活力是指酶催化一定化学反应能力。酶活力测定实际上是测定一个被酶所催化化学反应速度─能够用单位时间反应底物降低或产物增加来表示。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第53页2、方法（1）终点法：在适当条件下，把酶和底物混合，测定生成一定量产物所需时间。（2）将酶和底物混合后隔一定时间，间断地或连续地测定反应连续改变。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第54页（3）将酶与底物混合后，让其反应一定时间，然后停顿反应，定量测定底物降低或产物生成量。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第55页（二）酶分析法1、动力学分析法：

经过条件控制，分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂浓度在酶反应中起决定反应速度主导作用。则酶反应速度和上述对应原因浓度间将含有确定百分比关系，经过测定酶反应速度即可求出它们浓度。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第56页2、总变量分析法（平衡法或终点法）：

依据被测物质（底物）性质，选择适宜分析工具酶对该物质进行作用，在反应完成后，借助理化方法测出其总改变量，并参考反应平衡点，计算出被测物实际含量或浓度。生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座第57页三、电泳法（一）基本原理电泳法是指带电微粒如蛋白质、核苷酸、其它微粒分子或离子在电场作用下，向其对应电极方向按各自速度泳动而使