蛋白质的基本机构和功能

蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能第1页主要内容蛋白质分子组成蛋白质分子结构蛋白质理化性质蛋白质分离纯化蛋白质的基本机构和功能第2页蛋白质(Protein)种类繁多大肠杆菌约含蛋白质3000种，人体内含蛋白质10万余种。蛋白质是细胞中含量最丰富生物大分子约占人体固体成份45%，可达细胞干重70%。蛋白质的基本机构和功能第3页

蛋白质是生命物质基础1.催化功效2.调整功效3.支持功效4.运输功效5.营养功效6.运动功效7.防御功效8.识别功效9.信息传递功效10.凝血与抗凝血功效

蛋白质生物学功效蛋白质的基本机构和功能第4页第一节蛋白质分子组成蛋白质的基本机构和功能第5页C50~55%H6~7%O19~24%N13~19%S0~4%有些蛋白质还含有P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se等。各种蛋白质含氮量靠近，平均为16%；样品测定中1克氮相当于含6.25克蛋白质（凯氏定氮法）

。

一、蛋白质元素组成蛋白质的基本机构和功能第6页二、蛋白质基础组成单位——氨基酸

蛋白质受酸、碱或蛋白酶水解产生游离氨基酸。所以，组成蛋白质基础单位是——氨基酸(aminoacid)

。蛋白质的基本机构和功能第7页

（一）氨基酸分类

依据R侧链基团结构和性质不一样，可将20种氨基酸分为4类：

1.非极性疏水性氨基酸

2.极性中性氨基酸

3.酸性氨基酸

4.碱性氨基酸蛋白质的基本机构和功能第8页

1.非极性疏水氨基酸侧链为烃基、吲哚环、甲硫基等疏水性基团。这类氨基酸在水中溶解度小于极性中性氨基酸。

2.极性中性氨基酸侧链为羟基、巯基、或酰氨基等极性基团，有亲水性，但在中性水溶液中不电离氨基酸。蛋白质的基本机构和功能第9页

3.酸性氨基酸侧链上有羧基，在水溶液中能释放出H+而带负电荷氨基酸。有谷氨酸、天冬氨酸。

4.碱性氨基酸侧链上有氨基、胍基或咪唑基，在水溶液中能结合H+而带正电荷氨基酸。有赖氨酸、精氨酸和组氨酸等。蛋白质的基本机构和功能第10页POLARNON-POLARTyrHisGlyAcidicNeutralBasicAspGluGlnCysAsnSerThrLysArgAlaValIleLeuMetPheTrpPro氨基酸按照极性分类极性或非极性，是氨基酸性质基础蛋白质的基本机构和功能第11页LeuL-C-C-CONH2-C-CONH2-C-COOH-C-C-COOH-H-CH3-C-OH-C-SH-C-C-S-CPPro-C-CCNN+

-C-C-C-C-NH3+-C--C--OH-C-NSouthlineCircularlineCentrallineNorthwestlineAliphaticAmideAcidicImino,CircularBasicSulfurHydroxyAromatic-C-C-C-N-C-N

N+=

C-C-C-C

C-C-C-C

CC-C

CCCHNC-COOH

a-C-C

OHGlnQAspDGluEPheFArgRLysKHisHGlyGAAAlaVValI

IleSerSThrTCysC氨基酸代谢图TrpWNon-polarPolarArgRTyrYAsnNMetM蛋白质的基本机构和功能第12页(二)氨基酸理化性质1.物理性质

都是白色晶体，熔点较高。能溶于强酸和强碱溶液；在水中溶解度各不相同。2.两性解离与等电点氨基酸是两性电解质，其解离方式取决于所处溶液酸碱度。

蛋白质的基本机构和功能第13页氨基酸等电点（isoelectricpoint,pI)

在某一pH溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液pH称为该蛋白质等电点。蛋白质的基本机构和功能第14页

3.紫外吸收性质

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有吸收作用。其最大吸收峰在280nm附近，以色氨酸吸收最强。利用此性质可采取紫外分分光度法测定溶液中蛋白质含量。蛋白质的基本机构和功能第15页4.氨基酸化学反应（1）茚三酮反应

氨基酸与水合茚三酮在溶液中共热，发生一系列反应，生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm。此反应可用于氨基酸定性和定量分析。

注：脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应产生

黄色化合物。

蛋白质的基本机构和功能第16页氨基酸分析仪图解AspThrThrLysGlyGluSerProAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisNH3Arg0.20.41.00.60.8光吸收流出液(mL)15cm柱，pH3.25，0.067mol/L柠檬酸钠15cm柱，pH4.25，0.067mol/L柠檬酸钠15cm柱，pH5.25，0.12mol/L柠檬酸钠缓冲液泵显色反应管茚三酮泵已分开氨基酸离子交换柱样品注入口统计仪光电倍增管光源蛋白质的基本机构和功能第17页（2）与亚硝酸反应:VanSlyke法测定氨基酸氨基酸氨基在室温下与亚硝酸作用，生成氮气。经过在标准条件下测定生成氮气体积，即可计算出氨基酸量。生成氮气只有二分之一来自氨基酸。可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度测定。蛋白质的基本机构和功能第18页（3）桑格（Sanger)反应

氨基酸－NH2与2，4一二硝基氟苯（DNFB）反应，生成DNP-氨基酸；黄色，提取、层析法判定来测定氨基酸。蛋白质的基本机构和功能第19页（4）丹磺酰氯（DNS-Cl）反应氨基酸－NH2与DNS反应；因为丹磺酰氯基含有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，而且水解后DNS－氨基酸不需要提取，可直接用纸电泳或薄层层析加以判定。蛋白质的基本机构和功能第20页(5)埃德曼反应(Edmanreaction）苯异硫氰酸酯，PITC苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），无色，能够用层析法分离判定。被Edman用来判定多肽NH2末端氨基酸蛋白质的基本机构和功能第21页三、氨基酸在蛋白质分子中连接方式（一）肽键和肽

肽键（peptidebond)是由一个氨基酸分子α-羧基与另一个氨基酸α-氨基脱水缩合形成化学键。蛋白质的基本机构和功能第22页蛋白质的基本机构和功能第23页命名、编号蛋白质的基本机构和功能第24页第二节蛋白质分子结构蛋白质的基本机构和功能第25页蛋白质是由许多氨基酸单位经过肽键连接形成含有特定分子结构高分子化合物。蛋白质分子结构可分为一级、二级、三级和四级。一级结构是蛋白质基础结构，二级、三级、四级结构称为高级或空间构象。蛋白质的基本机构和功能第26页一、蛋白质一级结构概念

是指蛋白质分子中氨基酸排列次序。主要化学键

肽键、有些蛋白质还含有二硫键。

一级结构是决定蛋白质空间构象和特异生物学功效基础，但不是决定蛋白质空间构象唯一原因。蛋白质的基本机构和功能第27页二、蛋白质空间结构空间结构指蛋白质分子内各原子围绕一些共价键旋转而形成各种空间排布及相互关系，称为蛋白质构象。蛋白质构象分为主链构象和侧链构象。蛋白质的基本机构和功能第28页（一）蛋白质二级结构

概念

是指蛋白质多肽链主链原子局部空间排列，不包括氨基酸残基侧链构象。维系蛋白质二级结构主要化学键是氢键。蛋白质的基本机构和功能第29页

2.蛋白质二级结构主要形式α-螺旋β-折叠β-转角无规卷曲蛋白质的基本机构和功能第30页

（1）α-螺旋蛋白质的基本机构和功能第31页α-螺旋结构特点

①多肽链以肽键平面为单位，α-碳原子为转折点，有规律盘绕成右手螺旋结构。②每3.6个氨基酸残基盘绕一圈，螺距为0.54nm。③相邻螺旋肽键之间形成氢键，方向与长轴基础平行，维持螺旋稳定。④R基团伸向螺旋外侧，其大小、形状及电荷性质均影响α-螺旋形成。蛋白质的基本机构和功能第32页（2）β-折叠

蛋白质的基本机构和功能第33页

β-折叠结构特点①多肽链呈伸展状态，肽键平面沿长轴折叠呈锯齿状，两平面间夹角为110°，R基交替地伸向锯齿状结构上下方。②若干肽段相互靠拢，平行排列，经过氢键连接。氢键方向与长轴垂直。③若两条肽段走向一致（N端、C端方向相同），称为顺向平行；反之，称之为逆向平行，逆向更稳定。

蛋白质的基本机构和功能第34页β-折叠包含平行式和反平行式两种类型

蛋白质的基本机构和功能第35页（3）β-转角

蛋白质的基本机构和功能第36页β-转角特点

①主链骨架本身以大约180°回折②回折个别通常由4个氨基酸残基组成③构象依靠第一残基-CO基与第四残基-NH基之间形成氢键来维系。

蛋白质的基本机构和功能第37页

（4）无规卷曲

是指多肽链中除了以上几个比较规则构象外，其余没有确定规律性那个别肽链构象。

蛋白质的基本机构和功能第38页蛋白质的基本机构和功能第39页（二）蛋白质三级结构概念

是指整条肽链中全部原子空间排布，它包含主链构象和侧链构象。主要化学键

疏水键、氢键、盐键等非共价键和二硫键。疏水键是维持三级结构稳定最主要作用力。蛋白质的基本机构和功能第40页结构域（domain）

分子量大蛋白质在形成三级结构时，肽链中一些局部二级结构聚集在一起，形成发挥生物学功效特定区域，称为结构域。纤连蛋白(fibronectin)蛋白质的基本机构和功能第41页由一条多肽链形成蛋白质，其最高级结构为三级结构。只有含有三级结构蛋白质才含有生物学活性。蛋白质的基本机构和功能第42页

（三）蛋白质四级结构许多蛋白质分子是由两条或两条以上含有独立三级结构多肽链经过非共价键聚合而成，其中每条含有独立三级结构多肽链称为亚基。

概念

蛋白质分子中各亚基之间空间排布和相互接触关系。

化学键氢键、盐键、范氏引力、疏水键等非共价键。蛋白质的基本机构和功能第43页蛋白质结构中应注意几个问题由一条多肽链形成蛋白质其最高级结构为三级，含有三级结构蛋白质才含有生物学活性。形成蛋白质四级结构最少要有两条多肽链。两条或两条以上多肽链靠共价键连接蛋白质没有四级结构。由一条多肽链形成蛋白质与亚基不一样。蛋白质的基本机构和功能第44页三、蛋白质结构与功效

蛋白质一级结构与功效关系

一级结构决定蛋白质空间结构；一级结构决定蛋白质生物学功效。蛋白质空间结构与功效关系

蛋白质构象是其生物学功效基础，构象改变功效改变。蛋白质的基本机构和功能第45页第三节蛋白质理化性质蛋白质的基本机构和功能第46页一、蛋白质两性解离与等电点

1.蛋白质是两性电解质

蛋白质分子中可解离基团

多肽两端游离α-氨基和α-羧基多肽侧链R上解离基团

决定蛋白质解离成正负离子原因蛋白质所含酸性和碱性基团数目蛋白质所在溶液pH值蛋白质的基本机构和功能第47页2.蛋白质等电点（pI）

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液pH称为蛋白质等电点。蛋白质等电点性质为电泳分离依据。

蛋白质的基本机构和功能第48页Pr(pH＜pI)(pH＝pI)(pH＞pI)蛋白质阳离子蛋白质兼性离子蛋白质阴离子NH2COO-PrNH3+COOHPrNH3+COO-OH-H+OH-H+蛋白质的基本机构和功能第49页

体内大多数蛋白质等电点在pH5.0左右，因而在生理条件下以阴离子形式存在。蛋白质的基本机构和功能第50页3.电泳

带电粒子在电场中向电性相反电极移动现象。蛋白质在带电场中泳动速度和方向与其所带电荷性质、数量及分子大小、形状相关。带电荷多，分子小泳动速度较快；反之则泳动较慢，从而到达分离蛋白质目标。

蛋白质的基本机构和功能第51页二、蛋白质胶体性质

1.蛋白质有胶体性质蛋白质是生物大分子，分子量在1万～10万Da之间，分子直径在胶体颗粒范围（1~100nm），所以，蛋白质含有胶体性质。蛋白质的基本机构和功能第52页

2.蛋白质亲水胶体稳定原因蛋白质分子表面水化膜和同种电荷。去掉两个稳定原因，则蛋白质从溶液中析出而产生沉淀。

3.蛋白质胶体性质应用

透析用于分离纯化蛋白质

超速离心用于蛋白质分离纯化及分子量测定。蛋白质的基本机构和功能第53页蛋白质的基本机构和功能第54页变性概念

在一些物理或化学原因作用下，蛋白质特定空间构象被破坏，从而造成其理化性质改变和生物活性丧失，称为蛋白质变性。变性实质次级键断裂，空间结构破坏

三、蛋白质变性、沉淀和凝固蛋白质的基本机构和功能第55页

引发变性原因

物理原因高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等。

化学原因

强酸、强碱、有机溶剂、尿素、重金属盐等。蛋白质的基本机构和功能第56页变性蛋白质特点

A.生物学活性丧失B.溶解度降低，易于沉淀

C.粘度增加

D.结晶能力消失

E.易被蛋白酶水解蛋白质的基本机构和功能第57页蛋白质变性应用应用变性原因进行消毒、灭菌。保留生物制剂则要预防蛋白质变性。蛋白质复性大多数蛋白质变性后，空间构象严重破坏，不能恢复其天然状态，称为不可逆性变性；若蛋白质变性程度较轻，去除变性原因，有些可恢复其天然构象和生物活性,称为蛋白质复性。

蛋白质的基本机构和功能第58页牛核糖核酸酶变性与复性蛋白质的基本机构和功能第59页蛋白质沉淀概念蛋白质从溶液中析出现象称为沉淀。方法盐析法、有机溶剂沉淀、重金属盐沉淀、生物碱试剂及一些酸类沉淀。变性蛋白质易于沉淀，但不一定都发生沉淀。沉淀蛋白质易发生变性，但并不都变性，如盐析。蛋白质的基本机构和功能第60页四、蛋白质紫外吸收性质

蛋白质分子中含有共轭双键苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基，含有紫外吸收能力，在280nm处有最大吸收峰。此特征常见于蛋白质含量测定。蛋白质的基本机构和功能第61页五、蛋白质免疫学性质蛋白质作为大分子，往往含有免疫原性，同时，抗体也是蛋白质。抗原（免疫原）：凡能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与对应抗体或致敏淋巴细胞受体发生特异性结合物质。抗体：机体中因抗原刺激而产生能与对应抗原特异结合并具免疫功效免疫球蛋白。单克隆抗体：由针对某一个特定抗原决定簇而分化、增殖而来B淋巴细胞群合成并分泌抗体。蛋白质的基本机构和功能第62页六、蛋白质呈色反应1.双缩脲反应：肽键与双缩脲试剂反应呈紫色；氨基酸无此反应，可用于检验蛋白质水解程度。碱性溶液中与Cu2+反应，mg级测定2.茚三酮反应:酸性条件下，与茚三酮共热产生蓝紫色3.Folin—酚试剂反应碱性+Cu2++磷钼酸-磷钨酸→蓝色范围:25-250μg(Tyr,Trp反应)蛋白质的基本机构和功能第63页1.紫外分光光度法:280nm,0.1-0.5mg/ml(样品含核酸时)蛋白质(mg/ml)=1.55A280-0.75A2602.福林-酚试剂法:碱性+Cu2++磷钼酸-磷钨酸→蓝色范围:25-250μg(Tyr,Trp反应)七、蛋白质含量测定蛋白质的基本机构和功能第64页3.Biuret法：蛋白质+碱性+Cu2++BCA试剂(4,4‘-二羧酸-2,2’-二喹啉钠)→紫色(562nm)范围:10-1200μg/ml4.

Bradford蛋白分析法:考马斯亮蓝G-250+乙醇+酸性→淡红色+蛋白质→蓝色(595nm)范围:10-100μg/ml蛋白质的基本机构和功能第65页5.双缩脲法肽键+碱性+Cu2+→紫红色范围:0.5-10mg/ml6.凯氏定氮法1g氮相当于样品含有6.25g蛋白质蛋白质的基本机构和功能第66页第四节蛋白质分离纯化蛋白质的基本机构和功能第67页一、蛋白质提取1.选材：新鲜、富含目标蛋白且起源方便2.组织细胞粉碎：胞内及膜中蛋白物理法：如超声、匀浆、加砂研磨、高压挤压等化学法：如EDTA、SDS等酶法：如自溶法、外加酶法（纤维素酶、果胶酶、溶菌酶等）3.提取：适当溶媒、适当条件、适当提取时间和次数蛋白质的基本机构和功能第68页二、蛋白质分离纯化（一）依据溶解度不一样1.等电点沉淀:蛋白质在pI时溶解度最小2.