鹿流行性出血病检疫技术规范

鹿流行性出血病检疫技术规范6病毒分离及鉴定6.1病毒分离6.1.1试剂与材料6.1.1.1鹿胎肾细胞或幼仓鼠肾细胞(BHK-21):使用时配制成3×10°个/mL细胞悬液。6.1.1.2EHDV阳性血清和阴性血清：试验前血清需经56℃灭能30min。6.1.1.310日～11日龄SPF鸡胚。6.1.1.4细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS、BLP等，配方及配制方法见附录B。6.1.2.1倒置光学显微镜，荧光显微镜。6.1.2.2二氧化碳培养箱。6.1.2.3研钵或组织捣碎机，离心机。6.1.2.4可调微量移液器。6.1.2.5细胞培养瓶、细胞培养板等。6.1.2.6照蛋灯、开孔器。6.1.3样品采集与处理6.1.3.1血液样品采集与处理取肝素抗凝血5ml,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤血样3次～4次，每次2000r/min离心10min.弃上清液后加入等量BLP,置冰浴中用超声波(40μA、1min)处理，经处理的样品当天使用，使用前置4℃保存，剩余样品置-70℃保存备用。6.1.3.2组织样品采集与处理无菌采集动物肾、脾、肝各5g,剪碎后加入乳耕蛋白陈缓冲肉汤(BLF)10mL(含青霉素2000IU/ml…,链霉素2000pg/mL),置乳钵中研磨，置4℃浸泡4h以王，取上清液5mL用超声波裂解(100pA、1min~2min)处理或冻融三次，3000r/min离心20min,取上清液快用，使用前置4℃保存，剩余样品置-70℃保存备用。6.1.3.3库螺样品采集与处理取200个～300个库蝶盛于小试管中，加入含青霉素20001U/mL,链霉素2000μg/mL的BLP3ml~5mL置冰溶中研磨虫体，3000r/min离心20min,取上清液使用，使用前置4℃保存，剩余样品置-70℃保存备用。6.1.4鸡胚静脉接种6.1.4.1开孔：选择10d~11d发育良好的SPF鸡胚，在照蛋灯上标记静脉位置和开孔区，用开孔器开窗备用。6.1.4.2接种：在无菌条件下，每份样品接种5个鸡胚，每个鸡胚接种0.1mL…接种后用溶解的石蜡封口，置33.5℃培养。6.1.4.3观察：逐日观察并记录，48h内死亡的鸡胚为非特异性死亡，收取48h后死亡的鸡胚置4℃冰箱保存，于接种后第6d同未死亡鸡胚一起收毒。6.1.4.4收毒：在无菌条件下，用碘酒、酒精棉球对鸡胚气室处进行消毒，凿开蛋壳，按常规方法剪破壳膜、尿囊膜、羊膜后，取出胚体，置平皿中，在每个胚体上取若干组织块(有病变时，取病变组织》,置组织捣碎器或研钵中研磨后，按115加入BLP(含青霉素2000IU/mL,链霉素2000μg/mL),置4℃浸提4h.冻融三次，3000r/min离心20min.取上清液当日使用，剩余样品置-70℃保存备用。6.1.5接种敏感细胞盲传6.1.5.1按常规方法制备鹿胎肾细胞或BHK-21细胞单层。6.1.5.2将收获的鸡胚上清液，4℃5000r/min,离心20min。取上清液接种细胞单层，每份病料接种两孔，每孔接种0.1ml.,置37℃培养，培养5d。6.1.5.3第5天用吸管吹下被接种的鹿胎肾细胞或BHK-21细胞，冻融一次。6.1.5.4将冻融的细胞悬液接种于已长成单层的鹿胎肾细胞或BHK-21细胞单层，37℃吸附1h后，加入维持液置37℃培养，24h后逐日观察细胞病变(CPE)。连续观察5d。病原接种敏感细胞，盲传2代，无细胞病变，判为病毒分离阴性；出现细胞病变，则需进一步进行鉴定。6.2病毒鉴定6.2.1荧光抗体试验6.2.1.1将接种的鹿胎肾细胞或BHK-21细胞培养物冻融一次，1000r/min离心10min,取上清液接种于带有玻片的24孔细胞培养板的细胞单层。每份样品接种两孔，同时设阳性、阴性对照，37℃吸附1h后加入维持液，置37℃培养72h。取出培养板中的玻片，用0.01mol/LPBS每片滴加荧光标记的鹿流行性出血病病毒抗体，使其覆盖于玻片，置暗湿盒中于37℃作用用0.01风干，用碳酸缓冲甘油(配制见附录B)封片，荧光显微镜检查。结果判定；在阳性对照细胞浆内呈现颗粒状的黄绿色荧光.用性对照应无荧光或无特异性荧光时，细胞浆内发现颗粒状的黄绿色荧光者即可判为阳性。6.2.2病毒中和试验6.2.2.1病毒繁殖收获在鹿胎肾细胞或BHK-21细胞上出现CPE的病毒悬液，复壮一代，待CPE达75%,收获病毒培养物冻融1次，2000r/min离心20min.分装置-70℃保存备用。6.2.2.2毒价测定将鹿流行性出血病病毒接种鹿胎肾细胞或BHK-21细胞单层，37℃吸附1h后加入维持液，置5%二氧化碳培养箱于37℃培养，接种24h后逐日观察。待CPE达75%以上，收获病毒培养物，冻融1次或置冰浴中用超声波(40μA/min)处理，2000r/min离心20min,分装小瓶，每瓶2ml…置-70℃保存备用。将各型病毒在96孔板上作10°~10-“稀释，每个稀释度作8孔，每孔病毒悬液为50μL,加入细胞4悬液100gl.(3×10°个/mL),加入细胞维持液50μL,每块板设8孔细胞对照。置5%二氧化碳培养箱于37℃培养，从24h～168h逐目观察CPE。按Karber方法计算出各型病毒的细胞半数感染量6.2.2.3中和测定6.2.2.3.1细胞对照：设4孔正常维胞对照，每孔加细胞悬液100gL(3×10°个/mL)、细胞维持液6.2.2.3.2阴性对照；设4孔阴性对照，每孔加阴性血清和100TCID=/50pL病毒悬液各50pL,再加入组胞悬液100gL(3×10°个细胞/mL)。6.2.2.3.3病毒回归对照：将被鉴定病毒稀释成1000、100、10、1、0.1TCIDm/50gL.每个籍释度作4孔，每孔加入病毒悬液50pl.,再加入细胞悬液100pL(3×10°个细胞/mL),补充细胞维持液50pl.。6.2.2.3.4中和：用100TCID₂/50pL鹿流行性出血病病毒分离毒株分别与不同血清型(EHDV1型~EHDV8型)的鹿流行性出血病标准阳性血清(效价不低于1:32)作微量中和试验。试验在96孔组织培养板上进行，阳性血清、阴性血清经56℃30min灭能。各型阳性血清作1:10稀释。每个血清型作4孔，每孔加1:10稀释的阳性血清50μL和100TCID/50pL病毒各50pL,振荡3min~5min,置37℃中和1h,加入细胞悬液100μL(3×10°个细胞/mL),置37℃二氧化碳培养箱培养。6.2.2.4结果判定当病毒对照在100TCID=/50gL~300TCID/50μL出现CPE,阴性、正常细胞对照成立时，才能进行判定。判定时间从24h~168h。经1:10稀释的鹿流行性出血病某型标准阳性血清能与病毒中和，使50%以上的细胞不出现CPE者判为阳性.即为所鉴定病毒的血清型。7反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)7.1试剂和材料根据NS1蛋白编码基因M6保守序列设计，其引物序列如下：引物B;5'-TCATCTACTGCATCTGGCTG-3';扩增产物为388bp引物D:5°-GTCATCTAGCACGATGCGTG-3”;扩增产物为225bp7.1.2反转录试剂Trizol,AMV-RT(13U/gL),dNTPs(10mmol/L),RNasin(40U/yL),TagDNA酶(5/U/RT-PCR和PCR缓冲液，氯化镁(MgCl₂,25mmol/L),电泳缓冲液(TBE,配制见附录C),溴化乙锭溶液(10mg/mL,配制见附录C),DEPC水(配制见附录C),琼脂糖，DNA分子量标准，随机引物7.1.3样品的采集与前处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应藏一次性手套。57.1.3.2取样工具棉拭子、剪刀、镊子、研钵、离心管(Eppendorf管)。所有取样工具应经1.01×10°Pa.15min高压灭菌并燃干。7.1.3.3采样方法7.1.3.3.1组织样品用无菌的剪刀剪取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10mLPBS混均，或置于组织均浆器中，加入10mL.PBS均浆，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中3000r/min离心10min,取上清液转入另一无菌Eppendorf管中，编号备用。7.1.3.3.2血液样品采血时用无菌注射器采取血样至无菌Eppendorf管中，编号备用。样品处理时，1000r/min离心10min.吸弃血浆，用灭菌PBS溶液轻轻地将离心管底部红细胞重新悬浮。红细胞悬浮液于1000r/min离心10min.吸弃上清液。用灭菌DEPC水轻轻地将Eppendorf管底部红细胞重新悬浮。每管待检红细胞样品加入750pL.Trizol放置在振荡器上涡旋裂解红细胞。涡旋裂解好后，于一70℃冻存备用。7.1.3.4样品存放与运送采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存不超过24h;若需长期保存，应放置—70℃冰箱·但应避免反复冻融(最多冻融3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。高速冷冻离心机、PCR仪、凝胶电沐仪，凝腔成像系统。7.3操作方法7.3.1对照样品制备阳性对照：接种EHDV病毒的细胞培养物。阴性对照：正常BHK-21或未感染动物的红细胞。7.3.2RNA的提取7.3.2.1在样品处理区进行《除本标准规定的方法外，也可采用其他等效的RNA提取方法，具体操作见有关试剂说明书》。所有RNA提取器皿用DEPC水浸泡24h,灭菌后方可使用。7.3.2.2取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数，一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每管进行编号标记。7.3.2.3每管加入750μL.Trizol,然后分别加入待检样品、阳性对照和阴性对照各250pL,混匀，静置5mins再加入200pl.三氯甲烷，混均，静置5min,于4℃条件下，12000r/min离心15min。7.3.2.4取相同数量的1.5ml.灭菌Eppendorf管，加入500pl.异丙醇(-20℃预冷),对各个管进行对应编号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的新管中，上清液约吸取500μL(注意不要吸出中间白色解状层》,轻轻颠倒均匀。7.3.2.5于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出Eppendorf管，轻轻倒去上清液，加入1mL.8.1.2标准阳性血清：EHD阳性血清。8.1.3阴性血清：不含EHD抗体的动物血清。8.1.4试剂；琼脂糖，氯化钠《8.2仪器和设备8.2.2设备：打孔器、微量移波器。8.3操作步骤8.3.1琼脂凝胶平板的制备称取琼脂糖0.9g.氯化钠0.85g.加入到100mL蒸馏水，经加热煮沸溶解后，冷却至45℃,加入0.01%叠氮钠。每个平皿加融化琼脂，使琼脂板厚度约为2.8mm,待凝固后置冰箱片刻。中间1孔，周围6孔为一组.每个平Ⅲ打4组～6组。孔径5mm,孔距3mm。用酒精灯烘烤平皿底部，使琼脂板底部微融，静置冷却。按照图1.中心孔加抗原，1、3、5孔加标准阳性血清；2、4、6孔加被检血清。每个平皿设1组对照，即1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔加阴性血清。加样后静置10min,移入湿盒内于室温(22℃~25℃)反应。每次试验应设阳性对照和弱阳性对照(将标准阳性血清作1:4、1:8稀释)。24h初判-48h终判。当阳性对照、阴性对照成立时，进行判定。阳性：被检血清孔与抗原孔之间出现致密的沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端互相连接者。弱阳性：标准阳性血清孔和抗原孔之间的沉淀线向被检血清孔内侧弯曲。疑似：标准阳性血清孔与抗原孔之间出现的沉淀线末端向受检血清孔内侧偏弯或微弯者。阴性：抗原孔与被检血清孔之间不出现沉淀线或标准阳性血清与抗原孔间的沉淀线向吡邻的被检血清孔直伸或向其外侧偏弯者。非特异性沉淀线：当抗原和被检血清孔之间出现的沉淀线与标准阳性血清的沉淀线交叉，为非特异性反应，应判为阴性。第一次检查为阳性或弱阳性或疑似或非特异性沉淀线的样品，应重复试验。9(资料性附录)A.1鹿流行性出血病(epizoutichacmorrhagiediseaseofdeer.EHD)鹿流行性出血病是由EHDV引起的以粘膜和浆膜出血、体温升高、昏迷和休克为特征的传染病。EHDV属呼肠孤病毒科，环状病毒属。该病毒对乙醚和去氧胆酸盐有抵抗力。在pH6.8～9.5稳定，pH4,0以下迅速灭活。不耐热，56℃4h~5h灭活。在BHK-21细胞培养物中，37℃下经4d~5d,病毒液的TCID下降1个～3.5个滴度。因此，应在5d内进行细胞传代培养。1mol/L的氯化镁有提高病毒稳定性的作用。在一70℃、4℃和20℃稳定，可长期保存活力，在-20℃较快灭活，放置1个月后，病毒效价明显下降，但随后趋向稳定，病毒效价的下降变慢。鹿流行性出血病病毒可在鹿胎肾细胞中繁殖·使感染细胞变圆和成团块，也可在BHK-21,Vero,Hela细胞内增殖，并产生细胞病变和蚀斑。但BHK-21细胞比Vero细胞敏感，鹿流行性出血病病毒现有8个血清型。在补体结合试验和琼脂扩散试验中，与蓝舌病病毒有交叉反应。A.3流行病学本病主要发生在北美、澳大利重、亚洲和非洲。库螺可以带毒，并传播本病，可大范围感染野生和家养偶路动物；主要发生于鹿，鹿的易感性有差异。黑尾鹿、糜、羚羊体内曾分离到EHDV,这些动物人工感染后不发病，但可出现短暂的低滴度病毒血症，血清抗体阳性。有些种类的鹿特别是美国的白尾鹿很易感，将病毒材料给白尾鹿作肌肉或静脉内接种，可于5d~6d内死亡。死亡率可达90%以上。在易感鹿中，不同年龄和性别都可感染发病，发病率为60%。吸食含病毒血液能使库螺发生感染，病毒能在库蝶体内大量增殖。感染EHDV白尾鹿的带毒期只有16d.绵羊和牛分别为28d和50d。本病的主要风险在于危害家畜健康，并存潜在的贸易风险。A.4临床症状自然暴发的病例很少观察到临诊症状，人工感染的潜伏期为5d~10d。感染后所呈现的临诊症状与鹿感染蓝舌病相似。其特点为突然发病，食欲消失，对人恐惧，有时流涎·心跳加快，呼吸急促而困难。病鹿哀弱，最后昏迷。可视粘膜出血。眼结膜和口粘膜暗红或紫蓝，有“蓝舌”样。粪和尿带血，有时唾液也带血。体温呈复相升高，一次见于病初，另一次则在死前病毒血症的高潮期，常可达40.5℃~41.5℃。一般在出现症状后8h~36h剧烈休克而死亡。A.5病理变化死于本病的鹿具有广泛的出血病变，几乎没有一个组织器官没有出血斑点，最常见于肝、脾、肾、肺和消化道。浆膜囊内有液体贮积，腹膜水肿。严重出血是由于血液中凝血酶原的缺乏和血管壁的变性所致。最急性病例肉眼可见的病变不多，急性者常见出血和水肿，也有部分慢性病例出现胃炎和蹄叶炎。A.6检疫及诊断根据白尾鹿出现体温升高、食欲消失，流涎，心跳加快，呼吸急促、衰弱、昏迷、粘膜出血症状，处于库蝶活动季节，死后剖检见各组织和脏器中都有明显出血，浆膜囊内有液体贮积，腹膜水肿，可作出初步诊断。进一步确诊应依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有琼脂免疫扩散试验(AGID)、中和试验(SN)、病毒分离与鉴定(VI)、酶联免疫吸附试验(ELISA),空班抑制定型试验和RT-在检疫中，一且发现本病，阳性动物作扑杀，销毁或退回处理；同群动物继续隔离检疫。199培养基，加入含10%无EHD病毒抗体胎牛血清(56℃,30min灭能),含青霉素2001U/mL,链霉素2001U/mL,抽滤除菌，置4℃保存备用。199培养基，加入含2%无EHD病毒抗体胎牛血清(56℃,30min灭能),含青霉素200IU/mL,链霉素200IU/mL,抽滤除菌，置4℃保存备用。无钙镁PBS(pH7.4)B.4磷酸盐缓冲渡(PBS,0,01noi/b液将上述成分依次溶解、混匀、分装，高压灭菌(1.01×10°Pa,15min)。B.6碳酸缓冲甘油a)0.5mol/L,pH9.5碳酸缓冲液碳酸氢钠3.7p碳酸钠(无水)0.6g1份碳酸缓冲液加9份甘油混合即成。(规范性附录)RT-PCR试剂配制C.1