食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法

食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法本标准规定了食品、化牧品和饲料中牛、羊(绵羊和山羊》、猪源性成分实时PCR检测方法。本标准适用于食品、化救品和饲料中牛、羊(绵羊和山羊》、猪源性成分的鉴别检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—1992,neqISO3696:1987)GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义、缩略语下列术语和定义，缩略语适用于本标准。3.1术语和定义牛源性成分bavine-derived牛种属特异性DNA片段。羊源性成分wine-derivedmaterials羊种属特异性DNA片段。猪源性成分porelne-deriselmaterlals猪种属特异性DNA片段。实时荧光PCRreal-timefluoresentPCR实时荧光聚合酶链式反应。每个反应管内的荧光信号达到设定的阀值时所经历的循环数。脱氧核糖核酸。PCRpolymerasechainre聚合酶链式反应。2水生栖热菌。6-羧基荧光素，6-羧基-X-罗丹明。HEX5-hexachloro-fluorescein6-羧基-2”,4,4',5°,7,7'六氯荧光素。细胞色素C氧化酶亚单位I。本标准采用TanMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA(COX1)基因上动物种间多态性的差异而进行动物源性种类鉴定。本标准应用多色荧光检测技术，采用多重PCR方法。牛、羊，猪源性成分单体系检测时，对反应液中含有的两种不同荧光染料进行双通道同步检测，在同一反应管内对牛或羊或猪的COX1基因及内参照反应同时进行扩增，并通过标记两种不同荧光物质(FAM、HEX)的特异性探针进行特异性杂交，两色荧光同步检测：牛羊源性成分混合体系检测时，对反应液中含有的三种不同荧光染料进行三通道同步检测，在同一反应管内分别对牛、羊特异的COXI基因及内参照(InternalControl)同时进行扩增，并通过标记三种不同荧光物质(FAM、HEX、ROX)的特异性探针进行特异性杂交，多色荧光同步检测。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。5材料与试剂5.1设备和材料5.1.1实时荧光PCR检测系统。5.1.2高速台式冷冻离心机(最高转速12000r/min以上)。5.1.3台式离心机(最高转速2000r/min)5.1.4振荡器。5.1.5冰箱(2℃~8℃和-20℃或-80℃)。5.1.6微量可调移液器及配套吸头(10μL、100gL.、1000μl)。5.1.7实时荧光PCR反应管。5.1.9水浴槽。5.1.10加热器。5.1.11可移动紫外灯。5.1.12磁力架。除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.2.1基因组DNA提取试剂盒”,组成，功能及使用注意事项参见附录A。5.2.2牛源性成分实时荧光PCR检测试剂盒”:组成、功能及使用注意事项参见附录B。5.2.3羊源性成分实时荧光PCR检测试剂盒”;组成，功能及使用注意事项参见附录C。5.2.4猪源性成分实时荧光PCR检测试剂盒”;组成，功能及使用注意事项参见附录D。5.2.5牛羊源性成分实时荧光PCR检测试剂盒”;组成、功能及使用注意事项参见附录E。6.1采样工具下列采样工具应经180℃±2℃,2h高温灭菌：剪刀、镊子、扦子。6.2样品采集待检样品装人一次性塑料装或其他灭菌容器，编号，送实验室。6.3样品储运样品采集后，将采集的样品放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放入一个塑料袋),于保温箱中加冰、密封，送实验室。7操作方法7.1实验室的设备和管理实验室的设备与管理见附录F。7.2样品模板DNA的制备7.2.1在样本制备区进行。组成，功能及使用注意事项参见附录A。7.2.2固态食品和饲料中基因组DNA的提取试剂盒参见附录A中的第A.1章固态食品和饲料中基因组DNA提取试剂盒处理样品。7.2.3液态食品和化妆品中基因组DNA的提取试剂盒参见附录A中的第A.2章液态食品和化妆品中基因组DNA提取试剂盒处理样品。模板DNA溶液放于冰上保存备用。若长期保存须存放于-20℃或-80℃冰箱。7.3.1扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。为确保检测结果的准确性，在进行实际样品检测时，应设立空白对照、阴性对照和阳性对照实验。实时荧光PCR反应体系见表1。从牛、羊、猪、牛羊源性成分实时荧光PCR检测试剂盒(分别参见附录B,C、D,E)中取出相应的实时荧光PCR反应用试剂，融化后，2000r/min离心5s。向每个实时荧光PCR反应管中各分装24pl.反应混合液(除模板DNA外》,转移至上样区。注1:空白对照实验时，用ddH₂O替代样品DNA。注3:阳性对照实验时.用相应的牛或羊或猪或牛羊混合DNA替代号是舌检出(如果检测样品浓度高会抑制内参照DNA的扩增光检出，且C值小于等于35,判定为含有牛，羊，猪源性成分：如+一 PCR反应失败。注意以下方面后再次进行反a)如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则可能是样品DN题，如样品中可能存在PCR反应的抑制物等；光信号是否检出(如果检测样品浓度高会抑FAM荧光检出，且Ct值小于等于35,判定为含成分+ROX英光检出，且Ct值小于等于35,判定为干35,可视为不含有羊源性成分。无FA成分+FAM和ROX荧光同时检出，且Ct值小于等于分又含有羊源性成分；如果FAM通道Cr值大于35,可视为+如果同时进行的阳性对照实验结果正常，检测实际样品时检出，无FAM荧光检出，判定为不含有牛源性成分；无ROX荧a)如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则可能是样问题，如样品中可能存在PCR反应的押制物在上述条件下，本方法的测定低限为0.1%。收集管(2ml,)弃去上层有机相，再加入1mL的4℃预冷的溶液C,充分混匀后，12000r/min离心1min。弃去上层有机相，然后将水相溶液(无色下层)移入置于收集管上的滤杯中，12000r/min离弃滤杯，在滤液中加入400pL的DB缓冲液，混合均匀。将试剂盒中的离心柱子安置于收集管上。将A,1,4.8混合溶液转移至离心柱子中，12000r/min离心1min,弃滤将500μl.的清洗液A加入至离心柱子中，12000r/min离心30s,弃滤液。将700μl.的清洗液B沿离心柱子管璧四周加入，12000r/min离心30s,弃滤液。重复操作步骤A,1,4,11。将离心柱子安置于新的1.5ml.的离心管上，在离心柱子膜的中央处加入50pL.～200pL的65℃灭菌蒸馏水或65℃洗脱液，室温静置1min。A.1,4.1412000r/min离心1min,洗脱DNA。此即为模板DNA溶液。模板DNA溶液放于冰上保存备用。若长期保存应存放于-20℃或-80℃冰箱。A.1.5使用时的注意事项进行样品处理时必须避免交叉污染，使用液氮研磨样品时，应随时加入液氮，以确保提取的基因组DNA不被降解。在两相分离操作中，将水相溶液(无色下层)移入滤杯时，请务必除尽上层带色有机相，否则将阻碍DNA结合到DNA制备膜上。相间沉淀不必考虑，在过滤时将被去除。A.1.5.4部分试剂中含刺激性化合物，操作时请带上乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤和眼睛等，并应尽量在通风橱中进行。若沾染皮肤，眼睛时，要立即用大量清水冲洗，必要时应寻求医疗咨询。A.1.5.5基因组DNA需长期保存时，建议在洗脱液中保存。A.2液态食品和化妆品中基因组DNA提取试剂盒以香港基因品片开发有限公司的液态食品DNA提取试剂盒(货号E01-01-1115)为例。A.2.1试剂盒组成试剂盒组成见表A.3。A.2.2.1开始提取前，应37℃预热裂解缓冲液和冲洗缓冲液130min以使晶体溶解。再将其冷却至室温。A.2.2.2使用硅土和洗脱液之前，先将它们取出并升至室湿。A.2.2.3除非特别说明，所有操作均在室温进行。本试剂盒可用于从化妆品中提取基因组DNA。A.2.4提取步骤A.2.4.1取装有0.9mL.裂解缓冲液的离心管，10000r/min离心30s。A.2.4.3在振荡器上振荡硅土悬浮液，迅速向步骤A.2.4.2中的每一个装有裂解缓冲液的管中加入50gL硅土悬浮液。振荡，混合均匀。A.2,4.4将离心管在室温下放置10min(不需要再混合)。将所有的离心管5000r/min离心2min。A.2.4.5将离心管放到磁性表架上使硅土形成小球。小心移走上清(当吸上清时不要章走离心管，将其放在磁性表架上，以防搅动小球),向每一个离心管中加人400pl,冲洗缓冲液1。冲洗缓冲液2洗两次；用500pL冲洗缓冲液3洗一次。A.2.4.9向每个离心管中加入50μL洗脱缓冲液。A.2.4.10从架子上移走离心管，轻轻地敲打离心管直到小球完全重悬。A.2,4.11将硅土重悬的离心管在60℃放置5min,以洗脱核酸。A.2,4.13将提取的核酸上清移到一干净离心管中(确保硅土不被移走)。此即为模板DNA溶液。模板DNA溶液放于冰上保存备用。若长期保存应存放于—20℃或—80℃冰箱。实验过程中要带手套。(资料性附录)牛源性成分实时荧光PCR检测试剂盒的组成B.1试剂盒组成以宝生物工程(大连)有限公司的牛课性成分实时荧光PCR检测试剂盒(货号No.D318)为例。每个试剂盒可做50个反应(25yL/反应》,包括表B.1的成分；牛原性检测阳性模板(10ng/pL)B.2.1以上各组成于-20℃保存，B.2.22×牛源性检测预混液中含有反应所需dNTP混合液、缓冲液、酶等。B.2.3牛源性检测引物混合液中含有扩增牛基因组DNA及内参照的引物及内参照。B.2.4牛源性检测探针混合液中含有检测牛基因组DNA的探针及检测内参照的探针。探针混合液应避光保存。试剂盒可用于食品、化妆品和饲料中牛源性成分的鉴定。B.4使用时的注意事项B.4.1在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。B.4.2上机前检查各反应管中是否有气泡，反应管是否盖紧，以避免影响荧光信号的检出及荧光物质泄漏污染仪器。(资料性附录)革源性成分实时荧光PCR检测试剂盒的组成C.1试剂盒组成以宝生物工程(大连)有限公司的羊课性成分实时荧光PCR检测试剂盒(货号No.D319)为例。每个试剂盒可做50个反应(25yL/反应),包括表C.1的成分：羊源性检测阳性模板(10ng/yL)C.2.1以上各组成于—20℃保存。C.2.22×羊源性检测预混液中含有反应所需dNTP混合液、缓冲液、酶等。C.2.3羊源性检测引物混合液中含有扩增羊(包括绵羊和山羊)基因组DNA及内参照的引物及内参照。C.2.4羊源性检测探针混合液中含有检测羊(包括绵羊和山羊)基因组DNA用探针及检测内参照用探针。探针混合液应避光保存。试剂盒可用于食品，化救品和饲料中羊(包括绵羊和山羊》源性成分的鉴定。C.4使用时的注意事项C.4.1在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。C.4.