一种提高黄素氧化酶活力的方法

一种提高黄素氧化酶活力的方法专利名称：一种提高黄素氧化酶活力的方法技术领域：本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种利用血红蛋白VHb提高黄素氧化酶活力的方法。背景技术：在氧气缺乏的环境下，一种好氧细菌透明颤菌(P7/MMc!/"sp.)能够合成血红蛋白(版,函Hemoglobin,VHb)(Wakabayashi，S.，etal.Nature.1986,322,481-483;Dikshit，K.L.,etal.NucleicAcidsRes.1990，18,4149-4155)。VHb为同型二聚体,带有两个相对分子量为15,775的亚基，每个亚基含有146个氨基酸残基和两个b型血红素(Tarricone,C.,etal.Structure.1997,5,497-507)。完整的VHb是可溶性的，但是脱去血红素辅基便不可溶。VHb已在细菌，酵母，真菌和植物细胞中获得了成功表达，在低氧环境下能提高宿主细胞生长量(Kallio,RT.andBailey，J.E..Biotechnol.Prog.1996,12,31-39)，提高相应酶的表达量(Bhave,S.L.andChattoo,B.B..Biotechnol.Bioeng.2003,84，658-666)和有价值的中间代谢物的产量，在体内表达VHb有显著效果的例子有大肠杆菌中OC—淀粉酶活力提高了3.3倍(Khosravi，M.，etal..Plasmid.1990,24，190-194)，铁蛋白表达量提高了1.8倍(Chung,Y.J.,Kim，etal..Mol.Biol.1998,31,503-507);产黄顶头孢霉菌C4crewo"iww中头孢菌素C(CPC)产量提高3.2倍(Demodena,J.A.,etal.Bio-Technology.1993,11,926-929);促进了假单胞菌(/^Womo"wsp.)对有机污染物苯甲酸降解和伯克霍尔德菌(5wr編c/mVsp.)对2,4—二硝基甲苯降解(Kim，Y"etal..J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2005,32,148-154)。研究表明，当VHb在异源宿主中表达可以提高tRNAs和核糖体水平、细胞呼吸活力和ATP产量(Nilsson,M,etal.Biotechnol.Prog.1999，15,158-163;Roos，V"etaLBiotechnol.Prog.2002，18,652-656)，但是，人们还是没有完全搞清楚新陈代谢效果和血红蛋白VHb功能之间的联系。VHb具有一个高的氧结合和释放系数(Giangiacomo，L.，etal..Biochemistry.2001,40,9311-9316),高氧结合系数反映了VHb有较高的氧结合能力，但是更高的氧释放系数表明VHb能够更迅速释放氧(Webster,D.A..Structureandfunctionofbacterialhemoglobinandrelatedproteins.InEichorn，G.C.andMarzilli，L.G.(eds.)，Advancesininorganicbiochemistry,NewYork,Elsevier,1987,.pp.245-265)。VHb与红酵母D-氨基酸氧化酶(DAO)融合后在大肠杆菌中获得成功表达，得到的融合蛋白VHb-DAO转化CPC的催化效率提高了i2.5倍，稳定性提高约3倍(Khang，Y.H.,etal.Biotechnol.Bioeng.2003，82,480-488)。Khang等提出，由于VHb中潜在位点与DAO中FAD结合域存在较强的相互作用，使得VHb同时起到了一个氧供体和氧受体作用。由于DAO是一种黄素氧化酶，其以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅因子，而VHb与红酵母DAO融合后能够提高CPC的氧化效率，因此我们推测VHb在反应体系中起到氧载体作用，因为DAO催化过程中需要氧气，所以VHb的存在增强了DAO的催化效率。发明内容为了验证上述推测，本申请的发明人分别以游离的和固定化的透明颤菌血红蛋白(VHb)对三种黄素氧化酶——三角酵母D—氨基酸氧化酶(DAO)、葡萄糖氧化酶(GOD)和醇氧化酶(AOD)的催化活性的影响进行了研究。研究结果表明，不管是游离的还是固定化的VHb,对于黄素氧化酶的催化活性都有明显的增效作用。因此，本发明的首要目的就在于提供一种提高黄素氧化酶催化活性的方法。本发明的另一目的在于提供一种VHb用于促进黄素氧化酶催化活性的应用。本发明的提高黄素氧化酶催化活性的方法包括将VHb作为助催化剂用于黄素氧化酶的催化反应体系，所述VHb可以是游离的形式，也可以是固定化酶的形式。实验表明，本发明的使用VHb作为助催化剂的方法，可以显著提高黄素氧化酶的催化氧化的能力；而且，相比现有技术报道的融合蛋白的形式，本发明的方法可以在催化氧化过程中，通过外源添加的方式补充VHb，因此，在实际应用中更有优势。图1为用于在重组大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组血红蛋白VHb的重组表达质粒pHVHB的构建流程图。图2为样品不同纯化阶段的SDS(15%)电泳图，凝胶用考马斯亮兰染色，其中1和6为Marker,2为重组菌株BL21(DE3)/pLHB-3的粗提物，3为使用含有500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱的HDAO，其分子量为41.4kDa，4为重组菌株BL21(DE3)/pHVHB的粗提物，5为使用含有500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱的HVHb,其分子量为17.9kDa。图3显示了固定化VHb对固定化HDAO酶活性的影响。图4显示了游离VHb对固定化HDAO酶活性的影响。图5显示了游离VHb对固定化GOD和固定化AOD酶活性的影响。图6显示了固定化VHb对固定化GOD和固定化AOD酶活性的影响。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。根据本发明，HDAO为带有组氨酸纯化标签的D—氨基酸氧化酶(DAO)，HVHB为带有组氨酸标签的透明颤菌血红蛋白(VHb)。本发明中，VHb的基因表示为vg6或者Z/v/^或者v/^;DAO的基因表示为kfao;融合蛋白HVDAO的基因表示为Zvctoo。以下实施例中，除特别说明外，DNA片段连接、质粒的制备、化学转化导入宿主菌、克隆等操作均参照《分子克隆》(Sambrook，J.，Fritsch，E.R,Maniatis，T.(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual3rded，，'ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。以下对实施例中所用的实验材料及其来源作说明亲和纯化树脂SepabeadsFP-IDA-N产购自ResindionR.S丄公司；固定化载体为环氧型载体，其中SepabeadsEXE16，SepabeadsEc-Ep购于ResindionR.S丄公司)；EupergitC禾卩EupergitCM购于Degussa公司；Amberzymeoxiraneresin购于Rohm&Haas公司。限制性内切酶和T4DNA连接酶购于Takara公司。醇氧化酶(AOD)购于Sigma公司；葡萄糖氧化酶(GOD)购自TOYOBO公司，其他化学试剂都为分析纯。质粒pET-28b(+):Novagen公司产品，大小为5.3kb，含有组氨酸纯化标签以及卡那霉素抗性基因，启动子是T7/flc，并具有多个限制性酶切位点。LB培养基、TB培养基中酵母膏，蛋白胨购于OXOID公司。大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)购于Novagen公司。实施例1、重组质粒pHVHB的构建构建重组质粒pHVHB的过程如图l所示，具体如下首先设计如下扩增引物VHBF2(上游)5'-GGAATTCCATATGTTAGACCAGCAAACC-3';和VHBR2(下游)5，-CCCAAGCTTTTATTCAACCGCTTGAGCGTA-3，以pUC-6S-VHb(CGMCC1.6352)为模板，采用p/w酶(Sangon公司)扩增Genbank序列号为X13516的vA6基因片段。PCR反应条件为:94°C，30Sec，55。C，30Sec，72°C，30Sec，30个循环。使用上海华舜生物工程公司试剂盒，割胶回收PCR产物。PCR回收产物用M/eI和///"dlll双酶切，割胶回收约450bp的DNA片段，与经相同酶切的载体pET-28b(Novagen公司产品，大小为5.3kb，含有组氨酸纯化标签以及卡那霉素抗性基因，启动子是T7/"c，并具有多个限制性酶切位点)载体在T4DNA连接酶作用下连接，连接条件为16'C连接4h;外源DNA与载体的摩尔比例是3:1。连接产物用化学转化方法转化至感受态细胞DH5a以扩增重组质粒，然后参考《分子克隆》以碱裂解法抽提质粒。得到的重组表达质粒命名为pHVHB,该质粒大小约为5.8kb，含有组氨酸纯化标签以及卡那霉素抗性基因，启动子是T7toc，并具有多个限制性酶切位点。重组表达质粒pHVHB经测序验证为正确。实施例2、重组质粒pHVHB转化大肠杆菌BL21(DE3)将重组表达质粒pHVHB用化学转化法(CaCb法)转化至大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)，转化产物涂布在含有50pg/m卡那霉素的LB平板上，能在含卡那霉素的平板上生长的即为转化子，获得的转化子命名为BL21(DE3)/pHVHB。实施例3、VHb的制备3.1、BL21(DE3)/pHVHB的发酵取实施例2得到的转化有重组表达质粒pHVHB的转化子BL21(DE3)/pHVHB，接种到含有50tig/ml卡那霉素的LB培养基中，37'C培养至对数生长期。然后按照5%接种量将种子液接入装有3LTB培养基的5L发酵罐中，在37。C，400rpm，1.3vvm的条件下培养至OD,达到1.0。调节温度至3(TC，加入乳糖使其终浓度为1.5%，继续培养约20h。发酵完毕后，发酵液在5000rpm下离心10min，菌体在一20'C下保存。3.2、VHb的分离纯化所有蛋白质纯化操作主要在4°C进行。3.2.1、菌体处理取冻融的菌体，按照每克菌体加入2ml裂解缓冲液(O.IM磷酸钠，5%甘油，pH8.0)的比例，用裂解缓冲液重悬菌体，并用压榨机在2000P.S.I的操作压力下破碎细胞，工作3个循环。破碎后的菌液在4。C，12000rpm离心lh，回收上清液。3.2.2、蛋白质柱分离称取经预处理的树脂FP-IDA-Np+装柱，柱的尺寸是2cmx50cm，装柱的树脂约为20ml。将上述步骤3.2.1获得的上清液上柱，上柱速度为1.0柱体积/小时(1BV/h)。使用WashingBuffer(100mM7Hs-Cl，50mM咪啤，250mMNaC1,5%甘油，速度1.0BV/h)洗去杂蛋白。过程中测定过氧化氢酶(上清液中所含杂蛋白)，当过氧化氢酶活力为零时，结束Washing阶段。然后使用ElutionBuffer(100mMJHy-Cl，500mM咪唑，250mMNaC，5%甘油，速度1.0BV/h)洗脱目的蛋白。3.2.3、电泳分析分别取步骤3.2.1离心获得的上清液(粗酶液)和步骤3.2.2柱分离获得的纯化的蛋白样品，使用15%SDS进行检测，结果如图2所示。由图2的结果可见，利用树脂FP-IDA-N产一步法纯化，可以得到纯化的重组血红蛋白HVHb。HVHb成熟蛋白的氮基酸残基数是166aa，理论分子量推算出来应该是17.9kDa;从SDS结果可见，目的蛋白的分子量大致在14和21kDa的中间位置，与理论推算值相符。实施例4、D—氨基酸氧化酶(DAO)的制备4.1、DAO表达质粒转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)本实施例中所使用的质粒pLHB-3按照刘洪波等(刘洪波等，生物工程学报，1999，15(3):337-342)的方法构建，大小为6.4kb，含有带组氨酸纯化标签的DAO基因(HDAO基因)以及卡那霉素抗性基因，启动子是T7/ac。以DAO的表达质粒pLHB-3转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)(Novagen公司)，转化产物涂布在含有50pg/ml卡那霉素的LB平板上，能在含卡那霉素的平板上生长的即为转化子，获得的转化子命名为BL21(DE3)/pLHB-3。4.2、重组菌株发酵获得DAO取4.1得到的重组菌株BL21(DE3)/pLHB-3，接种到含有50吗/ml卡那霉素的LB培养基中，37"培养至对数生长期。然后按照5%接种量将种子液接入装有3LTB培养基的5L发酵罐中，在37。C，400ipm，1.3vvm的条件下培养至OD,达到1.0。调节温度至30。C,加入乳糖使其终浓度为1.5%，继续培养约20h。发酵完毕后，发酵液在5000rpm下离心10min，菌体在-20。C下保存。4.3、DAO的分离纯化4.3.1、菌体处理取冻融的菌体，按照每克菌体加入2ml裂解缓冲液(O.IM磷酸钠，5%甘油，pH8.0)的比例，用裂解缓冲液重悬菌体，并用压榨机在2000RS.1的操作压力下破碎细胞，工作3个循环。破碎后的菌液在4'C，12000rpm离心lh，回收上清液。4.3.2、蛋白质柱分离称取预处理过的树脂FP-IDA-N产装柱，柱的尺寸是2cmx50cm，装柱的载体约为20ml。样品上柱速度是1.0柱体积/小时(lBV/h)。使用WashingBuffer(100mM7Hy-Cl,50mM咪唑，250mMNaCl，5%甘油，速度1.0BV/h)去除杂蛋白。过程中测定过氧化氢酶，当过氧化氢酶活力为零时，结束Washing阶段。然后使用ElutionBuffer(100mM7h>Cl,500mM咪唑，250mMNaCl，5%甘油，速度1.0BV/h)，洗脱目的蛋白。4.3.3、电泳分析分别取步骤4.3.1获得的上清液(粗酶液)和步骤4.3.2柱分离获得的纯化的蛋白样品，使用15%SDS进行检测，结果如图2所示。HDAO成熟蛋白的氨基酸残基数是376aa，理论分子量推算出来应该是41.4KDa。由图2的结果可见，目的蛋白的分子量略小于43Kda，与理论推算值相符。实施例5、固定化酶的制备5.1、固定化VHb的制备选用Amberzymeoxiraneresin载体，VHb溶液的浓度为6.8mg/ml，按照每120mg蛋白使用lg载体的比例将载体投入VHb纯酶液中，再加入两倍体积的1.25M、pH8.0的磷酸钾缓冲液，在15。C，100rpm下振荡20h。然后用20ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.0)冲洗干净，并借助真空泵抽干水分，获得固定化VHb。5.2、固定化HDAO的制备选取5种环氧型载体SepabeadsEXE16，SepabeadsEc-Ep，EupergitC，EupergitCM和Amberzymeoxiraneresin，按照每300mg蛋白使用lg载体的比例，分别投入HDAO(6.3mg/ml)的纯酶液中，处理方法与以上5.1的VHb相同，获得固定化HDAO。5.3、固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和醇氧化酶(AOD)的制备选用Amberzymeoxiraneresin,GOD和AOD溶液的浓度均为2mg/ml。按照每20mg蛋白使用lg载体的比例将载体投入各纯酶液中，处理方法与与以上5.1的VHb相同，获得固定化GOD和AOD。实施例6、VHb对于黄素氧化酶催化活性的影响6.1、VHb对固定化HDAO活力影响首先对DAO催化反应系统进行说明，反应器容积约50ml，自身有恒温装置，顶端安装有一个搅拌桨，底部有砂芯漏斗，外接一个进气管。分别取固定化的和游离的VHb作为助催化剂逐渐加入固定化DAO的催化反应体系中，从酶反应器底部通入空气(30ml/min)，分别在2min和10min时取样测定固定化DAO的活力。具体测定方法如下取0.3克固定化DAO，加入15ml4%CPC溶液(用pH7.5，0.1M磷酸钠缓冲液配制，用3mol/L氨水调节pH7.25)，循环水浴保温2(TC，400rpm搅拌，通入空气30ml/min，转化过程中用3mol/L氨水维持pH7.25。分别在2min和lOmin时用微量进样器取出20^反应的样品，加入20nl酸终止液，再加入960^U重蒸水，12000rpm离心5min，上清进行HPLC测定，HPLC的具体条件如下流动相乙腈甲醇1.29%(v/v)乙酸=7.5:15:77.5;流速lml/min;波长260nm;柱子AZORBAXEclipseXDB-C8(4.6X150nm，Agilent,USA)。酶活力定义1个单位(U)DAO酶活力定义为每分钟产生的酮酸和GL-7-ACA微摩尔数之和所需要的酶量。添加固定化VHb的固定化HDAO的活力测定结果如图3所示，当固定化VHb加入质量为50mg时，此时固定化HDAO活力是对照(未添加VHb)的1.7倍，当固定化VHb质量增加至300mg时，固定化HDAO活力是对照的2倍。添加游离VHb的HDAO的活力测定结果如图4所示，当添加游离VHb的质量从0.05增加至l.Omg时，固定化HDAO活力持续增加，当加入l.Omg游离VHb后，HDAO固定化酶活力与对照(未添加VHb)相比增加了3倍。可见，不管是游离的还是固定化的VHb，作为助催化剂都可以明显提高DAO的催化氧化活性。6.2、VHb对固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和醇氧化酶(AOD)活力影响首先对固定化GOD和固定化AOD催化反应系统进行说明反应器容积约50ml，自身有恒温装置，顶端安装有一个搅拌桨，底部有砂芯漏斗，外接一个进气管。分别取游离的和固定化的VHb作为助催化剂逐渐加入固定化GOD和固定化AOD的催化反应体系中，从反应器底部通入氮气(2ml/min)，反应10min取样测定固定化GOD和固定化AOD活力。具体测定方法如下固定化GOD活力测定取5ml溶液A(将3.5mg辣根过氧化物酶与3.5mg4-氨基安替吡啉溶于20ml的0.2M，pH7.0磷酸钠缓冲液中，加入3%苯酚溶液lml)与5ml溶液B(0.36mol/L葡萄糖溶液)混匀，在2(TC保温5min，加入固定化GOD，反应10min后取样测定OD5(M)nm变化值。酶活力定义1个单位(U)GOD活力定义为每分钟消耗1微摩尔葡萄糖所需要的酶固定化AOD活力测定取5ml溶液A(将3.5mg辣根过氧化物酶与3.5mg4-氨基安替吡啉溶于20ml的0.2M,pH7.0磷酸钠缓冲液中，加入3%苯酚溶液lml)与5ml溶液B(0.2moI/L甲醇溶液)混匀，在2(TC保温5min,加入固定化AOD，反应10min后取样测定OD鄉細变化值。酶活力定义1个单位(U)AOD活力定义为每分钟消耗1微摩尔甲醇所需要的酶量。如图5所示为添加游离VHb的GOD和AOD的活力测定结果，可见对于固定化GOD,当加入0.5mg和l.Omg游离VHb后，GOD固定化酶活力分别是对照(未添加VHb)酶活力的1.4倍和1.6倍。同样对于固定化AOD，当加入VHb后，酶活力分别提高了L2倍和4倍。如图6所示为添加固定化VHb的GOD和AOD的活力测定结果，可见在反应体系中加入50mg和lOOmg固定化VHb，对于固定化GOD和AOD活力均有提高，当加入lOOmg固定化VHb后，固定化GOD和AOD活力分别提高了0.8禾H1.5倍。虽然以上仅以固定化的D—氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶和醇氧化酶为材料，构建出VHb和三角酵母DAO结合在一起所形成的融合蛋白HVDAO，并且将它们用于头孢菌素C氧化的反应体系，借以对本发明的技术方案进行了验证，但是根据本发明的公开，将VHb用于提高其他种类黄素氧化酶的活力，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，将VHb