临床检验基础实验指导

实验一

血液一般检验（一）GeneralExaminationofBlood

【内容】

1、皮肤采血法（毛细血管采血法）

2、血红蛋白（微量）吸管

3、静脉采血法

4、血红蛋白测定

5、红细胞计数

6、细胞计数池的正、侧面观察

7、正常及异常红细胞形态（示教）

【目的要求】

1、掌握红细胞直接计数，血红蛋白测定的标本送检要求、原理、操作方法、参考值

及临床意义。

2、掌握皮肤采血法（毛细血管采血法）及血红蛋白（微量）吸管的使用方法。

3、熟悉静脉采血（collectionofvenousblood）的方法和无菌操作技术。

4、熟悉细胞计数池的结构及应用范围。

【器材】

721-型分光光度计，血细胞计数板，血红蛋白吸管，75%酒精棉球及干棉球，三

棱针，玻棒及试管，显微镜。

【试剂】

1、HicN试剂的配制

氟化钾50mg

高铁氟化钾200mg

无水磷酸二氢钾140mg

TritonX-1001.0ml

蒸储水加至1000ml,纠正pH至7.0-7.4。

此液为淡黄色透明溶液，贮存在棕色有塞玻璃瓶中，放4°C冰箱保存，一般可用

数月。

2、赫姆（Hayem）液:

氯化钠1.Og

结晶硫酸钠（Na2S04•10HO5.0g（或无水硫酸钠2.5g）

氯化高汞0.5g

蒸僧水加至200ml

溶解后加20g/L伊红水溶液1滴，过滤后用。

【实验】

一、皮肤采血法（毛细血管采血法）

【器材】

1、三棱针，预先高压消毒，每人每次采血更换1次性采血针以避免交叉感染。

2、消毒干棉球。

3、75%乙醇棉球

4、20ul吸管

【操作方法】

1、采血部位以左手无名指为宜。

2、轻轻按摩采血部位，使其自然充血，用75%乙醇棉球消毒局部皮肤，待干。

3、紧捏刺血部位，用无菌刺血针迅速刺入皮肤约2—3mm,让血液自然流出，如

血液不流出可在其周围轻轻加压，但不要过重。

4、用干棉球擦去第一滴血、按需要依次采血。

5、采血完毕，用干棉球压住伤口，止血片刻。

6、血红蛋白吸管的使用：在采血前首先练习一下吸管使用，使其达到得心应手。

二、血红蛋白（微量）吸管的使用

【原理】挤压乳胶吸头，使刻度微量吸管内产生负压而吸取液体。

【器材】

1.微量吸管、乳胶吸头、干脱脂棉。

2.试管、试管架。

3.2ml吸管、吸耳球。

【试剂】

1.洗涤液3管（蒸储水、95%乙醇、乙醛）。

2.生理盐水。

【操作方法】

1.准备吸管及试管将乳胶吸头套在微量吸管上，注意两者连接处应严密不漏气。

试管上应贴上患者姓名或门诊/住院号标签。

2.加稀释液取试管1支，加生理盐水2ml。

3.持管吸血右手拇指和中指夹住吸管与吸头交接处，示指盖住吸头小孔。三指轻

微用力，排出适量的气体使管内形成负压。将管尖插入抗凝血，三指慢慢松开，吸取

抗凝血到所需刻度后抬起示指。注意吸血时管尖始终不要离开液面，以免吸入气泡；

也不要用力过度，将血液吸入乳胶吸头内。

4.拭净余血用干脱脂棉沿吸管口方向拭净余血，并检查血量是否达到规定刻度。

5.释放血液将吸管插入含生理盐水的试管底部，慢慢排出吸管内的血液，再用上

清液冲洗管内余血3次，最后将管内残余液体完全排净。

6.洗涤试管依次用蒸馀水洗净，95%（V/V）乙醇脱水，乙醛干燥。如为一次性微量

吸管，可省略该步骤。

【注意事项】

1.准备吸管吸管和胶吸头连接处应严密不漏气，挤压吸头力度应适宜。

2.持管吸血吸血时动作宜慢，防止血液吸入乳胶吸头内；避免产生气泡。

3.拭净余血吸血后拭净管外余血以保证血量准确。

三、静脉采血法

【原理】使用注射器或负压采血器刺入浅静脉后，用负压吸取所需血量。

【器材】

1.消毒棉签。

2.压脉带（止血带）2~3nlm口径的橡皮软管。

3.一次性消毒注射器

（1）针头：30~40mm长，18号、19号、20号带斜面。若采集5岁以下儿童的血液

标本，使用23号或25号针。

（2）注射器：可选用2ml、5ml、10ml或20ml注射器。

4.一次性负压采血器。

5.试管含或不含抗凝剂，并应有采血量的标记（如5ml刻度）。

6.垫枕。

【试剂】

30g/L碘酊、75%（V/V）乙醇或碘伏。

1.抗凝剂（根据实验项目选择所需的抗凝剂）。

【操作方法】

1.准备试管仔细阅读受检者申请单，决定采血量，准备每个试验所需的试管，并

应按一定顺序排列，如患者仅做凝血试验一项，最初1口1血液必须丢弃。如做红细胞

沉降率测定，需取试管1支，加入适量抗凝剂（109mmol/L枸檬酸钠0.4ml）。

2.标记试管在试管上贴上标签，注明患者姓名、项目名称、采集日期、门诊或住

院号等。

3.消毒双手采血前，操作人员应用肥皂或消毒液和水洗手。

4.选择静脉采血前，要求受检者坐在实验台前。将前臂放在实验台上，掌心向上,

并在肘下放一垫枕。卧床受检者要求前臂伸展，暴露穿刺部位。常用采血位置是肘前

静脉，因其粗大、容易辨认。

5.检查注射器打开一次性注射器包装，左手持针头下座，右手持针筒。将针头和

针筒紧密连接，并使针头斜面对准针筒刻度，抽拉针栓检查有无阻塞和漏气。最后排

尽注射器中的空气，备用。使用前，保持针头无菌状态。

6.消毒皮肤用30g/L碘酊棉签自所选静脉穿刺处从内向外，顺时针方向消毒皮肤,

待碘酊挥发后，再用75%乙醇棉签以同样方式拭去碘迹；或以碘伏消毒，待干。

7.扎压脉带在采血部位上端约6cm处，将压脉带绕手臂一圈打一活结，压脉带末

端向上。要求患者握紧和放松拳头儿次，使静脉隆起。压脉带应能减缓远端静脉血液

回流，但乂不能紧到压迫动脉血流。

8.穿刺皮肤取下针头无菌帽，以左手拇指固定静脉穿刺部位下端，右手持注射器,

示指固定针头下座。保持针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头与皮肤成30°

角斜行快速刺入皮肤，然后成5°角向前穿破静脉壁进入静脉腔。确认穿刺入静脉中

心位置，并沿着静脉走向将针头推入1015mm。

9.抽血用左手缓缓向后拉注射器针栓，见少量回血后，松开压脉带。然后，向后拉

针栓到达采血量刻度。若使用一次性负压采血器，当针头进入血管后会见少量回血，

将负压采血管插入试管托内采血针中，因试管内负压作用，血液自动流入试管，到达

采血量刻度后拔出试管即可。

10.止血嘱受检者松拳，用消毒棉签压住穿刺点，迅速向后拔出针头。继续紧按住

消毒棉签3mino

11.放血从注射器上取下针头。将血液沿试管壁缓缓注入，到达标记处。含抗凝剂

试管需迅速轻轻颠倒混匀几次。

【注意事项】

1.采血准备采血前应向患者耐心解释，以消除不必要的疑虑和恐惧心理。如遇个

别患者进针时或采血后发生眩晕，应立即拔出针头让其平卧休息片刻，即可恢复。必

要时可给患者嗅吸芳香酊、针刺（或拇指压掐）人中和合谷等穴位。若因低血糖诱发

眩晕，可立即静注葡萄糖或嘱患者服糖水。如有其它情况，应立即找医生共同处理。

2.准备试管不同检查项目可根据试验需要选择不同的抗凝剂及与血液的稀释比

例，如血细胞计数及MCV、MPV等参数测定时应选择EDTA-心抗凝，不要用肝素抗凝，

因为肝素抗凝会影响RBC和PLT的计数结果。

3.选择静脉如果肥胖患者的静脉暴露不明显，可以左手示指经碘酊、乙醇或碘伏

消毒后，在采血部位触摸，发现静脉走向后凭手感的方向与深度试探性穿刺。

4.检查注射器静脉采血前要仔细检查针头是否安装牢固，针筒内是否有空气和水

分。所用针头应锐利、光滑、通气，针筒不漏气。抽血时针栓只能向外抽，不能向静

脉内推，以免形成空气栓塞，造成严重后果。

5.扎压脉带采静脉血时压脉带压迫时间不能过长、绑扎不能过紧，以避免淤血和

血液浓缩，最好不超过Imin,否则会影响某些实验结果，如造成血红蛋白和血细胞比

容增高。

6.穿刺皮肤不能从静脉侧面进针。针头进入静脉的感觉是：皮肤有一定阻力，而

静脉壁阻力较小，更富弹性。

7.抽血血液加入抗凝试管中应与抗凝剂充分混匀以达到抗凝目的；无须抗凝时则

将血液直接注入试管中。要防止血液标本溶血，因为溶血后标本不仅血红细胞数和血

细胞比容减低，还会使血清（浆）化学成分发生变化。造成溶血的原因有：注射器和

容器不干燥、不清洁；压脉带捆扎时间太久，淤血时间长；穿刺过程中损伤组织过多;

抽血速度太快；血液注入容器时未取下针头或用力推出时产生大量气泡；抗凝血用力

震荡；离心时速度过快等。

8.止血不能弯曲手臂，以免形成血肿。

9.放血颠倒混匀时，需防止溶血和泡沫产生。切忌震荡试管。

10.标本检测与保存血液标本采集后应立即送检，实验室接到标本后应尽快地检查。

抗凝静脉血可稳定8~12h,如不能及时测定，应将其置于较稳定的环境中，如4℃冰

箱，减少和降低条件的变化。测定前，将其从冰箱内取出，恢复至室温状态，混匀后

再测定。要注意有的试验标本不宜4c保存，如PLT计数。用于生物化学检查的标本

若不能及时检查，应将血清或血浆与细胞分离，进行适当的处理。

11.一次性器材只能使用一次，不能反复使用。

四、血红蛋白测定（Hemoglobin简称Hb）

氧化高铁血红蛋白法

【原理】

血红蛋白被高铁氟化钾氧化成高铁血红蛋白，再与鼠离子（CN）结合生成稳定

的氟化高铁血红蛋白，用光电比色法根据标准曲线求得每升血液的血红蛋白克数。

【试剂】

HicN试剂

【操作方法】

取试剂5毫升加入血液20立方毫米混匀置5分钟后用540nm波长，试剂为空白

调0点比色，读取光密度，查标准曲线得结果。

【报告方式】HbXXXg/L

【参考区间】

男性成人：120—160g/L

女性成人：110—150g/L

新生儿：170—200g/L

五、红细胞计数（redbloodcell简称RBC）

——显微镜直接计数（试管法）

【原理】

一定量的血液经一定量等渗性稀释液稀释后，充入血细胞计数池中显微镜下计数。

【血细胞计数板】

血细胞计数板中央有两个刻度平台（即血细胞计数池），每个平台划分为9个大方

格，每个大方格的面积为1平方毫米，加特制盖片的深度为0」毫米，故每1大方格

的容积为0.1立方毫米。四角的四个大方格又等分为16个中方格，作为计数白细胞

用。中央大方格又等分为25个中方格，每个中方格又等分为16个小方格，共为400

个小方格，作为计数红细胞和血小板之用。计数台之上覆以特制的盖片（厚度0.4mm,

表面平直，质地较硬）后构成计数室。每个大格方格体积是0.ImmdnimXImmXO.limn）,

参阅图1、2及3。

计数板与首片

计JR板间JEU为01.星片

V7-)

热片支持提

图2血细胞计数板侧面图

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图3血细胞计数台镜下结构

【操作方法】

1、取红细胞稀释液2.0ml毫升，放入一小试管内。

2、用血红蛋白吸管吸血至10立方毫米处。

3、擦去管尖外部余血将血液迅速轻轻吹入盛有红细胞稀释液的试管内，吸上清

液嗽洗吸管2-3次，立即摇匀。

4、用玻棒取混悬液少量，充入计数池内。

5、待2—3分钟，让红细胞完全下沉后，将计数板平放在显微镜台上，用低倍镜

观察，如红细胞分布均匀即可换高倍镜进行计数。红细胞计数的区域是中心大方格

中的5个中方格（正中一个和四角各一个）。计数方法：长城迂回法。计数原则：凡压

在中方格边线（双线）上的红细胞，只计上侧与左侧线上的细胞，而压在下侧与右侧线

上者不计入。即“数上不数下，数左不数右”的原则进行。

图4红细胞计数的方式

图4红细胞计数的方式

【计算】

红细胞数/L=5个中方格内红细胞数X5X10X201X106或

红细胞数/L=5个中方格内红细胞数+100X1012

式中X55个中方格换算成1个大方格

X101个大方格容积为0.lul,换算成1.0uLo

X201血液的稀释倍数

X106由ul换算成L

【报告方式】RBCXXXX107L

【注意事项】

1、吸管、试管要注意清洁、干燥以防溶血，操作迅速避免血液凝固，如有血凝

块应重新采血，同时做血红蛋白测定、红细胞计数、白细胞计数和分类计数，在采血

时应先做血膜再做红细胞，然后做白细胞，血红蛋白检验，避免红细胞破坏。

2、充液前，红细胞悬液要充分摇匀，红细胞悬液注入计数池内要求分布均匀，

不可有气泡，亦不可有多余液体外溢。

3、中方格内红细胞分布应均匀，健康成人每中方格红细胞数约为80—100个，

各中方格内之红细胞相近，如悬殊过大(超过10个细胞以上的)应重混匀再充填。

【参考区间】男性成人：(4-5.5)X107L

女性成人：(3.5—5)X10'2/L

新生儿：(6—7)X107L

实验二

血液一般检验（二）GeneralExaminationofBlood

【内容】

1、白细胞计数及分类计数

2、各类白细胞的形态（示教）

【目的要求】

1、掌握白细胞直接计数，分类计数的标本送检要求、方法及参考值，并换算出

白细胞绝对值。

2、掌握血液涂片的制作与瑞氏染色方法。

3、熟悉并能识别三类五种白细胞的正常形态及常见异常白细胞的形态。

【器材】

血细胞计数板、载物片、推片、手揪计数器、染色架、吸耳球、三棱针、酒精

棉球及干棉球，血红蛋白吸管，小试管，显微镜。

【试剂】

1、白细胞稀释液，冰醋酸2毫升，蒸馀水加至98ml,1%亚甲兰（或结晶紫）数滴

显色借以区别其他稀释液。

2、瑞氏染液、缓冲液或蒸储水、香柏油。

瑞氏一姬姆萨复合染色液

取瑞氏染粉1g，姬姆萨染粉0.3g,置洁净研钵中，加少量甲醇（分析纯），研磨

片刻，吸出上层染液。再加少量甲醇继续研磨，再吸出上层染液，如此连续几次，共

用甲醇500ml,收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各振摇3分钟共5天，以后存放一

周即能使用。

【实验】

一、白细胞计数（Whitebloodcell简称WBC）

【原理】

血液经稀酸稀释后，成熟红细胞全部被溶解，注入计数池后，在显微镜下计数白

细胞。

【操作方法】

1、取白细胞稀释液0.38毫升，置于小试管内。

2、用血红蛋白吸管吸血液至20立方毫米处，擦去管尖多余的血液，将血液迅速

放入稀释液中再吸上清液冲洗几次，立即混匀。

3、待液体呈褐色后，摇匀用玻棒充填入计数池内（与红细胞计数操作相同）。

4、静置2-3分钟，低倍镜下计数四角四个大方格中白细胞总数。计数原则压边

线的白细胞，仍为数上不数下，数左不数右。

【计算】

4个大方格内白细胞总数

白细胞数/L=-----------------------X10X20X106

4

式中4-4为每个大方格（即0.lul）内白细胞平均数

X101个大方格容积为0.lul,换算成lul

X20血液稀释倍数

X106由lul换算成1L

【报告方式】WBCXXXX109/L

【参考区间】

成人：(4—10)X107L

新生/L(15—20)X107L

6个月至2岁：(11—12)X107L

【注意事项】

1、与红细胞计数的注意事项相同

2、计数时，两次重复计数误差不得超过10%»

3、在某些病理情况下，血中可出现大量有核红细胞以致影响白细胞计数，此时

应通过分类计数将有核红细胞从总数中减去。

【校正公式】

白细胞校正数=XX100/100+Y

X=未校正前白细胞数

丫=在分类计数时，计数100个白细胞的同时，计数到的有核细胞数

例：某标本校正前“有核细胞数”为10X107L,血片分类计数100个白细胞过

程中见有核红细胞20%个。则校正后的白细胞数应为:

100

白细胞数/L=IOXIO7LX-------------------=8.3X107L

100+20

二、白细胞分类计数（Differentcount简称DC）

（一）血片制备法

1、自手指端取血一小滴置于玻片一端，把推片的一端放在血滴前方，将推片略

向后移，并左右移动一二次使血滴散开。

2、使推片与玻片之间形成30-40度角，均匀向前推成一个厚薄均匀，头、体尾

分明的血片。见图5。

血片.（图5）

r-

3

困5血涂片的备制

（二）瑞氏染色法

【原理】

瑞氏染色液中含有甲醇，起固定细胞的作用，其中还含有碱性染料（美兰及小量天

青）和酸性染料（伊红），在一定PH下细胞蛋白质因等电点不同，可选择性的吸附上述

染料而着色。

【染色方法】

1、待血片干燥后，于血膜上滴加瑞氏染色液数滴以盖住血膜为宜，静置约一分

钟。

2、再加等量的缓冲液与染液混匀（边加边用洗耳球打气或口吹），静置8—10分

钟，染色的时间随室外温度升高而适当缩短，反之可延长。

3、用自来水缓缓的将染料液冲去，干后油镜分类。

【分类方法】

1、将染好的血片先用低倍镜观察选染色良好，厚薄适宜，细胞分布均匀处，以

油镜进行分类。

2、在血片的体尾交界处滴加香柏油一滴，用油镜对好视野，以曲径推动血片，

向尾部上下迂回移动，如图6白细胞分类的镜检顺序。同时将遇到的各类白细胞分别

记录下来至总数达100个为止，每类的白细胞数目即为其百分率，一般来说粒细胞、

单核细胞以及体积大的细胞多分布于涂片上下边缘及其尾端，淋巴细胞多分布于体

部。(图6)

图6白细胞分类的镜顺序

3、各种白细胞绝对值计算，由每立方毫米内的白细胞总数，乘以该白细胞的百

分数，

即得出绝对值。

如：白细胞数为10x107L,淋巴细胞为30%,淋巴细胞的绝对值为：

10X30%=3X109/L

【报告方式】以国际单位(比值)报告

【参考区间】

嗜中性杆状核粒细胞(neutrophilicstabgranulocyteNst)0—5%国际单位0

—0.05

嗜中性分叶核粒细胞(NNeutrophil)50—70%国际单位0.5—0.7

嗜酸性粒细胞(EEosinophil)0.5—5%国际单位0,005-0-05

嗜碱性粒细胞(BBasophil)0-1%,国际单位0—0.01

淋巴细胞(LLymphocyte)20—40%,国际单位0.2—0.4

单核细胞(MMonocyte)3-8%,国际单位0.03—0.08

【注意事项】

1、在白细胞分类计数时，如遇到幼稚红细胞，要注意不要将此种细胞包括在白

细胞的百分数内，应另行报告。

2、儿童的白细胞分类计数，其正常值随年龄的大小而不同，特别是淋巴细胞的

变化较大。新生儿及2岁以内的幼儿淋巴细胞可高达0.7—0.8,3—5岁时，淋巴细

胞约为0.42—0.6,6—8岁时为0.5左右，8—14岁则接近成人。

三、白细胞常见的病理形态（示教）

中毒颗粒、空泡变性、大小不均等。

实验三

血液一般检验（三）GeneralExaminationofBlood

【内容】

1、网织红细胞计数

2、红细胞比积测定（示教）

3、红细胞沉降率测定（示教）

【目的要求】

1、掌握网织红细胞计数标本送检要求、原理和方法。

2、熟悉红细胞比积测定及红细胞沉降率检测原理和方法。

3、了解红细胞比积测定及红细胞沉降率检测标本送检要求。

【实验】

一、网织红细胞计数（RecitudocytoCount）

（试管法）

【原理】

网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟的红细胞之间的尚未完全成熟的红细

胞，由于其胞浆中尚残存核糖体等嗜碱性物质，因而用煌焦油兰染液进行活体染色后,

胞浆中可见浅兰绿色和深兰色的网状结构，故名为网织红细胞。

【试剂】

lOg/L煌焦油蓝生理盐水溶液：煌焦油蓝1g,枸椽酸钠0.4g,氯化钠0.85g溶于

双蒸储水100ml中，过滤后备用。

【操作方法】

取干燥洁净小试管一只，滴加煌焦油兰生理盐水溶液•滴，加入病人指端血液3-4

滴（贫血者多加儿滴）混匀，10分钟再混匀取一小滴推成薄膜片，干燥后用油镜检查，

分类计数1000个红细胞，求出其中网织红细胞百分率，以国际单位（比值）或绝对

值报告。

【注意事项】

1、血膜宜薄，以免使细胞重叠、挤缩而影响计数。

2、用二甲苯擦片后，可使结果偏低。

【报告方式】

网织红细胞百分率：以国际单位（比值）报告

网织红细胞绝对值：XXXX107L

【参考区间】

成人0.5—1.5%平均1%,国际单位0.005—0.015

新生儿3—6%国际单位0.03—0.06

成人网织红细胞绝对值（2.4—8.4万/uL）国际单位（24—84）X109/L

【网织红细胞绝对数的计算】

%网织红细胞X红细胞数/立方毫米

网织红细胞绝对数值=---------------------------------------

100

举例：设网织红细胞百分率为1%,红细胞数为500万/立方毫米，则

1%1X5OO万/立方毫米

网织红细胞绝对数值=----------------------------=5万/u]

100

【附注】

如因视野太小。其中红细胞太多，以至视觉混乱，无法数清时，可在接目镜内，

先接上一个中间开一个矩形的硬圆纸片-，将视野缩小（见图7甲）或先粘上四根头发（见

图7乙），以便计数。

以便计数.

图7(甲)

二、红细胞比容

(DeterminationofHematocritHet)测定(示教)

【原理】

将定量的抗凝血液用一定速度和时间离心沉淀后，观察压实红细胞与全血体积的

比值(L/L),称为红细胞比容，它的多少与红细胞数量和大小有关.

【操作方法】

1、静脉穿刺取血2矶，放入肝素抗凝剂(肝素钠0.2mg)的小试管内充分摇匀，防

止凝固。

2、用长的毛细管取上述血液将其插到温氏血管底部，将血徐徐注入至“0”刻度

3、置离心机内，以每分钟3000转的速度离心30分钟。

4、取出温氏管观察红细胞高度并加以记录，再将温氏管同上述速度再离心5分钟,

至红细胞不再下降为止，乘以0.01即为每升血液中红细胞体积的升数，以L/L为单

位报告结果。

【报告方式】0.XX

【参考区间】

成年男性0.42—0.49L/L(42—49%)

成年女性0.37—0.43L/L(37—43%)

三、红细胞沉降率

(DeterminationofErythrocytesedimentationrate简称ESR)

测定(示教)

【原理】

红细胞具有细胞膜的胶体性质，除具有一定的表面张力以外，在红细胞外有一层

水化膜使红细胞互相隔离，红细胞表面带阴电荷，因此红细胞互相排斥，而不易粘合

下沉。球蛋白与纤维蛋白原带正电荷，因此二者增多或减少，都会使红细胞沉降率发

生变化。离体抗凝血液置于特制刻度测定管内，垂直立于室温中，记时1小时观察上

层血浆高度以红细胞下沉的毫米数值报告。

【试剂】

109mmol/L(32g/L)枸檬酸钠溶液：取含二分子结晶水枸檬酸钠(分子量294.12)

3.2g,用蒸储水溶解，稀释至100ml。室温保存不能超过2周.

【操作方法】

测定方法很多，现介绍魏(Mestergren)氏法

在13mmX100mm试管中先加3.8%枸檬酸钠0.4毫升，静脉取血1.6毫升注入上

述试管内，立即混匀，用血沉管吸取抗凝血至刻度“0”处，垂直固定于血沉架上，

在室温置1小时。

【报告方式】X毫米/小时

【参考区间】

男性＜15毫米/小时

女性〈20毫米/小时

【注意事项】

1、注射器、试管、血沉管均应保持干净干燥，以免溶血。

2、血沉管必须完全垂直，否则血沉加快，影响结果的准确性。

3、血液与抗凝剂的比例应要准确，充分混合，并应在抽血后3小时内测定。

4、测定时温度应在18—25℃室温进行，温度过高血沉加快，过低则变慢。

实验四

出血与血栓性疾病的实验室检查

(LaboratoryExaminationofHemorrhagicDisorders)

【［内容】

一、血小板计数(Platelecount简称PC)

二、凝血酶原时间(PT)测定

三、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定

四、纤维蛋白原含量测定

五、凝血酶时间(TT)测定

【目的要求】

1、掌握血小板计数的原理、操作方法及参考值。

2、掌握凝血四项APTT、PT、TT、Fib试验的原理、方法、结果判断及临床意义。

3、熟悉凝血四项标本送检要求。

4、了解出血性疾病常用的实验室检查方法及其原理。

【实验】

一、血小板计数(Plateletcount简称PC)(目视计数法)

【原理】

取一定量血液，放于血小板稀释液内按一定倍数稀释，破坏红细胞及白细胞，用

直接计数法计数，再算出每升血液中的血小板数。

【器材】

三棱针、玻棒、血红蛋白吸管、小试管、显微镜等。

【试剂】

许汝和氏液：胭素10g；枸檬酸钠0.5g,40%甲醛0.1毫升，蒸馈水加至100毫

升。

将上液混合，待溶解后过滤，放于冰箱内保存。

【操作方法】

(1)取0.38毫升血小板稀释液于清洁试管中。

(2)从耳垂或指端取血，用血红蛋白吸管吸血至20立方毫米处，擦去管尖外所有

沾的血液迅速放人稀释液内，再用上清液冲洗吸管数次，混匀。

(3)取上述混匀的血小板悬液一滴，加至血细胞计数池内，静置10—15分钟，让

血小板下沉稳定。

(4)用高倍镜计数血小板，计数中央大方格中的5个中方格内的血小板数，如以P

代表，则血小阪计数为：

PX5(变为0.lul)X10(变为lul)X20(稀释倍数)X106(将ul换算为L)=PX109

/L

【报告方式】xxX109/L

【参考区间】

血小板计数(100—300)X109/L

【注意事项】

(1)血小板要和其它杂质区别，前者为园形折光小点，后者为碎片不折光，如血

小板聚集在一起，则不能计数，须另取标本再检。

(2)血液稀释后，应在1小时内计数完毕，如果时间过长，则可使血小板逐渐破

坏，以致结果偏低。

(3)混悬液注入计数池后，静置10—15分钟为宜，时间过短，血小板未下沉，时

间过长；血小扳被破坏，均使结果偏低。

二、凝血酶原时间(Prothrombintime,PT)测定(一步法)

【原理】

在待检血浆中加入过量的含钙组织凝血活酶，使凝血酶原转变为凝血酶，凝血

酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，测定从加入含钙组织凝血活酶到血浆凝固所需的时

间即为凝血酶原时间。此试验可了解受检血浆外源凝血系统凝血因子有无异常的情

况。

【器材】水浴箱、试管、试管架、加样抢、吸头、离心机、秒表

【试剂】

冻干含钙凝血活酶102.0ml

稀释液4~6.0ml

本批号国际敏感指数(1S1)值:2.20

【样本收集和保存】

静脉采血，血样与抗凝剂(0.109mol/L枸檬酸三钠)的比例为9：1,轻轻颠倒

混匀，以2700g(离心半径18cm约3500转/分)离心10分钟，分离血浆待测。如该血

浆不能立即分析，应将其密封放2—8℃保存，最长不超过4小时，或立即置于一20℃

以下冻存不超过30天，用时37c融化，避免反复冻融。

【操作方法】

1、每瓶冻干含钙凝血活酶加2.0ml稀释液复溶即为PT应用试剂。用前置，37℃

预热。

1ml,~37c浴分钟。

2、加入PT应用试剂0.2Jof~-c,立刻计时，记录凝固时间，即为凝血酶原时

间(PT)。采用仪器测定，请参考仪器使用说明书。

【计算】

凝血酶原时间比值(PTR)

国际正常化比值(lNR)=PTRmI

本批试剂盒PT正常对照值：12.3秒

【报告方式】患者X秒，正常对照X秒

【参考区间】

1、以PT表示：12—15秒，超过正常对照3秒以上为异常。

2、以PTR表示：0.95—1.24

3、监测口服抗凝药，以INR表示。

建议各实验室使用健康正常血浆，建立自己的参考值范围。

【注意事项】

1、抽血要顺利，抗凝要充分，决不可有凝血块。

2、水浴温度控制在37土0.5℃,过高或过低均会影响结果。

3、样品收集时不宜用EDTA和肝素作抗凝剂。

4、复溶试剂按每天使用量取适量预热，未川完之预热试剂应弃去。复溶试剂请

勿冰冻保存。

5、如果血球压积＜20%或＞55%,则需调整血样与抗凝剂的比例，方法是0.00185

义血液毫升数X(100一压积)=抗凝剂毫升数。

【贮存】

试剂2—8℃保存有效期为12个月，复溶试剂2—8℃保存有效期3天。

三、活化部分凝血活酶时间

（Activatedpartialthromboplastintime,APTT）测定

【原理】

在37c条件下，以白陶土（激活剂）激活因子刈，以脑磷脂（部分凝血活酶）代

替血小板提供凝血的催化表面，再加入适量的Ca「，即可满足内源性凝血的全部条件。

测定从加入CaJ血浆凝固所需的时间即为活化部分凝血活酶时间，此试验可了解受检

血浆内源凝血系统凝血因子有无异常的情况。

【器材】水浴箱、试管、试管架、加样抢、吸头、离心机、秒表

【试剂】

冻干部分凝血活酶10~L0ml

MS溶液2~6.0ml

0.025moi/氯化钙溶液

【样本收集和保存】

静脉采血，血样与抗凝剂（0.109mol/L枸椽酸三钠）的比例为9：10轻轻颠倒

混匀，以2700g（离心半径18cm约3500转/分）离心10分钟，分离血浆待测。如该

血浆不能立即分析，应将其密封放2—8℃保存，最长不超过4小时，或立即置于一

80℃以下冻存不超过30天，用时37℃融化，避免反复冻融。

【操作方法】

1、每瓶冻干部分凝血活酶加LOmlMS溶液复溶即为APTT试剂。

2、取待测血浆0.1ml,加入APTT试剂0.1ml,混匀，37c预热5分钟。

3、加入0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml,立刻计时，记录凝固时间，即为活化

部分凝血活酶时间（APTT）。如采用仪器测定，请参考仪器使用说明书。

【报告方式】患者X秒，正常对照X秒

【参考区间】

30—44秒，超过正常对照10秒以上为异常。

建议各实验室使用健康正常人血浆，建立自己的参考值范围。

【注意事项】

1、抽血要顺利，抗凝要充分，不可有凝血块；分离血浆时，务必去除血小板。

2、水浴温度控制在37_+0.5℃,过高或过低均会影响结果。

3、样品收集时不宜用EDTA和肝素作抗凝剂。

4、本试剂盒所含MS溶液忌冰冻。

5、复溶试剂按每天使用量取适量预热，未用完之预热试剂应弃去。复溶试剂请

勿冰冻保存。

6、本方法对于凝血因子活性40%的样品欠敏感。

7、如果血球压积＜20%或＞50%,则需调整血样与抗凝剂的比例，方法是：0.00185

X血液毫升数X（100—压积）抗凝剂毫升数。

【贮存】

试剂2-8℃保存有效期12个月。

复溶试剂2-8℃保存有效期3天。

四、纤维蛋白原含量测定（Fibrinogen,Fib）

【原理】

纤维蛋白原与凝血酶作用形成不溶性纤维蛋白，因而血浆在加入适量凝血酶后即

逐渐凝固，凝固时间与血浆中纤维蛋白原的浓度呈负相关。以国际标准品为参比血浆

制作“凝固时间（S）——纤维蛋白原的浓度（g/L）”标准曲线。测定被检血浆的凝

固时间，被检血浆的纤维蛋白原含量即可从标准曲线上查得。

【器材】水浴箱、试管、试管架、加样抢、吸头、离心机、秒表

【试剂】

1、冻干正常参比血浆2、冻干纤原试剂3、稀释液4、凝血酶（冻

干品）

【样品收集和保存】

静脉采血，血样与抗凝剂（0.109mol/L枸椽酸三钠）的比例为9：1,轻轻颠倒混

匀，以2700g（相当于离心半径18cra约3500转/分）离心10分钟，分离血浆待测。

如该血浆不能立即分析，应将其密封放2—8℃保存：最长不超过4小时，或立即置于

一20C以下冻存不超过30天，用时37℃融化，避免反复冻融。

【操作方法】

1、试剂准备：

(1)冻干正常参比血浆加0.5ml蒸储水，即为正常参比血浆。

(2)冻干纤原试剂每瓶加1.0ml蒸饵水，即为纤原试剂。用前37℃预温3分钟

以上，但不可超过30分钟。

2、标准曲线制作

(1)将正常参比血浆用稀释液作1:5、1:101:20、1:40稀释。

(2)取不同稀释度的正常参比血浆0.2ml,置37c预热3分钟。

(3)加入纤原试剂0.1ml,立刻计时，记录凝固时间。

(4)标准曲线的获得：将以上测定时间与纤维蛋白原浓度值对应即可获得。

3、样品测定

(1)将样品用稀释液作1:10稀释待用。

(2)取稀释后的待测血浆0.2ml,于37℃预热3分钟，加入纤原试剂0.1ml,

立刻计时记录凝固时间。将凝固时间代入标准曲线，即可得到纤维蛋白原浓度。如

采用仪器测定，请参考仪器使用说明书。

【报告方式】X.XXg/L

【参考区间】

2.0-4.0g/L

建议各实验室使用健康正常人血浆，建立自己的参考值范围。

【注意事项】

1、不同仪器判断终点有所不同，故所得凝固时间及标准曲线会有所不同。但同

一批次试剂均应获得较理想的重复性及线性。

2、标准曲线制作中，可根据检测方法的不同、仪器的灵敏度和操作说明以及检

测要求等具体情况进行多点选择。

3、抗凝血酶物质的存在会影响实验结果。

4、不同批次纤原试剂效价可能不一样，请严格按测定步骤1.2指示量复溶

5、如果血球压积＜20%或＞55%,则需调整血样与抗凝剂的比例血液毫升数X(100

一压积)抗凝剂毫升数

6、复溶试剂按每天使用量取适量预热，

【贮存】

本试剂2-8°C保存有效期12个月

复溶试剂2—8。。保存有效期3天。

复溶试剂请勿冰冻保存。

五、凝血酶时间(Thrombintime,TT)测定

【原理】

在血浆中加入标准化的凝血酶溶液，在凝血酶的作用下，血浆凝固所需要的时

间即凝血酶时间。

【器材】水浴箱、试管、试管架、加样抢、吸头、离心机、秒表

【试剂】

1、冻干凝血酶10X2.Oral2、正常参比血浆

【样本收集和保存】

静脉采血，血样与抗凝剂(0.109mol拘橡酸三钠)的比例为9：1轻轻颠倒混匀

2700g(离心半径18cm约3500转/分)离心10分钟，分离血浆待测。如该血浆不能立

即分析，应将其密封放2—8℃保存，最长不超过4天，或立即置于-2℃以下冻存不超

过30天，用时37℃融化，避免反复冻融。

【操作方法】

1、每瓶冻干凝血酶加2ml蒸镭水复溶即为TT应用试剂超过30分钟。

2、取待测血浆0.2ml,37℃预温2分钟。

3、加入TI'应用试剂0.2ml混匀，立刻计时如采用仪器测定，请参考仪器使

用说明书。

【报告方式】患者X秒，正常对照X秒

【参考区间】

16-18秒，超过正常对照3秒以上为异常。建议各实验室使用健康正常人血

浆。

【注意事项】

用前37℃预热。预热时间不记录凝固时间，即为凝血酶时间(TT)。建立自己的参

考值范围。

1、抽血要顺利，抗凝要充分，决不可有凝血块。

2、浴温度控制在37±0.5℃,过高或过低均会影响结果。

3、样本收集时不宜用EDTA和肝素作抗凝剂。

4、观察凝固时，光线要充足，必要时作双份测定，可报告其均值。

5、批次复溶凝血酶的量应按测定步骤1的指示量进行，或者用正常参比血浆的

凝固时间16—18秒作为控制标准，如偏离此范围，可适当增或减稀释液的用

6、如果血球压积＜20%或＞55%,则需调整血样与抗凝剂的比例血液毫升数X(100

一压积)抗凝剂毫升数

【贮存】

本试剂2—8C保存有效期12个月

复溶试剂2—8C保存有效期3天。

实验五

一血型鉴定与配血(Bloodgrouptypingandmatchingofblood)

【内容】

1、ABO血型鉴定

2、Rh血型盐水介质法鉴定

3、交叉配血试验

(1)盐水介质配血法

(2)聚凝胺介质配血法

【目的要求】

1、掌握AB0血型鉴定的原理、方法及临床意义。

2、掌握交叉配血的原理及临床意义。

3、掌握Rh血型鉴定的原理、方法及临床意义。

【器材】

试管、双凹玻片、显微镜、竹签、离心机

【试剂】

抗A标准血清、抗B标准血清、抗D血清、5%红细胞盐水悬液。

【实验】

实验一ABO血型鉴定(ABObloodgrouptyping)

【原理】

根据红细胞上有或无A抗原或/和B抗原，将血型分为A型B型AB型及。型4

种。可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定AB0血型。所谓正定型，是用

已知抗一A和抗一B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或/和B抗原；所谓

反定型,是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗-A或/和抗-B。

【试剂】

1、抗A标准血清

2、抗B标准血清

3.受检者血清

4.受检者5%红细胞盐水悬液

【操作方法】

1.试管法

⑴取洁净小试管(内径1OmmX60mm)3支，分别标明抗-A、抗-B,用滴管分别加抗一A、

抗一B和抗一A+B分型血清各1滴于试管底部，再以滴管分别加人受检者5%红细胞盐

水悬液1滴，混和。

⑵另取洁净小试管(内径lOmmX60mm)3支，分别标明A、B型细胞，用滴管分别加入

受检者血清1滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B和0型5%试剂红细胞悬液1

滴，混和。

(3)立即以1000r/min离心Imin。

(4)将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以肉眼观察有无凝集(或溶血)现

象。如肉眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。

(5)观察结果时既要看有无凝集,更要注意凝集强度,此有助于A、B亚型、类B或cisAB

的发现。

(6)凝集强度判断标准

4+=红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。

3+=红细胞凝集成数小块，血清尚清晰。

2+=红细胞凝块分散成许多小块，见到游离红细胞。

1+=肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞。

±=镜下可见数个红细胞凝集在一起.周围有很多游离红细胞。

MF=混合凝集外观（mixedfield）是指镜下可见少数红细胞凝集，而极大多数红

细胞仍呈分散分布。

一表示阴性，镜下未见凝集，红细胞均匀分布。

（7）按下表报告受检者红细胞ABO血型。

2.玻片法

（1）取清洁玻片1张（或白瓷板1块），用蜡笔划成方格，标明抗M、抗-B和抗一

A+B分别用滴管滴加抗-A、抗-B和抗一A+B血清1滴于标明的方格内，再各加受检者

2%红细胞悬液1