第2章 DNA的复制课件

第3章DNA复制

(DNAReplication)第2章-DNA的复制3.1.基本概念3.2.复制起点与方向

3.3.Semi-ConservationReplication

3.4.复制的方式

3.5.线状DNA的复制3.6.DNA复制与膜及膜蛋白的关系

3.7.DNA复制的基因与酶类体系

3.8.DNA复制速率及拷贝数的调控

3.9.MethylationofDNA3.10.DNA一级结构分析第2章-DNA的复制3.1.基本概念

(BasicConcept)第2章-DNA的复制遗传物质的分子机制分子生物学的核心Watson&Crick:

一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响遗传物质的基本属性：基因的自我复制控制性状的表达第2章-DNA的复制DNA复制

亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,

合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。●Replicon;●Replisome;AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator

Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA

第2章-DNA的复制DNAreplicationatphaseSofcellcycleE.coli37℃0.5h105bp/minS6-8hsM1hG23-4hsmammaliancell22-25hrs500-5000bp/minG112hs第2章-DNA的复制

复制机理的复杂性D.S.DNAS.S.DNA能量的供求构型的变化超螺旋线状，开环状多种酶类的互作ReplisomeDNA复制起始控制机理知之甚少复制的准确性（修复，校正）研究试材的特殊性（温度敏感型ts，突变抑制体系Su）DNA复制速度(E.coli105bp/min，高速解旋112km/h?)缺乏统一的模式(D.S.DNA,S.S.DNA,LinearDNA….)第2章-DNA的复制3.2.复制起点与方向（replicationorigin&direction）第2章-DNA的复制isolationofori第2章-DNA的复制richAT&palindromeEnzymesbindingsite300bp±inreplicationorigin0fProkaryoteATrich复制起点的特征第2章-DNA的复制

“呼吸现象”

DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，导致两条DNA链不断解链与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。在富含AT的区域内尤为明显第2章-DNA的复制

replicationorigin

两侧基因的转导频率高

4a4b3c3d2e2f1g1haobcaobdecaobdfgecaobdfh

复制的不同步性断裂的随机性replicationorigin第2章-DNA的复制

复制的多模式单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向第2章-DNA的复制复制多模式的证据慢停突变(slow-stopmutation）当温度升高，复制停止在下一周期开始快停突变(fast-stopmutation）当温度升高，复制立即停止？第2章-DNA的复制1963Cairns37℃,5ci/mMH3-T,6min37℃,52ci/mMH3-T,6min42℃,T,onecircle模式？E.colithy—slow-stopmut.ts复制发动温度敏感突变型42℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸第2章-DNA的复制单起点、双方向第2章-DNA的复制R.L.RodriguezE.colithy-slow-stopmut.

ts42℃37℃,5ci/mMH3-T,20min37℃,52ci/mMH3-T,45min第2章-DNA的复制DirectionofDNAreplication单向复制双向复制第2章-DNA的复制

子链DNA延伸方向DNApolymerasereactsonthe3’endonly5’OHTCATCAC5’OH3’NewDNAelongationfrom5’to3’directionpppOHC++ppi

进化中保留的深刻的、选择与适应的、化学及功能的根源第2章-DNA的复制如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+5’pppOH3’GpppOHGATCG5’pppOH3’第2章-DNA的复制ATCG

+5’pppOH3’GpppOHG5’ppp因能量的需要，DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNaCl的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到DNA的5‘端，而且双链DNA的5’端碱基配对困难需要其他机制以解脱第2章-DNA的复制碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗

ATCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH第2章-DNA的复制3.3.DNA的半保留复制（Semi-ConservationReplication）第2章-DNA的复制(CsClgradientcentrifuge)

N15

N14DNASemi-ConservationReplicationM.MeselsonandF.W.Stahl,Sciences44:675,1958.第2章-DNA的复制Threereplicationhypotheses第2章-DNA的复制3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘第2章-DNA的复制a)Okazakifragment1968ReijiOkazakiE.coli[t-]2’’,7’’,15’’,60’’pulse-labelingindT-H3stopinKCN0℃D.S.DNAS.S.DNADensitygradientofsucroseMeasureH3-Tpulse-chase20℃indT-H330’’transfertodTthencontinue第2章-DNA的复制H3-Tpulse-chase

pulse-labeling120’’60’’15’’7’’2’’10S(1kb)40S(Prok.400Nt/sec)DNAreplicationinOkazakifragment1kb第2章-DNA的复制AtleastonestrandofDNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘DNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘（semi-discontinuousreplication!）第2章-DNA的复制半不连续复制（semi-discontinuousreplication）

证据

dumpfragmentinDNA第2章-DNA的复制dUTP:dTTP=1：300incell

ATGCAUGUdutgenedUTPase少数dUTP

DNA中不能有U?AT突变频率=1/1200！？AAUUngaseungU尿嘧啶-N-糖基酶第2章-DNA的复制UUdenaturedumpfragment~1200base~Okazakifragment●

ung–dumpfragmentlonger●dut

–

dumpfragmentshorterAA第2章-DNA的复制leadingstrand(indUMPF.)laggingstrand

（inO.F.）Lig(ts)？直接证据？pulse-labeling60’’15’’7’’2’’120’’第2章-DNA的复制DNAsemi-discontinuousreplication

leadingstrand,laggingstrand

均有dUMP的掺入

Okazaki片段在某种意义上为

dUMP片段先导链按dUMP片段连续复制后随链按Okazaki片段不连续复制(Prok.1-2kb,Euk.0.1-0.2kb)第2章-DNA的复制3.4.DNA复制的方式

(DNAreplicationmodel)

第2章-DNA的复制●新起始方式（denovoinitiation）或复制叉式（replicationfork）

startingpoint(Cairrnsmodel,θform)→RNAprimer→transcriptionactivation→leadingstrand→fork→laggingstrandmultiplerepliconEukaryote(500-5000bp/min)第2章-DNA的复制primer

(DNA聚合酶不能发动子链DNA的复制起始

)E.coli[Rifs][RifS]+M13E.coliE.coli[RifR]M13+S.S.DNAvirus+RF无M13RFRifampinM13Rifampin有M13RF有M13RFM13Rifampin第2章-DNA的复制Rifampin

是E.coliRNApolymerase

的抑制剂

M13RF的形成需要RNApolymerase发动合成一段RNA分子作为引物

RF启动后，Rifampin

的抑制无效Conclusion第2章-DNA的复制M13phageS.S.DNAvirus6407base5480--5820th

5hairpins5756th20--30NtRNAasprimerdisruptinghairpin3rdhairpin59bpreplicationoriginSSBelongationRF第2章-DNA的复制labeledtheintactprimersontheOkazakifragmentswith[32p]GTP.destroyedDNAwithDNase,leavingonlythelabeledprimers.Lanesaande;defectiveinRNaseH;lanesbandf;defectivenucleaseactivityofDNApolymeraseI;Lanescandg;defectiveinbothRNaseHandthenucleaseactivityofDNApolymeraseI;Lanesdandh;wild-type.Thebestyieldofprimersoccurredwhenbothnucleasesweredefective(laneg),andtheprimersinallcaseswere12±1ntlong.Thepositionofthe13-mer

TunekoOkazakiJ.Mol.Biol.184(1985)p.49FindingandmeasuringRNAprimers.beforeDNasedigestionafterDNasedigestion第2章-DNA的复制DNA复制的转录激活(transcriptionalactivation）RNApolymerase[RifS]10NtRNAprimerforleadingStrand

origindnaGprimase

[RifR]forlaggingStrand

第2章-DNA的复制RNApolymerasePrimase(dnaG)(forprimerofLeadingStrand)(forprimerofLaggingStrand)RifSRifR

合成的RNA分子与合成的非典型的mRNA分子与

DNA模板分离DNA模板以氢键连接不分离

可以使D.S.DNA解链为单链只能利用单链状态的DNA

状态完成DNA复制的转录激活为模板合成<12Nt的RNA引物

(也可利用dNt合成DNA引物)leadingstrand引物的合成是否primase单独存在时没有活性

--由RNApolymerase完成转录只有与相关蛋白(dnaB.C)结合成激活合成的RNA分子作为引物复合体引发体（primosome)--或由primase(dnaG)接替在某种意义上讲,

合成的引物primase译为引物酶？引发酶！仍无定论！

更为确切！第2章-DNA的复制DNA新起始方式（denovoinitiation）复制的基本模式ParentalD.S,DNAUnwindingproteinRNApolymerasePrimaseDNApolymeraseleadingStrandlaggingStrandElongationoflag.&lea.strandsDNApolymerasePoly(dNt)ligaseReplicationloopRNAprimerRNA-primedDNApieces(1kb)Continuous5’to3’inLeadingS.Discontinuous3’to5’inlaggingS.TwolongDNApiecesManyshorterDNApieces(1-2kb)Repair&fillingin5’to3’Bidirectionallengtheningofnewstands第2章-DNA的复制primosome

SynthesisofprogenystrandinlaggingDNApppRNAasprimerDNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNAligase第2章-DNA的复制

RNApol(RNApolymerase)[RifS]

dnaG(primase)[RifR]

完成对后随链引物的合成

完成10±NtRNA引物合成后.DNApolII进行DNA链的延伸DNApolI对后随链的RNA引物切除并聚合填补

连接酶(ligase）将Okazaki片段，

dUMP片段连接完成对先导链引物的合成实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个Okazaki片断Conclusion第2章-DNA的复制●共价延伸方式（covalenceelongation）

或滚环方式（rollingcircle）D.S.DNA→Nick→leadingStrand→Elongation→rolling→LaggingStrand(δform)第2章-DNA的复制cyclingamplification5‘3‘3‘3‘●共价延伸方式（covalenceelongation）

或滚环方式（rollingcircle）第2章-DNA的复制InmitochondrialDNAalsoinchloroplastDNA

●置换式（Displacementform）

D.S.DNA→S.S.DNAastemplate→NewS.S.DNA→Displacement→D-Loop第2章-DNA的复制复制叉两侧DNA双螺旋的解旋E.coli

C/genome=3.2X106bp,40分钟/每次复制历时,10bp/每圈螺旋

84000bp解旋/分(8400rpm!高速离心机)DNAtopoisomeraseIDNA的单链瞬间断裂（transientsingle-strandbreak）缓解高速旋转DNAtopoisomeraseIIDNA的双链瞬间断裂（transientdouble-strandbreak）缓解高速解旋时，DNA双链的相互缠绕能量？第2章-DNA的复制TopI,TopIIHelicase(repprotein)SingleStrandBindingprotein(SSB)Helixdestabilizingprotein(HDP)DnaBpriteinDnaCproteinPrimaseUng-aseDNAPolymeraseIIIDNAPolymeraseILigaseforprimosome复制体进化中形成了活的多酶复合体

replisome第2章-DNA的复制Primosome（consistsofsixproteins）

PriA(dualrole)displaceSSBfromS.SDNAandhelicase

DnaT

requiredatpreprimingstage

DnaBiscentralcomponent,actionwithDnaC

DnaC

iscentralcomponent,actionwithDnaBPriB

functionisunknown

PriC

functionisunknownDnaGprimase第2章-DNA的复制进化中形成了灵活的多酶复合体replisome第2章-DNA的复制位于复制叉处的多酶复合体完成

laggingStrandDNA延伸时

必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段InlaggingStrand多酶系统必须必须完成多次反复的启动与扩展

E.coli

启动2000—4000次的冈崎片段复制第2章-DNA的复制Replisomemodel第2章-DNA的复制第2章-DNA的复制第2章-DNA的复制ReplisomeincovalenceelongationSSB第2章-DNA的复制3.5.线状DNA的复制及避免5’末端短缩的模式（5’-endshorten）

第2章-DNA的复制3’-OH?

3‘-OHLaggingstrandofcircleDNAreplicationLaggingstrandoflinearDNAreplicationBut3‘5‘5‘3‘3’-OH?

第2章-DNA的复制WatsonJ.DT7phageDirectrepeatintheendoflinearDNAConcatermerbetweentwooffspringDNAafterreplication

(100dNtterminalredundancy)第2章-DNA的复制??concatermer3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OH第2章-DNA的复制LinearD.SDNAHairpinterminatorHairpinReplicationStaggeredcutBi-directionalreplicationbeginningattheorigin

ConvertstheS.S.structuretoadoublehelicalequivalentTwostaggeredcutsaremadeReplicationoflinearPoxviralDNA

第2章-DNA的复制ligase第2章-DNA的复制c)ReplicationoflinearAdnovirus-2DNA

35937bp

pTP

C

GIR103-162

IR;including50bpreplicationorigin

richAT&1thC/Ghighconversation

pTP;pre-Terminalprotein80kd→TP55kdSSB;S.S.DNAbindingprotein72kdAd2DNApolymerase;140kd

第2章-DNA的复制复制起始复合体引发复制（不需引物）

避免5’-endshortenpTp-Ser-dCMP

CG●过程

SSB+ATPDNA末端解链

TPpTP-Ser+dCTP

pTP-Ser-dCMP

3‘OH第2章-DNA的复制IRIRCGGCGCCGpTP-Ser-dCMPHairpinPanhandlepTP-Ser-dCMPG3’G3’G3’TPReplacedS.SDNA第2章-DNA的复制d)真核生物染色体DNA末端补齐模式

●端粒的发现

1938MullerX-rayDrosophila

末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定.并定名为Telomere

1938B.McClintock

顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。推测染色体末端具有特殊端粒结构。1970s分子生物学发展端粒研究获得突破第2章-DNA的复制●端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCCAACCCCAACCCC5’(richCchain)

●1985.CarolGreider&Blackburn,

1986.Gottchling尖毛虫telomerebindingprotein–155kdtelomerebindingprotein–226kd四膜虫telomerase

将T2G4

末端重复延伸游扑虫

Telomerase=RNACAAAACCCC

链+

末端结合蛋白（TBP）+100bptelomere第2章-DNA的复制●model

TBPisReversetranscriptase-like

RNAcomplementwith3’endofDNA&astemplateforcDNA

ElongatedT2G43’-endasprimerfor5’-endDNAsynthesisG链–T2G4TTGGGGTTGGG

C链--A2C4

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac5’TTG第2章-DNA的复制G链–T2G4TTGGGGTTGGGG

C链--A2C4TTG

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac5’GGGTTGG链–TTGGGGTTGGGGTTGGG

C链--AACCCCTTGGGGTTG

telomerase

3’

aaAACCCCAACuuac5’WhenG-richstrandislongerenough第2章-DNA的复制GGhoogsteenbond

Tetraplexhelix

G链–T2G4TTGGGGttggggttgC链--A2C4AACCCCAAggggttgggG链–T2G4TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGC链--A2C4

PrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCDNApolor第2章-DNA的复制Telomeraseactivityisrepressedinsomaticcellsofmulticelluarorganismsresultinginagradualshorteningofthechromosomewitheachcellgeneration.AsthisshorteningreachesinformationalDNA,thecellssenesceanddie.细胞分裂端粒阈值第2章-DNA的复制preparedTetrahymenacell-freeextractsandincubatedmacronucleusfor90minwithasyntheticoligomerhavingfourrepeatsofthe-T-TGGGGtelomererepeatsequenceplusthelabeledandunlabeledNtelectrophoresedtheproductsdetectedthembyautoradiography.9-12;containedtheKlenowfragmentofE.coilDNApolymeraseIinsteadofTetrahymenaextract(telomerase).13-16;containedextract,butnoprimer.TelomeraseactivityisapparentonlywhenbothdGTPanddTTParepresent.Greider&BlackburnCell43(Dec1985),p.406.Identificationoftelomeraseactivity.第2章-DNA的复制

长短细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂端粒阈值端粒长短端粒酶活

Harley(1989)端粒的重复片段为探针检测胎儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株老年细胞株年龄小大端粒长度早老性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉”的衰老＞研究端粒（记时器）丢失的速率/年，预测人类的寿命

XXXYwhy?PCD机制、癌细胞的无限繁殖第2章-DNA的复制TheterminationofDNAreplicationE.coli(单起点双方向)两复制叉的相遇处具有多个终止位点(不是复制叉简单相遇）

terE,D,AterF,C,B(22bp保守区)FBTerminusUtilizationSubstance（TUS36kd）CADETer-TUS复合体第2章-DNA的复制terE,D,A仅对反时针方向的复制叉具有终止效应

terF,C,B仅对顺时针方向的复制叉具有终止效应FBCADETer-TUS复合体(Rep.forktrap)终止DnaB(螺旋酶)防止DNA过度复制避免出现DNA多聚体，高拷贝氨基酸饥饿状态，DNA复制起始失控第2章-DNA的复制3.6.DNA复制与膜及膜蛋白的关系

第2章-DNA的复制1963．F.H.C.Jacob

(Bacillus.Subtilis)

间体（Mesosome）是DNA复制时与膜的结合位点

Mesosome第2章-DNA的复制1970．普遍性转导→复制不同步的菌体DNA

gecaobdfh

aobcaobdecaobdf第2章-DNA的复制4a,4b3c,3d2e,2f1g,1h

与间体膜结合位点两侧基因的转导频率最高

DNA与间体膜结合的位点为replicationorigin

第2章-DNA的复制1981.Annick.J.●Competitionassayinvitro

B,B’protein(MembraneBindingprotein)

5’labelingwithp32HindIIIdenatureoripCM959oriE.coli

第2章-DNA的复制取定量的S.S.pCM959DNA–p32

取不定量的S.S.E.coliDNA

定量的B,B’protein组成若干competitionassay

++

测定留在滤膜上p32-pCM959+Bproteinp32-pCM959+B’protein

进行动态分析

第2章-DNA的复制p32

B’+pCM959

B+pCM959

S.S.E.coliDNA/S.S.pCM959DNA

ratio

第2章-DNA的复制p32

B’+pCM959

ratio

第2章-DNA的复制p32

ratio

B+pCM959

第2章-DNA的复制p32

B’+pCM959

B+pCM959

S.S.E.coliDNA/S.S.pCM959DNA

ratio

结论1DNA具有与B’(12kd)蛋白专一性结合位点

第2章-DNA的复制p32

PstI(2510)(489)●competitionassay

ofdenatureS.S.DNAHinfI(3965)230ori

PstI(489)

pCM959PstI(2510)HinfI(1165)PstI

HinfI

HinfI(3965)(1165)

originorigindenature第2章-DNA的复制B’+pCM959结论2；ori区是B’蛋白的专一性的结合位点

第2章-DNA的复制P32S.S.DNAcompetitionassay●

HinfI(3965)BamHI(92)OripCM959BamHI(2191)0HindIII(244)HindIIIBamHIHinfI3965244Halfori922191Halfori第2章-DNA的复制结论3；

ori区仅有一半时与B’蛋白的专一性结合位点减少一半

第2章-DNA的复制p32

28853875S.S.DNAcompetitionassay

HinfI(3875)oriPCM959

HinfI(2885)

0PstI(489)PstI(2510)PstIHinfI4892510NoOriNoOri第2章-DNA的复制Nothing

结论4；ori区具有两个与B’蛋白专一性结合的位点（39-92）（417-489）

第2章-DNA的复制p32D.S.S.S.ori0pCM959

PstI(2510)PstI(489)PstID.S.S.S.48925102510489Ori第2章-DNA的复制Nothing结论5；DNA复制时，ori区开链并形成复制泡，

B’蛋白与暴露在S.S,DNA链上的专一性结合位点结合，启动复制进行

D.S.S.S.D.S.S.S.OriNothingNothing第2章-DNA的复制XhoIp321165417(39-92)4171165(417-489)HinfIori

pCM959

HinfI(1165)

0XhoI(417)第2章-DNA的复制

结论6；ori区与B’蛋白结合的专一性位点分别处在不同的极性单链上与B’蛋白结合后分别启动复制向两个方向进行

NothingNothingHalfOriHalfOri第2章-DNA的复制Replicationorigin3992417489

缺失任一个专一性位点导致DNA单向复制

B’B’第2章-DNA的复制3.7.

DNA的复制基因与酶类体系第2章-DNA的复制a)原核生物的复制基因与酶类

Initiategenes

dnaBprepriming300kd~20copies/cellhexamerRNApolprimaseforleadingS.dnaCactswithdnaB25kddnaGprimaseforlaggingS.60kd~25(Okazakifragment)monomerSSBBindingwithS.S.DNA74kd~300Preventsfromannealmonomer第2章-DNA的复制ElongategenesdnaEDNApolymeraseIII(α)140kd~20dnaZDNApolymeraseIII(β)52kd~20polADNApolymeraseI109kd~400polBDNApolymeraseII90-120kd~100第2章-DNA的复制Topoisomerase

topATopI(swivelase)100kdsuperhelix→D.S.helix第2章-DNA的复制Topoisomerase

gyrαTopII(gyrase)400kdgyrβD.S.helix→superhelixtetramer(ααββ)CutD.S.DNAATPLigate第2章-DNA的复制TopoisomeraserepRelaxedprotein(Helicase)D.S.DNA→S.S.DNAligLigase

HDPHelixDi-stabilizingProteinNoATPaseBindingS.S.DNAdecreaseTmPreventsfromanneal缺口酶活化(T4)(E.coli)缺口腺苷化封口连接dAMP第2章-DNA的复制b)DNA聚合酶（DNApolymerase）

PolApolBdnaEdnaZ

109kd120kd>250kd

monomer

klenowfragmentαα+EF-II

+Prokaryote

IIIIII

5’→3’elongation(dNMP)n+xdNTP→(dNMP)n+x+xppi

10dNt/sec1/10ofpolI500dNt/sec

(75,36)KornbergEββhetero-multimer第2章-DNA的复制3’→5’editing

mismatch10-810-3yes

5’→3’exonuclease

smallfragmentrepairNoNo

whendNTPstarved

3’→5’pyro-phospholysisyesyesyes

(dNMP)n+xppi→(dNMP)n-x+xdNTP

IIIIII

mutationlethallethal

第2章-DNA的复制DNApolymeraseIB;primersite

C;primerterminater

A;templatesiteD;dNTPsiteE;5’→3’repairsite

36kdE胰酶75kdABCOHpppDppppppOHOH第2章-DNA的复制DNApolymeraseIIIactivableDNApolIII

DNApolIII(holoEnzyme)

α+α(dnaE)→DNApolIII(pureEnzyme)+EF-II

730nt/sec.

invitro1000nt/sec.Invivoβ+β(dnaZco-polIII)+第2章-DNA的复制c)真核生物DNA复制的特点及聚合酶●multiplereplicon

Prok.105bp/minEuk.500-5000bp/min13-900kb/perreplicon

●DNApolα+primase(50-60kd)

6-9NtRNAasprimer

例；果蝇5000replicons受精后genomereplication/3min

Replicons扩增到50,000第2章-DNA的复制●DNApolymerase

αβγ

Maxi.polMini.polNucleiNucleimt120-300kd30-50kd150-300kdpolymerize5’→3’yesyesediting3’→5’NoNoRNAprimerNoNoNoNoDNAprimer

第2章-DNA的复制3.8.DNA复制速率及拷贝数的调控(?!)

第2章-DNA的复制a)影响因素

多种专一性的蛋白质因子浓度除引物以外的其他RNA分子（anti-RNA）营养条件（aastarved的抑制)（原核生物）细胞复制周期速率的影响（真核生物）…b)严格的自我调控机制

e.g.plasmid（parasite）independentreplicationstringenttype(1-2copies)relaxedtype(10-100copies)incompatibility(具有相同的复制机制，酶，repressor..)compatibility(具有不同的复制机制F,ColEI…)

自然选择进化适应过度复制何以求生第2章-DNA的复制30℃E.Coli+episomeF因子复制受控于E.coliO42℃FE.coli复制受控于F因子30℃F因子复制独立于E.coli

OE.Coli(ts)episome(F)FF第2章-DNA的复制c)调控主要表现在复制的起始水平上e.g.E.coli

细胞分裂周期→依营养条件变化

DNA复制周期基本保持30-40min/cycle

37℃葡萄糖（C源）45min/cellcycle

琥珀酸（C源）70min/cellcycleCstarved10hrs/cellcycle

Csuffice21min/cellcycle

第2章-DNA的复制ButDNAreplication40minmoreorlessbyprematureinitiation

orioriori第2章-DNA的复制Repressormodel

AntisenseRNAmodel

RNA-2positivecontrol

0-5550

RNA-2

RnaseHOH

RNA-2DNA/RNAprimerforDNAreplication

复制的调控e.g.ColEIplasmidNegativecontrol第2章-DNA的复制RNA-1110bp

RNaseH不能识别RNA-2,不能形成primer

的3’-OH-555

-4450RNA-2RNA-1RNA-2

110bpD.S.RNA第2章-DNA的复制RNA-10

WhenRNA-2200-360Nt

RomgeneexpressionRNA-1/RNA-2D.S.repression

RNA-1/RNA-2

不能形成primer的

3’-OH促进

限制

63aaROP(Romprotein)

RNA-2只能转录到100-220base,

不能到达“0”原点

不能形成primer

的3’-OH0第2章-DNA的复制3.9.DNA的甲基化（Methylation）

(m5CinEukaryote)

第2章-DNA的复制m5C

a)DNA中m5C的特点

●对MspI,HpaII位点的高频修饰

MspIHpaII

CmCGGCCmGG

+HNH

H4153

62ONNCH3第2章-DNA的复制●m5C的复制

●m5C的分布

含CG序列HpaIICCmGG;MspICmCGG

HhaIGCmGC;ThaICmGCmG

HeaGGCCm;PstICmTGCAG

（启动甲基化酶）（去甲基化）(保持甲基化酶)

（识别半甲基化）CmGCmGGCGCmCmGGC

CGGC

CGGC

CmG

GC

第2章-DNA的复制●Animal70%ofCGseq.PlantCNGseq.ofNucleiDNA(mtDNA,cpDNAnom5C)●EukaryoteHighrepetitiveseq.frequentm5CStructuregenerarem5CClustgenefrequentm5CExpressinggenerarem5CClosedgenefrequentm5C

(inGCislandofpromotor)第2章-DNA的复制b)Functionofm5C

细胞分化，组织特化，阶段发育，组织培养过程的脱分化

与m5C的相关性（5-氨胞苷去甲基化的作用）

m5C甲基化是生物自我保护的机制

m5C的不足基因表达相关

m5C的丰富基因关闭相关

m5C的程度具有明显的组织，细胞的特异性(时空性)

(杂种优势理论的研究……)m5C使Z-DNA在体内趋于稳定状态

第2章-DNA的复制●m5C与基因突变的关系

C→m5C→T→

genemutation(癌变)

HNH5OCGCH35HNHOOCH35O氧化脱氨m5CGT

A

第2章-DNA的复制c)Eukaryote

Repetitiveseq.highfrequentmethylated

PstIm5CTGCAGSau3AGATm5C

Singlestructuregeneraremethylated

TotalDNAdigestedbyPstIorSau3A

smere

structuregenefragmentRepetitiveseqhighfrequentmethylated第2章-DNA的复制a)1972.HerbertBoyer