第六章 微生物的遗传变异与育种课件

第六章微生物的遗传变异与育种第一节遗传变异的物质基础第二节基因突变和诱变育种第三节微生物的基因重组第四节菌种的保藏及衰退与复壮第六章-微生物的遗传变异与育种遗传（heredity,inheritance）和变异（variation）是一切生物体最基本的属性之一。从遗传学的角度看，微生物有许多重要的生物学特性：如个体简单、生长繁殖快、营养体一般为单倍体、易于人工培养、易于积累发酵产物等，因此现代生物学中研究中微生物是研究的热点。（1）遗传——是指生物的亲代的遗传信息传递给子代的特性，包括亲代的形态结构和生理生化特性在子代中重现出来。（2）变异——指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，导致性状的改变。且变化后的新性状是稳定的、可遗传的。（3）表型——是指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具有体现。所以它于遗传型不同，是一种现实性（具体性状）。（4）遗传与变异的关系：是生物体基本的属性，二者相互依存。没有遗传物种就不能延续下去；没有变异生物就不能进化，正因为生物有遗传变异这种属性，为育种工作提供了理论依据，通过遗传保持了物种的稳定性，通过变异促使产生新性状。第六章-微生物的遗传变异与育种关于遗传变异的产生的基础是什么？这个问题早在几百年前就引起了人们的注意：（1）直到19世纪，达尔文进化论的发表，推动了生物学的发展——阐明了生物是进化的，但对遗传变异的规律、机理并没有完全了解。（2）1866年，孟德尔（奥地利）提出分离法则与自由组合律，他提出遗传是通过一种“遗传因子”来实现的，此理论提出沉睡了35年，到1890年才受到重视。（3）1901年，摩尔根进一步研究果蝇的遗传规律，把“遗传因子”发展成“基因”，即决定遗传的物质基础是染色体上的基因。（4）1944年，美国学者阿维利（Avery）等，通过肺炎球菌的转化实验，确定遗传上起支配作用的化学物质成分并非是蛋白质，而是核酸，特别是DNA。（5）1952年，侯喜（Hershey）和蔡斯(chase)利用同位素示踪，对大肠杆菌T2噬菌体的感染实验，证实了DNA是遗传物质的基础。（6）1956年，弗朗克康勒脱（Fraenkel-Conrat）等，利用植物病毒的拆开和重建实验，证实了RNA是病毒的遗传基础。第六章-微生物的遗传变异与育种第一节遗传变异的物质基础

一、3个经典的实验：证明DNA才是一切生物遗传变异的真正物质基础。1经典的转化实验：英国医生1928年首次发现，F.Griffith作了以下3组实验：（1）动物实验：S型菌落属致病菌；R型菌落是非致病菌。

加入活R菌或死S菌小白鼠（活）

小白鼠（活）加入活S菌小白鼠（死）

加入活R菌和热死S菌小白鼠（死）活的S菌（2）细菌培养实验：热死S菌培养皿培养不生长肺炎链球菌活R菌培养皿培养长出R菌热死S菌+活R菌培养皿培养长出大量R菌+10-6S菌第六章-微生物的遗传变异与育种第六章-微生物的遗传变异与育种（3）S型菌的无细胞抽提液实验：活R菌+S菌的无细胞抽提液培养长出大量R菌和少量S菌以上实验证明了加热杀死的S型细菌，在细胞内可能存在一种具有遗传转化能力的物质，它能通过某种方式进入R型细菌，并使R型细菌获得表达S型荚膜性状的遗传特性。提取证明转化因子（1）从活的S型细菌中抽提各种细胞成分（DNA、蛋白质、荚膜多糖）（2）对各种生化组分进行转化实验加S型菌的DNA长出S型菌加S型菌的DNA和DNA酶以外的酶活R菌加S型菌的DNA和DNA酶加S型菌的RNA

加S型菌的蛋白质只长R型菌加S型菌的荚膜多糖实验证明RNA、蛋白质、荚膜多糖均不能引起转化，而DNA能引起转化。第六章-微生物的遗传变异与育种分别用降解DNA、RNA、蛋白质的酶类

作用于有毒的S型菌细胞抽提物第六章-微生物的遗传变异与育种二、噬菌体的感染实验：1952年A.D.Hershey和M.Chase发表了证实DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验——噬菌体感染实验。

离心

吸附

沉淀细胞进一步培养后

上清液含15%放射性可产生大量完整的子代噬菌体沉淀中含85%放射性用噬菌体的DNA标记上放射性元素32P大肠杆菌、噬菌体的DNA标记上放射性元素32P、噬菌体的蛋白质衣壳标记上放射性元素35S第六章-微生物的遗传变异与育种用含35S-蛋白质外壳的噬菌体作感染实验：

离心

沉淀细胞进一步培养后，上清液中含75%放射性可产生大量完整的子代噬菌体沉淀中含25%放射性实验证明了在DNA中，存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。

第六章-微生物的遗传变异与育种噬菌体的感染实验第六章-微生物的遗传变异与育种第六章-微生物的遗传变异与育种三、植物病毒的重组实验：核酸才是遗传物质以上三个实验证明了只有核酸才是遗传物质的基础。四、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式：（1）细胞水平：一些霉菌、放线菌的菌丝是多核，孢子为单核。原核生物的细胞中含有质粒，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的双链DNA分子。（2）细胞核：真核生物细胞核DNA+组蛋白形成染色体；原核生物的细胞核的DNA是环状双链结构，不与组蛋白结合。（3）染色体水平：不同生物的染色体数目差异较大。（4）核酸水平：大多数生物的遗传物质是DNA，只有少数病毒如多数的植物病毒是RNA，真核生物中DNA总是与组蛋白结合的；原核生物的DNA是单独存在的。（5）基因水平：基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位。众多的基因构成了染色体。（6）密码子水平：4个核苷酸可有64种组合，编码20个氨基酸，UAA、UAG和UGA为终止密码。（7）核苷酸水平：A、T、G、C。第六章-微生物的遗传变异与育种五、DNA的结构和复制：1DNA的结构：2DNA的复制：半保留、半不连续复制。第六章-微生物的遗传变异与育种质粒（plasmid）一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。第六章-微生物的遗传变异与育种第二节基因突变和诱变育种

1突变的类型：一按突变涉及的范围，可分为基因突变和染色体畸变。

(1)基因突变：指细胞内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。（2）染色体畸变：广义的突变包括基因突变和染色体畸变。染色体畸变一般指染色体的数目不变化，但染色体上有较大范围结构改变，如DNA（RNA）的片段缺失、重复、易位等。发生在染色体畸变的微生物往往易致死，因此微生物中突变类型的研究主要在基因突变方面。二按突变所致的表型改变，突变划分为：（1）形态突变型：突变后导致菌体的形态发生变化，如细胞形态、菌落形态、孢子的颜色等的变化，鞭毛、荚膜的有无，菌落的R型或S型的变化。（2）致死突变型：指由于基因突变导致个体死亡的突变类型。如导致个体生活力下降称为半致死突变型。（3）条件致死突变型：指微生物基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并表现其固有的表型，而在另一种条件下无法生长繁殖，这种突变类型称为条件致死突变型。第六章-微生物的遗传变异与育种基因的突变第六章-微生物的遗传变异与育种（4）营养缺陷突变型：某些野生型菌株发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷型。（5）抗性突变型：某些野生型菌株发生基因突变，而产生的对某种化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。它们可在加有相应药物或用相应物理因子处理的培养基平板上选出。抗性突变型普遍存在，例如对一些抗生素具有抗药性的菌株等。抗性突变型的菌株在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中，极其重要。（6）抗原突变型：指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，包括细胞壁缺陷变异（L型细菌等）、荚膜或鞭毛成分变异等，一般也属非选择性突变。（7）产量突变型：通过基因的突变导致代谢产物产量上与原始菌株有明显的差异，称产量突变型。如果产量高于原始菌株，称正变菌株，相反，称负变菌株。三按突变的条件和原因分，突变分为自发突变和诱变。（1）自发突变：由于自然界中存在的辐射因素和环境诱变剂所致。第六章-微生物的遗传变异与育种A微生物的代谢产物具有诱变作用：如H2O2、咖啡碱、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氮丝氨酸等等。H2O2对脉孢菌有诱变作用，如果同时加入H2O2酶抑制剂，则可提高诱变效果，说明H2O2有可能是引起自发突变的一种内源诱变剂。B互变异构效应：由于DNA分子中的四种核苷酸分子内部稀醇式（T、G）和酮式互变；胞嘧啶和腺嘌呤（C、A）分子中氨基式和亚氨基式互变；导致复制时错配，是引起自发突变的原因。自发突变的频率是很低的，一般在10-6-10-10。（2）诱变的机制：①诱变的机理：诱变剂引起DNA分子的结构发生碱基对的置换、移码突变、染色体畸变等变化。A碱基对的置换：指DNA分子中一对碱基被另一对碱基所置换；或发生了颠换。一般由化学诱变剂引起。B移码突变：由于DNA分子中一对或几对核苷酸的增加或缺失而造成的基因突变。导致翻译出的蛋白质发生变化。C染色体畸变：DNA分子出现较大损伤的诱变，出现染色体的结构的异位、倒位、缺失、重复等。物理和化学因素均可导致此变化。第六章-微生物的遗传变异与育种②诱变剂的种类：分为物理性的诱变剂和化学性的诱变剂。A物理性的诱变剂：有紫外线、X射线、γ射线等射线。在诱变育种工作中最常用的是紫外线。紫外线杀菌的机理是形成DNA双链间形成嘌呤嘧啶二聚体，DNA双链的二聚体妨碍双链的解开，影响复制和转录，使细胞死亡。如果是形成同链间嘧啶二聚体无双链的氢键作用，只引起DNA双链的扭曲变形，阻碍碱基正常的配对，从而引起突变或死亡。B化学性的诱变剂：烷化剂、亚硝酸和羟胺。烷化剂是诱变工作中重要的一类诱变剂，如硫酸二乙酯（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（NG）、N-亚硝基-N-甲基-氨基甲酸乙酯（NMU）、环氧乙酸（EO）、氮芥（NM）等，这些物质的烷化磷酸基、烷化嘌呤和烷化嘧啶与DNA作用，导致DNA突变，烷化剂还能引起染色体畸变。2微生物对紫外线损伤后的DNA的修复：（1）光复活作用：紫外线照射后的DNA暴露于可见光下，可明显降低其死亡率的现象称为光复活作用。（2）切除修复作用：也称暗修复作用，这种修复作用与光无关，第六章-微生物的遗传变异与育种是在4种酶的协同作用下进行的将核酸损伤处切开形成单链缺口，去除二聚体，合成新的链，在连接成完整的链。（3）重组修复作用：即是复制后修复。

解链复制后经过染色体交换，使子链上的空隙部位不再面对二聚体，而是面对正常的链，这时DNA聚合酶和连接酶便能起作用，把空隙部分进行修复。（4）SOS修复：这是在DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。SOS修复需要修复基因：recA、lexA、uvrA、uvrB和uvrC。3微生物的突变与育种：（1）诱变育种的基本环节：（2）诱变育种的几个原则：艾姆氏实验检测食品中“三致”物质的第六章-微生物的遗传变异与育种美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验

菌种：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率。第六章-微生物的遗传变异与育种的方法和原理：菌种-鼠伤寒沙门氏菌，是组氨酸营养缺陷型，在基本培养基平板上不生长，如果发生回复突变成原养型后则能生长。该方法用于检测食品中的黄曲霉毒素、二甲氨基偶氮苯（奶油黄）、二恶英，加入鼠肝匀浆液，保温一段时间，吸入纸片中将纸片在平板培养基中培养。

[-]+S.t.his-待检测食品鼠肝匀浆液保温吸入滤纸片

[-]+S.t.his+

阳性阴性实验广泛用于食品、饮料、药物、饮水和环境等样品中致癌物的检测，此法的特点：快速、准确、节约，一般3天出结果，符合率在85%左右。说明样品中有大量的诱变剂第六章-微生物的遗传变异与育种第三节微生物基因重组基因重组是在核酸分子水平上的一个概念，是遗传物质在分子水平上的杂交，因此与一般细胞水平上进行的杂交有明显区别；细胞水平上的杂交，必然包含了分子水平上的重组，例如真核微生物中的有性杂交、准性杂交、原生质体融合以及原核生物中的转化、转导、结合和原生质体融合等。一、原核生物的基因重组：原核生物的基因重组形式很多，机制较原始，特点为：①片段性，仅一小段DNA序列参与重组；②单向性，即从供体菌向受体菌作单方向转移；③转移机制独特而多样，如结合、转化、转导和溶源性转变等。1转化：是指受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。转化后的受体菌叫转化子，供体菌的DNA片段称为转化因子，通常呈质粒状态的转化因子转化频率最高，受体菌只有在感受态的情况下才能吸收转化因子。第六章-微生物的遗传变异与育种供体菌受体菌(转化子)DNA片段(转化因子)

通常呈质粒状态的转化因子转化频率最高，受体菌只有在感受态的情况下才能吸收转化因子。第六章-微生物的遗传变异与育种原核微生物的基因转移和重组细菌的三种水平基因转移形式：1接合2转导3自然转化第六章-微生物的遗传变异与育种转化过程：供体菌基因组（模板），PCR扩增目的基因dsDNA受体菌制成感受态细胞与质粒连接单链进入另一条链降解同源区配对重组

杂合子复制原核生物中转化是一种比较普遍的现象，许多细菌、放线菌和蓝细菌均可发生转化现象。第六章-微生物的遗传变异与育种T7ApaⅠAatⅡSphⅠBstZⅠNcoⅠBstZⅠNotⅠSacⅡEcoRⅠSpeⅠEcoRⅠNotⅠBstZⅠPstⅠSalⅠNdeⅠSacⅠBstXⅠNsiⅠSP601start14202631374343495264707777889097109118127141NaeⅠ2707XmnⅠ2009ScaⅠ1890f1orilacZAmprPGEM®-TEasyVector(3015bp)ori图6－1pGEM－T载体结构Figure6－1.pGEM®-TEasyVectorcirclemapandsequencereferencepoints.第六章-微生物的遗传变异与育种第六章-微生物的遗传变异与育种微生物的自然遗传转化-简称自然转化1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）的转化现象目前已有二十多个种细菌具有自然转化的能力进行自然转化，需要以下必要的条件：1建立感受态的受体细胞2外源游离DNA分子第六章-微生物的遗传变异与育种枯草芽孢杆菌的自然转化过程第六章-微生物的遗传变异与育种2转导：是以噬菌体为媒介，把一个菌株的遗传物质（小片段DNA）导入另一个菌株，并使这个菌株获得另一个菌株的遗传性状。转导由分为普遍性转导和特异性转导。普遍性转导：指转导型噬菌体能传递供体菌株任何基因。特异性转导：指噬菌体只能转导供体染色体上某些特定的基因。3接合：是通过供体菌和受体菌的直接接触传递遗传物质。接合有时称为杂交。接合不仅存在于大肠杆菌中，其它细菌中也存在。例如大肠杆菌的接合与细菌表面的性纤毛有关，F因子是接合的关键，F因子又叫致育因子，是一种质粒。根据F质粒在细胞内的存在方式的不同，大肠杆菌有3种不同接合型菌株：（1）F+XF-：

F+雄性菌株，细胞内存在质粒F-雌性菌株，细胞内无质粒

F+质粒进入转入F-菌株中两者都成为F+菌，转性别频率近100%F+♂F-♀第六章-微生物的遗传变异与育种局限性的转导溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上；把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中第六章-微生物的遗传变异与育种普遍性的转导形成转导颗粒的噬菌体可是温和的；也可是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的装配机理，并在宿主基因组完全降解以前进行装配。第六章-微生物的遗传变异与育种鼠伤寒沙门氏菌的普遍性转导

第六章-微生物的遗传变异与育种（2）F’×F-：F’游离的、但携带整合位点邻近小段核染色体基因的特殊F质粒也成为F’菌株，以F’质粒来传递供体基因的方式，称为F质粒转导（3）Hfr菌株(高频重组菌株highfreguencyrecombinationstrain)Hfr菌株，F质粒整合在核染色体特定部位，接合时断裂成线状片段DNA通过性菌毛转移到F-

接合后，基因重组频率非常高F-♀F’♂F-♀第六章-微生物的遗传变异与育种细菌的结合是通过细胞与细胞的直接接触产生的遗传信息的转移和重组过程；在1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验证实第六章-微生物的遗传变异与育种第六章-微生物的遗传变异与育种4溶源性转变：温和噬菌体感染其宿主发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上，而使宿主获得了除免疫外的新遗传性状的现象，称溶源转变。表面上与转导相似，但是与转导有本质的不同。溶源性转变的特点：①这是一种不携带任何外源基因的普通噬菌体；②由噬菌体的基因而不是供体菌的基因提供的宿主新性状；③新性状是宿主细胞溶源化时的表型，而不是经遗传重组形成的稳定转导子；④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失；噬菌体的基因重组：温和性噬菌体——烈性噬菌体——第六章-微生物的遗传变异与育种总结自然遗传转化(naturalgenetictransformation)——需要游离DNA分子片段+感受态细胞；转导(transduction)——由噬菌体介导；接合(conjugation)——细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）；第六章-微生物的遗传变异与育种二、真核基因的重组：真核基因的重组的方式很多，有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化。1有性杂交：指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，产生新遗传型后代的一种育种技术。理论上看凡是能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌，原则上都可与高等的动植物杂交育种。2准性杂交：类似于有性生殖，但是更为原始的两性生殖方式，这是一种在同种但不同菌株的体细胞间发生的融合，它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。因此，可认为准性生殖是在自然的条件下，真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质融合现象。某些真菌发现不具典型有性生殖的常常进行准性杂交，尤其是构巢曲霉中最多。具体过程有4步：略微生物的菌种选育、诱变育种：在食品生物技术中讲授。第六章-微生物的遗传变异与育种酵母菌的有性杂交酵母菌的生活史既包括二倍体、单倍体世代，又包括有性和无性世代。二倍体单倍体第六章-微生物的遗传变异与育种霉菌的繁殖霉菌的基因重组可通过有性生殖或准性生殖过程来完成。准性生殖是指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程异核体的形成、二倍体的形成以及体细胞交换和单倍体化第六章-微生物的遗传变异与育种真核微生物的有性杂交第六章-微生物的遗传变异与育种霉菌的有性繁殖——有性孢子繁殖1、质配：两个性细胞发生结合，细胞质融合，成为双核细胞，每个核均含单倍染色体（n+n）。2、核配：两个核融合，成为二倍体接合子核，此时核的染色体数是二倍（2n）。3、减数分裂：具有双倍体的细胞核经过减数分裂，核中的染色体数目又恢复到单倍体状态。第六章-微生物的遗传变异与育种霉菌的准性杂交第六章-微生物的遗传变异与育种准性杂交与有性杂交的对比第六章-微生物的遗传变异与育种第四节菌种的保藏及衰退与复壮要选育一株合乎生产上要求的菌株并非容易，而要使菌种在生产上长期保持优良性状更难，为此，要做许多工作使菌种不死、不衰、不污染。但要使菌种永远不变是不可能的，由于菌种存在着自发性的低频率变异，以及各种诱变因素的作用，菌种退化是一种潜在的威胁，为了延缓菌种的变异，人类研究保藏菌种的方法，许多国家设立了菌种保藏机构。第六章-微生物的遗传变异与育种菌种保藏的目的

目的：

①延续物种，不丢失，不污染

②防止优良性状退化

③为生产、科学研究提供优良性状菌种

第六章-微生物的遗传变异与育种1菌种保藏的机理：无论哪种保藏方法，主要是使微生物处于不活泼的休眠状态，因此要求低温、干燥、缺氧条件，在这样环境中菌种很少发生突变达到纯种的目的。2微生物菌种保藏的方法（1）斜面保藏法：（2）半固体保藏法：（3）矿物油保藏法：（4）干燥载体保藏法（沙土管保藏法）：（5）真空冷冻保藏法：（6）冷冻保藏法：（7）国外菌种保藏机构：第六章-微生物的遗传变异与育种菌种保藏的方法

菌连续在培养基上（内）移种种生活态传代培养保藏法连续在活宿主上（内）移种保固体斜面藏湿法半固体琼脂柱方休眠态液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管内吸附在合适的载体上第六章-微生物的遗传变异与育种表5-常用菌种保藏方法的比较方法保藏机理适用范围保藏时间特点半固体保藏法斜面保藏法矿物油保藏法沙土管保藏法真空冻干保藏法超冷冻保藏法液氮保藏法低温、（4℃）缺氧低温（4℃）低温（4℃）、阻氧干燥、无营养干燥、无氧、低温（-90℃）、有保护剂超低温（-70℃~-80℃）20%甘油、10%的二甲基亚砜超低温（-196℃）、有保护剂细菌、酵母菌各大类各大类（不能利用石油）产孢子的微生物各大类各大类各大类约6-12月约1-6月约1-2年约1-10年﹥5-10年5年﹥15年方法简单方法简单方法简单方法简单烦琐高效烦琐高效烦琐高效第六章-微生物的遗传变异与育种斜面接种无菌操作程序

第六章-微生物的遗传变异与育种半固体穿刺接种方法第六章-微生物的遗传变异与育种沙土管保藏法选中等细度沙清洗酸洗中性烘干灭菌加微生物孢子

干燥

封瓶口

第六章-微生物的遗传变异与育种

真空冻干保藏法高密度细胞培养离心洗涤加保护剂真空冷冻干燥包装封口第六章-微生物的遗传变异与育种超低温冷冻保藏法超低温（-70℃~-80℃）20%甘油、10%的二甲基亚砜高密度细胞培养离心洗涤加保护剂分装封口真空超低温冷冻第六章-微生物的遗传变异与育种

冷冻保藏的关键技术：快速冷冻，使用冷冻保藏的菌种时要快速融解；在35-40℃的温水中进行。剩余的菌种不可再次冷冻。第六章-微生物的遗传变异与育种生产上的其他保藏方法曲料干燥保藏法：取麸皮或米糠加水灭菌后，接种菌种，培养干燥后保藏。冻结保藏法：生长在斜面上的菌株或液体培养液，加入保护剂后直接冷冻，保藏温度越低越好。该法用于放线菌的保藏较好。第六章-微生物的遗传变异与育种生产种曲-醪糟第六章-微生物的遗传变异与育种菌种传代过程中应注意的关键问题菌种的遗传变异；发生菌种的编号、菌名称等事故；产酸菌种传代时培养基中加入碳酸钙可取得良好的保藏效果；防止菌种污染；第六章-微生物的遗传变异与育种棉塞的处理方法斜面培养基的斜面不能太高；微生物在培养基中生长时：用10滴40%的甲醛溶液滴加在棉塞上端，微生物完全生长好后，用液体石蜡封口，可防止污染；将消毒剂对二氯苯或杀虫剂加在棉塞的底部第六章-微生物的遗传变异与育种国内外菌种保藏机构ATCC美国菌种保藏机构IFO日本大板发酵研究所JAM东京大学应用微生物研究所NCTC英国国家典型菌种保藏所CBS荷兰真菌中心保藏所IPL法国里昂巴斯德研究所RKI德国科赫研究所DSM德国菌种保藏中心CCCCM中国微生物菌种保藏管理委员会CMI英联邦真菌研究所第六章-微生物的遗传变异与育种中国微生物菌种保藏管理委员会CCGMC普通微生物菌种保藏管理委员会（北京）AS-IV中国科学院武汉病毒研究所（武汉）ACCC农业微生物菌种保藏管理中心（北京）CICC工业微生物菌种保藏管理中心（北京）IFFI中国食品发酵工业科学研究所（北京）CMCC医学微生物菌种保藏管理中心（北京）ID中国医学科学院皮肤病研究所（南京）NICPBP卫生部药品生物制品检定所（北京）CACC抗生素菌种保藏管理中心（北京）CACC四川抗生素工业研究所（成都）IANP华北制药厂抗生素研究所（石家庄）CVCC兽医微生物菌种保藏管理中心（北京）CIVBP农业部兽医药品检察所（北京）第六章-微生物的遗传变异与育种国内外菌种保藏方法国外的保藏方法：真空冷冻保藏法（5-15年）和液氮保藏法（20年）。

当年10年15年20年25年分发用液氮保藏（原种）第六章-微生物的遗传变异与育种

连续在培养基上移种生活态——传代培养保藏法连续在活的宿主内移种滴入小试管藏在玻璃管内菌液真空干燥法封入安瓿冷冻真空干燥法干法

土壤、沙粒菌种保藏法细粒状载体土壤+沙粒吸附在合适球块状的载体硅胶的载体上瓷球薄块状的载体滤纸片、明胶小片血清蛋白小片休眠态曲料、麦粒有机基质棉纤维湿法固体斜面、半固体琼脂柱液体介质：蒸馏水、甘油（40%）、糖液、其他悬液第六章-微生物的遗传变异与育种2菌种的衰退与复壮：在生物进化的长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性则是相对的；退化性的变异是大量的，而进化性的变异是个别的。在自然的条件下，个别的适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向；在人为条件下，人们也可通过人工选择法有意识地筛选出个别的正变体，并用于生产中。如果不进行人工选择，不进行纯化、复壮和育种，大量的自发突变菌株就会随之泛滥，导致菌种的优良性状衰退，生产上出现生长慢、代谢产物产量低等。（1）衰退的表现：①生长缓慢：生长的速度下降，达到对数期在平板上看不到菌落，或菌落小，液体培养浑浊度低；②原有的形态发生变化，不典型；③代谢产物的能力下降；④抗不良环境的能力下降：如高温、低温、噬菌体；⑤侵染力下降：（2）衰退的防止：第六章-微生物的遗传变异与育种①控制传代的次数：尽量减少传代次数，将必要的传代次数降低到最低限度，以减少发生突变的几率；同时采用良好的菌种保藏方法也是防止衰退的有效措施；②创造良好的培养条件：提供菌种营养丰富的培养基，就能在一定程度上防止衰退；如在赤霉菌生长的培养基中加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5′-核苷酸有防止衰退的效果；③利用不同类型的细胞进行传代接种：在放线菌和霉菌中，菌丝细胞常含几个细胞核，甚至是由异核体组成，如果用菌丝接种就会出现衰退，而孢子一般是单核，因此用孢子接种衰退的几率小得多；④采用有效的菌种保藏方法：发酵工业中用的菌种，重要的性状大多属于数量性状，而这类性状是最易衰退的，因此要采用科学的菌种保藏方法。（3）菌种的复壮：①纯种分离方法：通过该方法可把退化菌种的细胞群体中仍然保持原有典型性状的个体挑选出来，达到复壮的目的。方法如图解：第六章-微生物的遗传变异与育种

平板表面涂布法菌落纯平板划线分离法纯种分离法琼脂培养基混菌法用“分离小室”进行单细胞分离细胞纯用显微操纵器进行单细胞分离用菌丝尖刀切割法进行进行单细胞分离②通过宿主体复壮：③淘汰已衰退的个体：采用不良的条件处理微生物，如低温、高温等5-7天，使微生物80%发生死亡，然后挑选出没有死亡而保持优良性状的个体达到复壮。第六章-微生物的遗传变异与育种第六章-微生物的遗传变异与育种测验一名称解释：转化有性杂交转导质粒表型二填空1.基因点突变包括——、——、——。2.光复活作用————。三问答题1.叙述艾姆氏（Ames）实验方法检测食品中致癌物的方法原理。第六章-微生物的遗传变异与育种第七章微生物的生态第一节微生物在自然界中的分布与菌种资源的开发第二节微生物与生物环境间的关系第三节微生物在生态中的作用第四节微生物与环境保护第六章-微生物的遗传变异与育种微生物生态学（microorganismecology

）：是研究微生物群体―微生物区系（microflora）或菌群（normalflora）对其周围的生物和非生物环境条件相互作用关系的科学。

各种环境中的微生物的种类、分布；微生物和其它生物的关系；微生物与物质循环；微生物与污染的治理第六章-微生物的遗传变异与育种分子水平亚细胞水平细胞水平个体水平种群水平群落水平生态系统生物圈第六章-微生物的遗传变异与育种研究生态学的意义生态学研究范围：生物圈（biosphere）、生态系统（ecosystem）、群落（community）、种群（population）。研究意义：1、在理论方面的意义：研究微生物与生物圈的关系2、在实践方面的意义：为生态环境中的菌种资源开发、有害微生物的防治、微生物农药的开发、菌肥的开发提高土壤肥力、食品工业中的混菌发酵、生态农业，工业中探矿、冶金、环保、以及开发生物能等。第六章-微生物的遗传变异与育种概念生物圈：是指地球上的所有生物的总称。生态系统：生物群落与其环境相互结合、相互作用、相调控而成的动态系统叫生态系统。群落：相同生长环境中两个以上种群的生物由于生活繁殖上的连锁而构成相互依赖、相互制约的生态学功能单位叫群落。种群：相同生长环境中的同种个体组成的能繁殖的同种个体群，是组成群落的基本组分，与同种其他地方的种群有隔离、有界限。第六章-微生物的遗传变异与育种微生物生态学—是生态学的一个分支，它的研究对象是微生物群体与其周围生物和非生物环境条件间相互作用规律的科学。教学目标:要求同学们掌握微生物的分布规律科学有利于发掘菌种资源；有利于食品工业中有目的地控制食品安全性；重点掌握微生物与他种生物间的相互关系（互生、共生、拮抗、寄生），并为食品工业中发展混菌发酵，生产出优质美味食品做贡献；了解微生物在生态中作用，为农业以及动物、植物病虫害的防止提供理论依据；了解微生物在治理环境污染、促进大自然的生态平衡的作用；

第六章-微生物的遗传变异与育种第一节微生物在自然界中的分布与

菌种资源的开发土壤中的微生物水中的微生物空气中的微生物生物体带的微生物极端环境中的微生物工农业产品中的微生物目前未能培养的微生物第六章-微生物的遗传变异与育种微生物的特点：个体微小、代谢营养类型多样，适应能力强微生物在自然界中分布广泛微生物的分布生态环境的特征微生物的分布是生态环境各种物理、化学、生物因素对微生物的限制、选择的结果。第六章-微生物的遗传变异与育种一、土壤中的微生物碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。土壤是微生物的“大本营”，是丰富的菌种资源库。土壤中微生物的数量和种类较多，每克土壤含菌量有一个大致的规律：土壤中微生物的数量：按种类递减细菌——放线菌——霉菌——酵母菌——藻类——原生动物~108 ~107 ~106 ~105 ~104 ~103个/g细菌（~108）>放线菌（~107孢子）>霉菌（~106孢子）>酵母菌（~105）>藻类（~104）>原生动物（~103）耕作土壤中，细菌湿重约90~225kg；以土壤有机质含量为2%计算，则所含细菌干重约为土壤有机质的1%左右。土壤微生物的代谢活动，可改变土壤的理化性质，进行物质转化，因此，土壤微生物是构成土壤肥力的重要因素。若按生物量计算则各种微生物的生物量基本相当。第六章-微生物的遗传变异与育种规律：土壤中微生物的含量与土壤有机质含量有直接关系。1.表层耕作土中含量最高，耕作层厚度20~30cm，地表土受阳光直接照射，其中微生物含量较低。2.采取土样时一般要刮开表土2~5cm后采样。第六章-微生物的遗传变异与育种1.肉毒梭状芽孢杆菌A型和B型的天然生存环境是土壤，导致罐头腐败变质的平酸菌嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌在土壤中也存在。2.土壤中的微生物对食品原料的污染：土壤中的各种细菌、酵母菌、霉菌是随着种植业收获期污染原料带入食品加工企业的。食品安全全程控制：原料餐桌GAP、GMP、HACCP、ISO、QS等第六章-微生物的遗传变异与育种二、水体中的微生物地面水清洁度低地下水清洁度高特殊水极不清洁第六章-微生物的遗传变异与育种（1）地面水：地面水的含菌量与土壤密切相关，含菌量比地下水多，有细菌、病毒、真菌、藻类、钩端螺旋体、原虫。细菌的种类几乎涉及所有的纲目。清水中化能自养微生物为主，如硫细菌、铁细菌和含光合色素的蓝细菌、绿硫细菌和紫细菌等，如水体中含有生活污水，以腐生型的微生物较多，如变形杆菌属、产气肠杆菌、产碱杆菌属、芽孢杆菌属、弧菌属、螺菌属等，同时有致病菌如志贺氏菌属、大肠埃希菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、结核杆菌、空肠弯曲杆菌、钩端螺旋体等。（2）地下水：地下水由于土壤的过滤作用，营养成分相对较少，细菌比地面水少，主要是G-的无芽孢杆菌，特别是无色杆菌和黄杆菌属，少数G+杆菌、微球菌、棒状杆菌、分枝杆菌等。（3）高温的温泉：泉水中含有铁细菌，高温的温泉分布有耐热的微生物。（4）特殊水体中：如医院污水、实验室污水，尤其是没有污水处理的小的医院，在污水中分离到伤寒、副伤寒、其他沙门氏菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌等。第六章-微生物的遗传变异与育种（5）海水：含盐量：3.5%，密度大、渗透压高、冰点低微生物种类：多数为革兰氏阴性菌、多嗜盐、河口处有耐盐菌，嗜盐菌：低嗜盐菌，适于生活在盐浓度2～5%； 中等嗜盐菌，适于生活在盐浓度5～20%； 高嗜盐菌：适于生活在盐浓度20～30%形态：多有鞭毛，常见多形性、可变为球形、弧形、丝状及螺旋状，个体小；生理：多嗜冷，兼性厌氧，生长慢，能在低营养下生活，常产色素，分解蛋白质能力强，对糖的分解能力低，多嗜冷，对热敏感；分布：不均匀，与水深成反比，

0~10米——少

10~50米——呈上升变化

50米以下数量减少常见菌种：假单孢菌、弧菌、螺菌、无色杆菌、黄杆菌

第六章-微生物的遗传变异与育种（6）生活饮用水的卫生学指标：（A）细菌总数：<100个/ml，反应出水的污染程度，细菌总数越多，说明水中的有机物及其分解产物含量越多。10~100为最清洁水；100~1000为清洁水；1000~10000不太清洁水；10000~100000不清洁水；>100000的为极不清洁水。(B)大肠菌群：<3个/立升第六章-微生物的遗传变异与育种水对食品的污染：水污染食品原料；污染食品加工的机械设备；水的卫生程度直接关系到食品的安全性。第六章-微生物的遗传变异与育种水的富营养化藻类等过量生长，产生大量的有机物异养微生物氧化这些有机物，耗尽水中的氧，使厌氧菌开始大量生长和代谢分解含硫化合物，产生H2S，从而导致水有难闻的气味，鱼和好氧微生物大量死亡，水体出现大量沉淀物和异常颜色水体的富营养化作用和“水花”、“赤潮”第六章-微生物的遗传变异与育种上述过程又称富营养化作用，它是水体受到污染并使水体自身的正常生态失去平衡的结果。“水花”或“水华”（waterbloom）：藻类（主要是微藻）的大量繁殖使水体出现颜色，并变得浑浊，许多藻类团块漂浮在水面上形成。第六章-微生物的遗传变异与育种赤潮或红潮（redtides）

在海洋中，某些甲藻类大量繁殖也可也可以形成水花，从而使海水出现红色或褐色。引起水体富营养化的藻类除通过消耗水中的氧气危害养殖业外，很多藻类还能产生各种毒素，使动物得病或死亡，因此由于富营养化作用致死的鱼等水产品不能食用第六章-微生物的遗传变异与育种三、空气中的微生物空气的自然条件：无营养和水分、紫外线直射1微生物存在方式：漂浮，短暂停留，吸附在尘埃微粒上。空气中的尘埃颗粒数量与微生物数量呈正相关。2分布：接近越地面空气中含菌量越高，目前能够检测到微生物存在最高处为85km的空间高度。3种类：细菌、真菌孢子、微球菌、产芽孢和不产芽孢的G+杆菌、G+球菌和G-杆菌；真菌中主要是芽枝霉菌、交链孢霉属、出芽茁霉属、青霉属、曲霉属、葡萄孢霉属等，同时含有病毒。4空气中微生物数量的测定方法：培养皿沉降法、液体阻留法5空气中的微生物除去方法：紫外线照射、甲醛熏蒸、药物喷雾、过滤除菌等，常用的过滤介质有棉花、纱布、石棉滤板、活性炭或超细玻璃纤维过滤纸等。第六章-微生物的遗传变异与育种（1）在森林、高山、高空、海洋和终年积雪地带的上空：微生物的数量少；（2）在城市中心、医院、车站、码头等人口流动大的地方上空：微生物的数量多。（3）空气中微生物的检测方法：沉降平板法。食品加工厂建厂原则：要远离闹市区，垃圾处理场、化工厂、厕所。第六章-微生物的遗传变异与育种四、食品工业的原料上的微生物粮食、水果、蔬菜：各种农产品上存在着大量的微生物，由此引起霉腐，严重的致病（真菌毒素）黄曲霉素、伏马菌素等。每年全球粮食因霉腐烂的达总产量的2%。鲜乳原料：有细菌、酵母和霉菌，以细菌，如乳酸菌、丁酸菌、丙酸杆菌、大肠杆菌、甚至致病菌等。鲜肉：也带有微生物，如假单胞菌、产碱杆菌、黄杆菌、无色杆菌等。鲜蛋：鲜蛋内基本上是无菌的，极少数细菌和病毒可以侵入卵内，蛋壳外有大量的菌。第六章-微生物的遗传变异与育种五、生物体内外的微生物鼠类、蟑螂、昆虫：带有大量的微生物，甚至带有致病菌、腐败菌；人体内外均有各种微生物：皮肤、口腔、鼻腔、消化道等存在大量的微生物，因此要注意在食品加工环节防止污染；健康牛的乳房存在的微生物很少，疾病期间带菌多；如葡萄球菌和大肠杆菌等。第六章-微生物的遗传变异与育种六、极端环境中的微生物1、嗜热微生物2、嗜冷微生物3、嗜酸微生物4、嗜碱微生物5、嗜盐微生物6、嗜压微生物第六章-微生物的遗传变异与育种未能培养的微生物第六章-微生物的遗传变异与育种未能培养微生物研究的目的意义1了解生物基因多态性和系统发生的多样性；2寻找新的有益微生物；3从不可培养微生物中寻找新的基因据报道，美国recombianantbiocatalysisInc公司目前已从不可培养微生物中获得了约300个与工业生产相关的新蛋白第六章-微生物的遗传变异与育种研究方法：1从环境中直接取样并克隆rRNA并分析其序列和在分子进化树上的位置等方法而发现的的目前尚不能在人工条件下获得培养的微生物。2利用特异性rRNA探针进行荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH），或进行原位PCR（InSituPCR）后再进行荧光原位杂交的技术对环境中的这些不可培养微生物进行定位、计数和进行形态观察。第六章-微生物的遗传变异与育种第二节微生物与生物环境的关系一互生—两种可单独生活的生物，当他们在一起时，各自的代谢活动有利于对方，或偏利于一方的生活方式，称为互生（metabiosis）。1微生物间的互生关系：（1）保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌二者为良好的互生关系：保加利亚乳杆菌乳蛋白缬氨酸、甘氨酸、组氨酸嗜热乳链球菌生长甲酸（保加利亚乳杆菌）土壤中好氧性自生固氮菌与纤维素分解菌生活在一起时，纤维素分解菌降解纤维素产生有机酸，可为自生固氮菌提供营养，自生固氮菌为纤维素分解菌提供氮素营养。第六章-微生物的遗传变异与育种（2）需氧菌和厌氧菌的互生关系：（3）互生现象与发酵工业中的混菌发酵：2微生物与人体的互生关系：微生态制剂——含有益菌的活菌制剂，功能是维持宿主的微生态平衡、调整宿主的微生态失调，并有保健功能，又叫益生菌剂。固体：乳酶生、妈米爱、菲尔康等。液体：含嗜酸乳酸菌、双歧杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等。第六章-微生物的遗传变异与育种金黄色葡萄球菌的生长为本来在平板上不能生长的嗜血

流感菌提供生长因子，后者在其菌苔周围形成卫星菌落。第六章-微生物的遗传变异与育种二共生（symbiosis）：是指两种生物共居在一起，相互分工合作，互相依赖、互相有利，单独难以生存，有生理整体的形成，这种方式称为共生。1微生物间的共生关系：菌藻共生——子囊菌与绿藻共生形成的地衣。菌菌共生——真菌与蓝细菌共生。真菌产生有机酸分解岩石，为藻类或蓝细菌提供矿质元素。2微生物与植物间的共生关系：（1）根瘤菌与植物的共生：如根瘤菌与豆科植物、非豆科植物（杨梅属、美洲茶属等）和与放线菌共生等。（2）菌根菌与植物的共生：3微生物与动物的共生：在白蚁、蟑螂等昆虫肠道中有大量的第六章-微生物的遗传变异与育种微生物的共生关系形成有固定形态的叶状结构：真菌无规则地缠绕藻类细胞，或二者组成一定的层次排列。和真菌菌丝，粉芽脱离母体散布到适宜的环境中，发育成新的地衣共生菌从基质中吸收水分和无机养料；共生藻进行光合作用，合成有机物；第六章-微生物的遗传变异与育种第六章-微生物的遗传变异与育种真菌与藻类的共生2006年摄于哈尔滨五大连池第六章-微生物的遗传变异与育种真菌与藻类共生2006年摄于哈尔滨五大连池第六章-微生物的遗传变异与育种微生物与植物的共生关系豆科植物根部的分泌物能刺激根瘤菌的生长，同时，还为根瘤菌提供营养条件。根瘤菌固定空气中的分子态氮为植物提供氮素营养；第六章-微生物的遗传变异与育种第六章-微生物的遗传变异与育种的细菌和原生动物共生，白蚁中至少有100种细菌与其共生，他们在厌氧的条件下分解纤维素供白蚁营养，而微生物则可获得稳定的生活条件。瘤胃微生物与反刍动物的共生关系：牛、羊、骆驼、鹿等反刍动物，它们的胃都由4部分组成（瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃），通过与微生物共生它们才能消化纤维素，反刍动物为微生物提供纤维素和无机盐等养料、水分、合适的温度和酸碱度和厌氧环境，而微生物则协助消化纤维素成有机酸供瘤胃吸收。三拮抗：指某种微生物在生命活动的过程中，产生的代谢产物可抑制他种生物的生长发育甚至杀死它们的一种相互关系叫拮抗。根据拮抗有无选择性分：特异性拮抗：拮抗非特异性拮抗：第六章-微生物的遗传变异与育种在研究微生物是否具有拮抗关系的方法——将该两种或几种微生物在平板上培养，或在液体培养基上培养，观察菌落生长情况，可计数，测定单独生长的生长曲线和混合生长的生长曲线，比较可得出结论第六章-微生物