微环DNA转染制备临床级CAR-T技术规范

4DB13/TXXXXX—XXXX微环DNA转染制备临床级CAR-T技术规范本文件规定了相关术语与定义、基本要求、风险预案、实施方案的制定、实施与操作、毒副反应的处理、患者随访等内容。本文件适用于细胞制备机构与实施细胞免疫治疗的医疗机构。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。细胞制备机构cellpreparationinstitution具备细胞制备专业人员、GMP样细胞培养室、专业设施及设备条件和资质的企业、机构或实验室。3.2医疗机构medicalinstitution具备细胞免疫治疗所需人员、场地、设施及设备条件并符合国家资质的医院或科室。3.3外周血单个核细胞peripheralbloodmononuclearcell；PBMC血液中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和少量其他类型细胞。3.4脐带血间充质干细胞umbilicalcordbloodmesenchymalstemcells；UCB-MSCs胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液经培养扩增所获得的间充质干细胞，属于多能干细胞。3.5脐带间充质干细胞umbilicalcordmesenchymalstemcells；UC-MSCs胎儿娩出、脐带结扎并离断后，废弃端脐带的华氏胶组织经培养扩增所获得的间充质干细胞，属于多能干细胞。3.6脂肪间充质干细胞adipose-derivedmesenchymalstemcells；AD-MSCs抽吸脂肪组织经培养扩增所获得的间充质干细胞，属于多能干细胞。3.75DB13/TXXXXX—XXXX诱导多能干细胞inducedpluripotentstemcells；iPSCs是指通过导入特定的转录因子，将终末分化的体细胞重编程而获得的一种类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的细胞类型，属于多能干细胞。3.8γδT细胞γδTlymphocytes；γδT是一种胞外区缺乏TCRαβ受体、CD4及CD8表达阴性、外周血占比仅1-5%、异体回输不引起GVHD反应的特殊T细胞亚型。3.9原料T细胞rawmaterialTcells可用于制备效应T细胞的，来源于自体外周血单个核细胞的T淋巴细胞、同种异体并经组织相容抗原配型和/或基因改造的T淋巴细胞、同种异体经分选获得的特殊T细胞亚型、或诱导多能干细胞来源的T淋巴细胞等。3.10效应细胞effectorcells经体内诱导或体外加工制备，培养扩增所获得的，能够特异性或非特异性识别和杀伤靶细胞的活化T淋巴细胞。嵌合抗原受体T细胞chimericantigenreceptorTcells；CAR-T经基因工程修饰的，可表达被导入的含有抗原识别片段、T细胞受体活化分子、共刺激信号等信号分子的CAR基因的效应T细胞。转导transduction借助病毒或非病毒载体将外源性遗传物质（DNA或RNA）导入细胞并使其稳定表达的过程。3.13病毒载体viralvector将外源性遗传物质（DNA或RNA）插入病毒基因组非必需区包装而成的病毒颗粒，能够转导和感染细胞并使其稳定表达外源性遗传物质。非病毒载体nonviralvector能够利用自身物化性质介导基因的瞬时转染，使所携带基因阶段性高表达于细胞表面，但不整合至宿主细胞基因组的非病毒载体材料。具有转染效率高、毒性低、免疫反应低、无传染性、安全性高等优点。3.15微环DNAminicircleDNA；mcDNA是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组获得的一种小环状超螺旋表达框，具有缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列、临床安全性高等特征。3.16电转染electrotransfection通过高强度电场作用瞬时提高细胞膜的通透性，将外源性遗传物质（核苷酸、DNA、RNA、蛋白、糖类、染料及病毒颗粒等）高效率导入原核或真核细胞内的基因转移方法。3.17基因编辑geneediting采用基因工程技术对细胞染色体的特定基因组进行敲除，或将目的基因组进行随机或定点插入的基6DB13/TXXXXX—XXXX因修饰过程。3.18效应细胞终产品finalproductofeffectorcells指原料细胞经体外制备、培养及扩增全过程制成的终末细胞培养物或收获物。3.19期间检验intermediatesurvey效应细胞终产品收获前特定时间点的质量检验；一般包括细胞数量、细胞活率、细胞表型、目的基因表达率、细胞因子分泌功能以及靶向杀伤功能等检验检定。3.20放行检验finalinspection效应细胞收获后所制备终产品的质量检验；一般包括细胞数量、细胞活率、快速无菌、细菌真菌培养、支原体培养、内毒素、PH值、渗透压、以及有害残留物等检验检定。3.21标识label粘贴或附着在对象上的、用于区分不同对象的标记、注释或条码。3.22GMP样细胞培养室GMP-likecelllaboratory具备空间万级以上、局部百级的专业化细胞培养设施与设备的细胞培养室。3.23淋巴细胞删除性化疗lymphocytedeletionchemotherapy指采用特定化疗药物对患者进行以非髓性淋巴细胞删除为目地的化疗。3.24预处理preconditioning指采用特定药物和/或措施，对患者进行以增强治疗效果或预防毒副反应为目地的前期治疗和/或处4基本要求4.1人员要求4.1.1细胞制备机构（以下简称“机构”）应配备有与其规模相适应的研发、生产制备、质量控制人员团队。一般研发团队2-3人以上，以博士、硕士为主；生产制备技术人员团队3-5人以上，以硕士、本科为主；质量控制人员团队1-2人以上，以硕士为主。4.1.2机构团队所有成员均应接受过细胞制备、质量控制、储存与运输、临床应用等技术和规范的专业化培训，并年度考核合格。4.1.3机构团队所有成员均应体检合格后上岗，体检项目应至少包括乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、新冠等传染病检验，并年度体检合格。4.2机构资质4.2.1机构应具备省部级以上认证的高新技术企业资质。4.2.2机构应具备省部级以上认证的GMP样细胞培养室资质。4.2.3机构应具备完整规范的质量控制体系。4.3场地、设施条件7DB13/TXXXXX—XXXX4.3.1机构应具备符合临床级细胞制剂制备的场地与设施条件，主要包括研发中心、专业的GMP样细胞培养室、质量控制室等。4.3.2机构的GMP样细胞培养室应符合空间万级以上（万级或千级）、局部百级、人员分流、物品分流的基本要求，并满足定期检测与维护、运行良好的基本要求。4.4设备条件4.4.1机构应具备细胞制备所必需的各种设备，主要包括细胞分选设备、细胞转染设备（电转仪）、细胞培养设备、细胞观察与分析设备（流式细胞仪等）、质控设备、冷藏冷冻设备等。4.4.2所有设备应定期进行检测与维护以保证运行良好。4.5试剂耗材要求4.5.1细胞制备所采用的各种试剂、耗材均应购自资质企业。4.5.2所有试剂耗材应尽量采用临床级别或GMP级别。4.5.3机构自制试剂或耗材均需经过自检或第三方检验合格，并符合临床级别或GMP级别的要求。5风险预案5.1机构应对每一批次细胞产品建立登记备案体系、样品留存体系、临床事件追溯体系、不合格产品补救体系等风险预案。5.2风险预案应考虑到每批次细胞产品制备全过程（病人评估、细胞采集、细胞转运、实验室分选、基因修饰、培养与扩增、期间检验、放行检验、细胞冻存、细胞转运、临床治疗）中可能出现的各种风险及其处理措施，以确保细胞制剂的质量可靠及临床安全。6法规依从机构每批次细胞制剂质量控制需严格依从《中国药典》2020版、《药品生产质量管理规范(GMP)》、《药物非临床研究质量管理规范(GLP)》、《药物临床试验质量管理规范(GCP)》、《CAR-T细胞制剂制备质量管理规范》2018版、《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》2017版等相关法规和指导原则。7实施与操作7.1原料细胞的获取目前CAR-T疗法主要分为两大类，一是个体化CAR-T治疗，二是通用型CAR-T治疗。个体化CAR-T的原料T细胞主要通过自体外周血PBMC的采集、分离分选、培养扩增来获取。通用型CAR-T的原料T细胞主要采用健康人αβT细胞、γδT细胞、NK细胞等；间充质干细胞或iPSC来源的T细胞等。其中αβT细胞需进行GVHD相关基因的敲除以保证原料T细胞的通用性。7.1.1自体原料T细胞的获取：细胞采集前应对病人状态进行评估并符合以下标准：1）无活动性感染疾病。2）心、肺、肝、肾功能基本正常。8DB13/TXXXXX—XXXX3）KPS评分>50或ECOG评分3分以下。4）白细胞（WBC）计数>4.0×109/L，淋巴细胞计数>2.0×109/L，血红蛋白（HGB）>90g/L，血小板（PLT）计数>100×109/L。5）传染性疾病检验：乙肝表面抗原，乙肝E抗原、抗体，乙肝核心抗体，丙肝（HCV）抗体，艾滋（HIV）抗体，梅毒抗体应全部阴性。其中任何一项阳性需对所采集的细胞进行特殊标注，并通知细胞制备机构在独立的制备空间进行细胞制备，以防止交叉污染。自体外周血PBMC的采集：1）外周血抽取：抽取血量一般为50-100ml。2）血液成分分离机（COBE）采集外周血PBMC：循环血量一般为4000-6000ml，PBMC采集量一般为100-120ml。自体外周血PBMC的转运：1）转运条件：2-8℃条件下转运。2）时间限制：应在3-4hr内运达GMP样细胞培养室并进行后续处理。7.1.2健康供者原料T细胞的获取：细胞采集前应对健康供者进行评估并符合以下标准：1）无活动性感染疾病。2）心、肺、肝、肾功能基本正常。3）白细胞（WBC）计数>4.0×109/L，淋巴细胞计数>2.0×109/L，血红蛋白（HGB）>90g/L，血小板（PLT）计数>100×109/L。4）传染性疾病检验：乙肝表面抗原，乙肝E抗原、抗体，乙肝核心抗体，丙肝（HCV）抗体，艾滋（HIV）抗体，梅毒抗体全部阴性。其中任何一项阳性视为供者细胞不合格。健康供者外周血PBMC的采集：1）抽取外周血：抽取血量一般为50-100ml。2）血液成分分离机（COBE）采集外周血PBMC：循环血量一般为4000-6000ml，PBMC采集量一般为100-120ml。健康供者外周血PBMC的转运：1）转运条件：2-8℃条件下转运。2）时间限制：应在3-4hr内运达GMP样细胞培养室并进行后续处理。7.1.3脐血或脐带组织的获取：脐带血或脐带组织采集前应对产妇进行评估并符合以下标准：1）足月产。2）无活动性感染疾病。2）传染性疾病检验：乙肝表面抗原，乙肝E抗原、抗体，乙肝核心抗体，丙肝（HCV）抗体，艾滋（HIV）抗体，梅毒抗体全部阴性。其中任何一项阳性视为供者细胞或组织不合格。脐带血或脐带组织的采集：9DB13/TXXXXX—XXXX1）胎儿娩出、脐带结扎后，废弃端脐带内采集脐带血约80-100ml。2）胎儿娩出、脐带结扎后，采取废弃端脐带组织约15-20cm。脐带血或脐带组织的转运：1）转运条件：2-8℃条件下转运。2）时间限制：应在离体3-4hr内运达GMP样细胞培养室并进行后续处理。7.1.4脂肪组织的获取：脂肪组织采集前应对供者进行评估并符合以下标准：1）无活动性感染疾病。2）传染性疾病检验：乙肝表面抗原，乙肝E抗原、抗体，乙肝核心抗体，丙肝（HCV）抗体，艾滋（HIV）抗体，梅毒抗体全部阴性。其中任何一项阳性视为供者细胞或组织不合格。脂肪组织的采集：1）无菌手术中抽吸大网膜脂肪组织10-20ml。2）无菌手术条件下抽吸皮下脂肪组织10-20ml。脂肪组织的转运：1）转运条件：2-8℃条件下转运。2）时间限制：应在离体3-4hr内运达GMP样细胞培养室并进行后续处理。7.1.5商业化干细胞的获取：来源于资质企业或实验室。具备可靠的质量保证。液氮环境下转运至GMP样细胞培养室。7.2原料T细胞的分选与制备7.2.1自体原料T细胞的分选与培养：细胞处理环境：细胞处理全过程应在GMP样细胞培养室及生物安全柜中进行。细胞处理流程：PBMC的Ficoll分离→MACS磁珠分选→收获原料T细胞。细胞培养：原料T细胞的培养与扩增需采用未加异源血清及抗生素的无血清培养基，以及临床级别或至少GMP级别的细胞因子。7.2.2同种异体原料T细胞的分选与培养：细胞处理环境：细胞处理全过程应在GMP样细胞培养室及生物安全柜中进行。细胞处理流程：健康供者外周血PBMC的Ficoll分离→MACS磁珠分选→收获原料T细胞(γδT：直接使用；αβT：需敲除GVHD相关基因）。细胞培养：原料T细胞的培养与扩增需采用未加异源血清及抗生素的无血清培养基，以及临床级别或至少GMP级别的细胞因子。7.2.3间充质干细胞来源原料T细胞的分选与培养：脐血干细胞来源原料T细胞的制备：DB13/TXXXXX—XXXX1）细胞处理环境：细胞处理全过程应在GMP样细胞培养室及生物安全柜中进行。2）细胞处理流程：脐带血的Ficoll分离→MACS磁珠分选→收获原料T细胞(γδT：直接使用；αβT：需敲除GVHD相关基因）。3）细胞培养：原料T细胞的培养与扩增需采用未加异源血清及抗生素的无血清培养基，以及临床级别或至少GMP级别的细胞因子。脐带间充质干细胞来源原料T细胞的制备：1）细胞处理环境：组织与细胞处理全过程应在GMP样细胞培养室及生物安全柜中进行。2）细胞处理流程：脐带处理获取华氏胶组织→培养皿中培养获取间充质干细胞（MSCs）→MACS磁珠分选收获原料T细胞(γδT：直接使用；αβT：需敲除GVHD相关基因）。3）细胞培养：原料T细胞的培养与扩增需采用未加异源血清及抗生素的无血清培养基，以及临床级别或至少GMP级别的细胞因子。脂肪间充质干细胞来源原料T细胞的制备：1）细胞处理环境：组织与细胞处理全过程应在GMP样细胞培养室及生物安全柜中进行。2）细胞处理流程：脂肪组织的获取→培养皿中培养获取间充质干细胞（MSCs）→MACS磁珠分选收获原料T细胞(γδT：直接使用；αβT：需敲除GVHD相关基因）。3）细胞培养：原料T细胞的培养与扩增需采用未加异源血清及抗生素的无血清培养基，以及临床级别或至少GMP级别的细胞因子。7.2.4商业化干细胞来源原料T细胞的制备：细胞处理环境：细胞处理全过程应在GMP样细胞培养室及生物安全柜中进行。细胞处理流程：快速解冻MSCs或iPSCs→MACS分选→收获原料T细胞(γδT：直接使用；αβT：需敲除GVHD相关基因）。细胞培养：原料T细胞的培养与扩增需采用未加异源血清及抗生素的无血清培养基，以及临床级别或至少GMP级别的细胞因子。7.3原料液的制备与建库7.3.1目的基因-CAR全基因序列的设计与合成：应用DNAstar8.0生物学软件分别分析、筛选和设计包含有CAR结构的胞外域、跨膜区及胞内域的全基因序列。采用基于PCR的长片段DNA精确合成法（PCR-basedaccuratesynthesis,PAS），合成目的基因-CAR全基因序列。将目的基因-CAR全基因序列合成至pUC57质粒中，命名为目的基因-CAR-pUC57载体质粒。双酶切凝胶电泳、基因测序鉴定目的基因-CAR全基因序列连接正确。7.3.2目的基因-CAR亲本载体质粒的制备（原料液）：载体质粒：采用mcDNA载体试剂盒（MC-EasyTMMinicircleDNAProductionkit,SBI）所提供的亲本载体质粒（pMC.CMV-MCS-SV40PolyA）及目的基因-CAR-pUC57载体质粒。质粒提取：采用质粒提取试剂盒分别提取上述质粒。DB13/TXXXXX—XXXX亲本载体质粒构建：所提取上述质粒经酶切、连接、转化（在mcDNA试剂盒所提供的特殊感受态菌液ZYCY10P3S2TE.coli中）、挑选克隆、摇菌扩增获得目的基因-CAR亲本载体质粒克隆菌液。鉴定：从上述含目的基因-CAR亲本载体质粒的克隆菌液中提取质粒，双酶切、凝胶电泳、基因测序鉴定正确，表明目的基因-CAR亲本载体质粒构建成功。7.3.3目的基因-CAR亲本载体质粒原料液主库及工作库的建立：上述鉴定正确的目的基因-CAR亲本载体质粒克隆菌液大量摇菌扩增后，在同一容器中与50%的甘油按照1：1混合收获25%的亲本载体质粒甘油菌液（原料液）。原料液主库的建立：上述原料液按照5-7×106/1.5ml/1.8ml冻存管的浓度分装入冻存管，程序降温-80℃储存，建立原料液主库。原料液工作库的建立：原料液主库中取出原料液，摇菌扩增过夜获得大量菌液；提取质粒，经双酶切、凝胶电泳、基因测序鉴定正确，在同一容器中制备成25%的甘油菌液，分装，程序降温，-80℃储存，建立原料液工作库。原料液主库及工作库的储存时限：-80℃储存一般不超过12个月。原料液主库的更新：每12个月从-80℃取出原料液摇菌扩增，经双酶切、凝胶电泳、测序鉴定正确，在同一容器中制备成25%的甘油菌液，分装，程序降温，-80℃储存，建立原料液次代主库。原料液工作库的质控：原料液工作库达到储存时限前废弃，按步骤重新建立工作库。原料液主库及工作库各代次应符合一致性的要求。7.4工作液的制备与储存7.4.1目的基因-CAR-mcDNA载体质粒的提取：-80℃工作库中取出原料液，室温复苏，接种到含有50μg/ml卡那霉素2ml的LB液体培养基上，30℃、250rpm摇菌1-2hr，测定OD600值，计算接种体积。将菌液按照接种体积接种至试剂盒提供的1X生长培养基中，摇菌过夜（<16hr）。取少量菌液测定并调整PH值在6.9-7.4之间、OD600值在4-6之间。继续摇菌（<5.5hr）收获菌液。小剂量提取质粒，双酶切、凝胶电泳、基因测序鉴定目的基因-CAR-mcDNA载体质粒质量合格，暂存于-20℃。按QIAGENEndoFreePlasmidMaxiKit说明书步骤，大剂量提取目的基因-CAR-mcDNA载体质粒，凝胶电泳再次鉴定合格。用EndoFreebufferTE重溶质粒并定量（浓度要求：>400ng/ul收获目的基因-CAR-mcDNA载体质粒（工作液）。7.4.2目的基因-CAR-mcDNA载体质粒工作液的储存：目的基因-CAR-mcDNA载体质粒工作液需置于-20℃暂存，用于CAR-T效应细胞的制备。目的基因-CAR-mcDNA载体质粒工作液-20℃暂存时限一般不超过3个月。7.5临床级CAR-T效应细胞的转染制备7.5.1主要设备：DB13/TXXXXX—XXXXLONZA公司提供的临床级4D-Nucleofector电转仪。7.5.2主要试剂：LONZA公司提供的临床级电转试剂盒：P3PrimaryCell4D-NucleofectorTMXKitL（100ul），或P3PrimaryCell4D-NucleofectorTMLVKitL（1.0ml）。7.5.3原料T细胞：个体化CAR-T制备：采用自体外周血PBMC来源原料T细胞。通用型CAR-T制备：采用健康供者外周血来源或干细胞来源的γδT细胞、GVHD相关基因敲除的αβT细胞、或NK细胞等。7.5.4生产用工作液：目的基因-CAR-mcDNA载体质粒工作液。7.5.5CAR-T效应细胞的电转制备：六孔板加入含CD3单抗、CD28单抗及IL-2的无血清培养基2ml，培养箱中预热备用。电转液配制：采用LONZA电转试剂盒所提供试剂，按照不同电转单元所需电转液总量配制电转液（配置比例：82μlnucleofectorsolution+18μlsupplement/每100μl电转液室温放置备用。工作液的准备：-20℃取出目的基因-CAR-mcDNA载体质粒工作液，室温复融备用。原料T细胞的准备：按照每个100μl电转杯转染5×106个T细胞的细胞量准备原料T细胞，1500rpm离心，完全弃上清。待转液的准备：上述原料T细胞中加入所需剂量的电转液重悬，按照电转液总量的1/10剂量加入目的基因-CAR-mcDNA载体质粒工作液，混匀制备成待转液备用。电转杯添加：取LONZA提供的电转杯（100μl单元或1.0ml单元按各单元规定剂量加入待转液（需轻柔添加并避免气泡）。CAR-T的电转制备：采用LONZA4D-Nucleofector电转仪，设定相应程序，启动电转完成CAR-T效应细胞的电转制备。7.5.6CAR-T效应细胞的培养与扩增：采用试剂盒提供的特制吸管，轻柔吸出电转杯中的全部细胞，移入预热的6孔板中，轻柔打散，37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。次日加入IL-15继续培养24-48hr。取少量细胞行biotin-proteinL染色、PE-SA标记、流式检测T细胞表面CAR基因的表达率（CAR表达率应为60-80%）。细胞80-90%覆盖时，转移至175cm2培养瓶或细胞培养袋（半封闭）继续培养扩增，每2-3天添加新鲜培养基，据情扩瓶培养。一般5-10天细胞数量满足临床数量级时收获。7.5.7CAR-T效应细胞的期间检验（期间质控，效应细胞收获前2天）：细胞计数及细胞活率检验：采用细胞计数板法或细胞计数仪法；细胞数量应达到临床数量级，细胞活率应在95%以上。细胞表型检验：采用流式细胞法（FCM个体化：CD3+T占比应在95%以上，CD4/CD8比值应在1.4-2.0之间；通用型γδT：γδT占比应在99%以上；通用型αβT：TCR及B2M表达应阴性。DB13/TXXXXX—XXXXCAR基因表达检验：采用biotin-proteinL染色、PE-SA标记、流式细胞检测法；CAR表达率应在60%以上。细胞因子分泌功能检验：采用ELISA检验法；INF-γ、IL-2或TNF-α等细胞因子分泌量应显著升高。靶向杀伤功能检验：采用CCK-8检验法；效靶比20:1时杀伤效率应在80%以上。7.6临床级CAR-T注射液的制备、储存、质控与转运：7.6.1临床级CAR-T注射液的制备、灌装与储存：临床级冻存液的配制：31.25%的临床级复方电解质溶液A+31.25%的临床级0.45%氯化钠注射液+20%的临床级人血白蛋白+10%的临床级右旋糖酐40+7.5%的临床级DMSO。收获期间检验合格的CAR-T效应细胞，生理盐水离心洗涤2-3次，完全弃上清。加入临床级冻存液重悬细胞（符合临床数量级要求），制备成临床级CAR-T注射液。灌装Miltenyi临床级冻存袋，制备成CAR-T注射液终产品（抽取部分终产品行放行检验及样本冻存共追溯），程序降温，液氮冻存。7.6.2临床级CAR-T注射液的放行检验（终产品质控）：外观检验：采用明亮背景下肉眼观测法；包装袋内注射液应为淡乳白色、半透明、无杂质、无细胞团块。细胞计数及细胞活率检验：采用细胞计数板法或细胞计数仪法；细胞数量应符合临床数量级，细胞活率>90%。快速无菌检验：采用快速革兰氏染色法；注射液细菌检验应为（-）。细菌内毒素检验：采用鲎试剂检验法；注射液内细菌毒素含量应<0.5EU/mL。细菌真菌检验：采用细菌真菌培养法；注射液细菌真菌检验应为（-样本需-80℃冻存一年以上供追溯。支原体检验：采用肉汤培养法；注射液支原体检验应为（-样本需-80℃冻存一年以上供追溯。PH值检验：采用酸度计检验法；注射液PH值应在7.35-7.45之间。渗透压检验：采用渗透压摩尔浓度测定仪法；注射液渗透压应在280-310mmol/L之间。mcDNA残留检验：采用PCR法；注射液mcDNA残留应为（-）。0IL-15残留检验：采用ELISA检验法；注射液IL-15残留量应<30pg/mL。7.6.3临床级CAR-T注射液的转运：采用气相液氮罐转运，以避免转运过程中冻存袋的破损风险。长途转运时需注意气相液氮罐的有效低温时限。8临床应用：8.1回输治疗前需确认急救设备（心电监护、除颤、呼吸机、吸氧、吸痰等）及急救药品（托珠单抗、糖皮质激素等）已床旁准备就绪。DB13/TXXXXX—XXXX8.2回输治疗前需进行淋巴细胞删除性化疗预处理，以干扰肿瘤微环境，提高临床疗效。多采用以下方案：环磷酰胺400mg/m2静脉输注1次/日，第1-2天；氟达拉滨20mg/m2静脉输注1次/日，第1-4天；预处理完成后一周内实施CAR-T回输治疗。8.3回输治疗前30min可预防性使用布洛芬、苯海拉明、异丙嗪等降温、抗过敏、镇静药物，以防止可能出现的高热或过敏反应。8.4回输治疗前需严格核对病人ID，仔细检查冻存袋是否有破损和渗漏、内容物色泽改变及异常悬浮物，一旦发现任何异常，需即刻联系生产机构质控人员并终止本批次注射液的使用。8.5回输治疗时需采用不带滤网的临床级输液器以防效应细胞的损失，输注速度应掌握在10-20ml/min，避免因输注速度过快引起的过敏反应。8.6回输治疗期间及结束后，需严密观察病情变化并及时给与相应的对症处理；除非出现危及生命的毒副反应，一般不建议使用糖皮质激素。9毒副反应的处理9.1脱靶效应（Ontarget,Offtumor）：特异性细胞免疫治疗多具有明确的靶点（肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原但除肿瘤细胞表达这些靶点外正常组织也可能表达，因而可能出现效应细胞同时杀伤肿瘤以外的正常组织所致的脱靶效应。此类毒副反应以肺损害较为多见，病人可能出现呼吸困难、血氧下降等临床表现。治疗以吸氧、吸痰、保持呼吸道通畅、呼吸机支持、抗感染等对症治疗措施为主。9.2细胞因子释放综合征（cytokinereleasesyndrome,CRS）：CRS的发生是由于效应细胞回输体内后大量增殖和靶向杀伤而释放大量的细胞因子，形成细胞因子“风暴”并造成多器官功能损害及衰竭。临床主要表现为高热寒战、心肺功能下降、低血压、缺氧与肺水肿、急性肾损伤等多器官功能障碍症状。因临床症状较为凶险，治疗需积极而及时。一般在积极对症治疗基础上合理使用细胞因子拮抗剂如托珠单抗等药物大多能够缓解，细胞因子拮抗剂无效时也可考虑使用糖皮质激素治疗。9.3神经毒性：神经毒性反应的发生机制可能是细胞因子大量进入血脑屏障引起的神经损害，临床多表现为头痛、神志改变、意识障碍、谵妄、幻觉等，严重者可能出现癫痫。由于托珠单抗分子量大而不易通过血脑屏障，严重的神经毒性需采用糖皮质激素类药物及对症处理等治疗。9.4过敏反应：各种细胞制剂的回输治疗均可能引起发热、皮疹等类似过敏反应的症状，一般高热（>38.5℃)发