免疫细胞的分离与检验

关于免疫细胞的分离与检验

第一节免疫细胞的分类与分离一、免疫细胞的种类与特征二、免疫细胞的分离技术三、细胞的冻存与复苏第2页,共60页，2024年2月25日，星期天免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征理化性状生物学特性2、免疫细胞的膜分子特征

CD分子第3页,共60页，2024年2月25日，星期天

免疫细胞的起源与分化

红细胞血小板肥大细胞中性粒细胞巨噬细胞树突状细胞浆细胞T细胞NK细胞第4页,共60页，2024年2月25日，星期天免疫细胞的分离技术1、密度梯度离心法2、黏附分离法3、荧光激活分离法4、磁性分离法5、其他分离法第5页,共60页，2024年2月25日，星期天密度梯度离心法离心前离心后稀释抗凝血淋巴细胞分离液血浆单个核细胞粒细胞红细胞第6页,共60页，2024年2月25日，星期天沉降速度=2r2（Q—Q0）9

xgQ=颗粒比重Q0=溶质比重r=颗粒半径

=形状因子=颗粒摩擦系数/同体积球型颗粒摩擦系数

=粘稠度g=相对离心力第7页,共60页，2024年2月25日，星期天人类血液有形成分的平均密度与直径

密度直径（

）血小板1.04—1.06淋巴细胞1.06—1.088—10粒细胞1.08—1.0913红细胞1.09—1.107.5第8页,共60页，2024年2月25日，星期天黏附分离法尼龙毛法贴壁法亲和板法吸附柱法第9页,共60页，2024年2月25日，星期天荧光激活分离法（FACS）荧光检测器滤光片透镜接物镜激光束偏转板喷嘴细胞收集管流体护套样品第10页,共60页，2024年2月25日，星期天流式细胞仪第11页,共60页，2024年2月25日，星期天磁性分离法磁铁吸引法磁式细胞分类术法第12页,共60页，2024年2月25日，星期天MACS(阳性选择法）NS第13页,共60页，2024年2月25日，星期天MACS(阴性选择法）NS第14页,共60页，2024年2月25日，星期天第15页,共60页，2024年2月25日，星期天其他分离法花环沉降法细胞活化克隆法MHC分子四聚体法第16页,共60页，2024年2月25日，星期天抗原肽-MHC分子四聚体技术T第17页,共60页，2024年2月25日，星期天细胞的冻存与复苏细胞冻存的原理与方法细胞复苏的原理与方法第18页,共60页，2024年2月25日，星期天细胞冻存罐第19页,共60页，2024年2月25日，星期天

第二节免疫细胞膜分子的检测一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型二、免疫细胞膜分子的检测方法第20页,共60页，2024年2月25日，星期天免疫细胞膜分子检测的原理与类型1、以抗体识别抗原2、以配体识别受体第21页,共60页，2024年2月25日，星期天免疫细胞膜分子的主要检测方法1、免疫标记检测方法荧光抗体法酶免疫检测法免疫金银染色法2、补体依赖的细胞毒试验（CDC）3、花环形成试验第22页,共60页，2024年2月25日，星期天SmIg的荧光抗体检测法第23页,共60页，2024年2月25日，星期天SmIg的酶免疫检测法第24页,共60页，2024年2月25日，星期天补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体第25页,共60页，2024年2月25日，星期天E-花环T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞第26页,共60页，2024年2月25日，星期天第27页,共60页，2024年2月25日，星期天EA-花环第28页,共60页，2024年2月25日，星期天EAC-花环第29页,共60页，2024年2月25日，星期天

第三节免疫细胞功能测定一、转化、增殖试验二、细胞毒试验三、抗体形成试验四、细胞吞噬与杀伤试验第30页,共60页，2024年2月25日，星期天1、淋巴细胞转化试验2、混合淋巴细胞培养转化、增殖试验第31页,共60页，2024年2月25日，星期天第32页,共60页，2024年2月25日，星期天放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋巴细胞转化试验原理示意第33页,共60页，2024年2月25日，星期天1、T细胞介导的细胞毒试验2、NK活性测定3、ADCC作用测定细胞毒检测试验第34页,共60页，2024年2月25日，星期天放射性测定细胞毒试验原理示意靶细胞效应细胞分离上清第35页,共60页，2024年2月25日，星期天1、直接溶血空斑试验2、间接溶血空斑试验3、SPA-SRBC溶血空斑试验抗体形成试验第36页,共60页，2024年2月25日，星期天直接溶血空斑试验第37页,共60页，2024年2月25日，星期天间接溶血空斑试验第38页,共60页，2024年2月25日，星期天SPA-SRBC溶血空斑试验第39页,共60页，2024年2月25日，星期天1、细胞吞噬功能试验2、细胞杀菌功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验第40页,共60页，2024年2月25日，星期天第41页,共60页，2024年2月25日，星期天吞噬百分率=吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数=吞噬细胞吞噬的总颗粒数计数的吞噬细胞数第42页,共60页，2024年2月25日，星期天NBT还原试验原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黄色）甲月簪基（紫黑色）第43页,共60页，2024年2月25日，星期天NBT还原试验方法：1、抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、镜检。正常值：NBT阳性细胞7.5-15%第44页,共60页，2024年2月25日，星期天

第四节免疫细胞凋亡测定一、细胞凋亡的概念与原理二、细胞凋亡的检测方法第45页,共60页，2024年2月25日，星期天

细胞凋亡的概念与原理1、细胞凋亡的概念2、细胞凋亡的原理3、细胞凋亡的特点第46页,共60页，2024年2月25日，星期天

细胞凋亡（apoptosis）

细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡过程，也称程序性死亡。第47页,共60页，2024年2月25日，星期天

细胞凋亡的过程凋亡信号——凋亡受体——信号传导——凋亡基因启动——编码程序性死亡蛋白——细胞结构解体——细胞凋亡第48页,共60页，2024年2月25日，星期天

细胞凋亡机制第49页,共60页，2024年2月25日，星期天

细胞凋亡的特点1、细胞皱缩2、染色质边集3、凋亡小体出现第50页,共60页，2024年2月25日，星期天

细胞凋亡第51页,共60页，2024年2月25日，星期天

细胞凋亡的检测方法1、形态观察法2、生化检测法3、流式细胞仪检测法第52页,共60页，2024年2月25日，星期天形态观察法普通光镜检测——HE染色甲基绿-派诺宁染色荧光显微镜检测——溴化丙锭染色透射电镜检测——典型形态改变第53页,共60页，2024年2月25日，星期天生化检测法凝胶电泳法原位末端标记法二苯胺分光光度法第54页,共60页，2024年2月25日，星期天凝胶电泳法原理：断裂DNA在凝胶中呈梯形排列（DNAladder）方法：提取总DNADNA凝胶电泳观察DNAladder现象第55页,共60页，2024年2月25日，星期天原位末端标记法（TUNEL）原理：利用标记的dUTP，在TdT作用下结合DNA断片的3’末端羟基，显示断链DNA，提示凋亡方法：制备组织切片标记物结合标记物显色镜检第56页,共60页，2024年2月25日，星期天二苯胺分光光度法原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通过超速离心可与细胞核的高分子量DNA分离，分别测定两种DNA，即可得出凋亡百分率。方法：裂解细胞

13000g超速离心分别提取DNA

使DNA显色，测定第57页,共60页，2024年2月25日，星期天凋亡百分率=上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值第58页,共60页，2024年2月25