蜂王浆及蜂王浆冻干粉中羟甲基糠醛含量的测定 高效液相色谱法 编制说明

1术委员会，由全国蜂产品标准化技术委员会委员单位杭州碧于天保健品有限公司牵头负本文件为解决行业的重点关注的问题——蜂王浆和蜂王浆冻干粉新鲜度的判定提供适宜的检测作为以活性蛋白为主要功能的蜂王浆，控制温度和低温存储对于产品新鲜度和品质意义重大，但在如何判定问题上，多年以来一直困扰着行业的发展。本文件通过对蜂王浆和蜂王浆冻干粉进行羟甲基糠醛含量的检测，以判断蜂王浆贮存、加工过程中温度控制情况。蜂王浆，是蜜蜂巢中培育幼虫的青年工蜂咽下腺和上腭腺的分泌物，是一种高活性成分的营养还有微量的维生素。在生产实践中，蜂王浆如果贮存不当，会产生褐变、因蛋白质聚集凝固而变粘性发展是极其不利的。有志于生产优质蜂王浆的蜂业合作社或者企业，花巨资投入蜂王浆冷链贮存运输设备，生产新鲜度高的蜂王浆产品，由于现行标准并无相关新鲜度指标，体现不出其产品品质的优势，因而也体现不出产品的竞争优势，一定程度上打击其生产高品质蜂王浆的积极性。在出口年蜂王浆原料蜂农见面价更低，严重影响我国蜂王浆行业的进一步发生素等热敏性成分入手，通过不同贮存条件下，对酶活性[1,2]、蛋白活性[3-7]、维生素含量[8成分含量[10-14]、红外光谱指纹[15]的变化趋势进行研究，取得了一些研究成果。由于缺少生产实践验证、检测方法灵敏度不够、研究对象在不同蜂王浆中本底差异较大，并没有合适的指标在生产实践中得到应用。作为蜂王浆的新鲜度指标，必须满足：该指标必须对温度敏感，在新鲜的蜂王浆中不存在，而且可以被定量、被准确检测。在现有研究中，我们认为羟甲基糠醛是最可能的判定蜂王浆2羟甲基糠醛是美拉德反应的重要中间产物[16]，在酸性条件下，己糖脱水，或是要深入了解蜂王浆中的羟甲基糠醛的变化规律，有必要进一步研究蜂王浆中的羟甲基糠醛含量的测蜂王浆在贮存和加工（冻干）过程中逐渐生成羟甲基糠醛（HMF在现有的相关研究中，羟甲基糠醛被证实是不存在于新鲜蜂王浆中且又与贮存温度密切相关的物质，能很好地反映蜂王浆贮存加工过程中是否进过加热，是否在常温下存放过久，进而反映出产品的新鲜度和品质，而阻碍其成法可以精准测定蜂王浆贮存和加工过程中羟甲基糠醛含量的细微变化，可为将羟甲基糠醛确定为蜂王浆及其冻干粉新鲜度指标提供适宜的检测方法。为下一步蜂王浆及其冻干粉新鲜度指标的确定提经过共同协商，本文件由杭州碧于天保健品有限公司牵头，共有浙江大学动物科学学院、中国蜂产品协会、南京天嘉检测有限公司、浙江省食品药品检验研究院、杭州天厨蜜源保健品有限公司、杭州和蜂园保健品有限公司、安徽蜜之源食品集团有限公司、桐庐县检验检测中心、山东丰采健康产业有限公司、浙江江山恒亮蜂产品股份有限公司、浙江江山健康蜂业有限公司、上海冠生园蜂制品杭州碧于天保健品有限公司负责全面工作，组织会议召开，文件文本与编制说明的编制，方法浙江省食品药品检验研究院、浙江大学动物科学学院、南京天嘉检测有限公司负责文本的英文南京天嘉检测有限公司、安徽蜜之源食品集团有限公司、杭州天厨蜜源保健品有限公司、桐庐县检验检测中心、上海冠生园蜂制品有限公司、浙江江山健康蜂业有限公司、华谱科仪(北京)科技有限公司等单位负责文件方法的方法学考察、验证方案杭州天厨蜜源保健品有限公司、安徽蜜之源食品集团有限公司、山东丰采蜂产品有限公司、浙3本文件制定的原则是：①按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结②体现本文件比较先进的技术水平，适应当前经济发展的需要，提高蜂王浆行业在国内、国际市场上的竞争能力。③本文件的检测水平从实际出发，为蜂王浆新鲜度指标的确定提供检测技术，以适本文件适用于蜂王浆及蜂王浆冻干粉中羟甲基糠醛含量为了方便使用者对本文件原理的理解及实施，给出了本文件的0.22μm滤膜，用液相色谱仪紫外检测器(λ=285nm）检测，绘制空白基质标准曲线，外标法定量。蜂王浆在常温下保存可以快速产生羟甲基糠醛（也可以简称HMF故不能在常温下久存。在0-8℃环境下也可以缓慢产生HMF。为保证检测结果的准确，试样制备与保存规定如下：蜂王浆冻干粉是蜂王浆的脱水产品。在冻干后期，随着蜂王浆中水分的减少，不可避免地需要升高温度以较为彻底地去除水分，出料前，物料温度可以4称量操作相对困难，称量小可能带来较大的误差，需要精度更高的天平，同时，对样品的均匀性要确到±0.01g）水，用玻璃捧每隔5min搅拌一次，直至样品呈均匀将制备好的试样于0～8℃环境下保存，一周内进行测定。长久保存试样应在-18℃环境下。4500转/min离心10min。吸取10mL上清液于玻璃容器中，氮气吹干或旋转蒸发至干甲醇溶液，超声溶解，过0.22rm滤膜，得到测试样液。经过对蜂王浆及蜂王浆冻干粉中HMF的检测，蜂王浆中的HMF值通常为峰面积在线性范围内，标准曲线最高浓度至少为1000μg/kg。为兼顾蜂王浆和蜂王浆冻干粉的检10mg/L羟甲基糠醛中间液200µL，从蜂王浆试样溶液的制备方法“加入6.0mL1.5%氨水溶液”色谱柱：C18填料色谱柱（4.6mm×250mm，5μm000000进样量：20μL。积比值纵坐标，以标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量。标准工作溶液及试样溶液中羟甲基糠醛的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱试样中羟甲基糠醛含量（X）以微克每千克(μg/kg）表示，按式（1）计算：………………CS—从羟甲基糠醛标准工作曲线上计算得到的浓度，单位为微克每升(μg/L三、试验验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期1g样品→水溶解→亚铁氰化钾/乙酸锌沉钠净化→乙酸酸化→无水硫酸钠脱水→40～45℃蒸干→0.5mL乙腈溶解→衍生化10.0g样品→10mL甲醇溶解→水定容至2.2g→25%乙醇50mL回流提取2次→减压蒸净化。对于蛋白质含量高的，采用亚铁氰化钾/乙酸锌沉淀蛋白的方法对样品进该方法检测限为0.3mg/kg，不能满足提取后进行浓缩，从而提高方法的检测限。在实践中，我们发现，该方法对羟甲基糠醛的绝对提取率仅为20%。可能是由于蜂王浆中的蛋白质影响了提取效率。在试验过程中，不同花种的蜂王浆还蜂王浆可溶于碱性溶液中，将蛋白质溶于碱性溶液，再用乙酸乙酯提取。我们考察了不同浓度样品名称及重量氨水浓度，%氨水加入体积,mL样液状态0033蜂王浆干粉，00王浆中的蛋白质被氨水快速溶解，样品得以快速充分地溶解，保证了乙酸乙酯与羟甲基糠醛充分混合，样液呈细腻的奶状，从而提高了提取效率。未加氨水的样液可见明显的絮状蛋白质，乙酸乙酯能由于样液在碱性条件下，蛋白质变性，粘稠度增加，羟甲基糠醛与样液中的水、糖类、蛋白质结合更加牢固，在乙酸乙酯中的分配系数较小，影响了提取效率。因此，选择用3mL1.5%氨水溶解蜂1234由于醇、乙腈、丙酮、二甲基甲酰胺可以溶解于水，在提取时同时提取了蜂王浆中的糖残渣的量较多，需要进一步净化，故不宜选用。乙醚是易制毒化学品，采购及化学品管理不便，苯75%以上。考虑到试剂用量、检测灵敏度，8mL乙酸乙酯的用量即可满足要经过乙酸乙酯提取的样液呈乳液状，静置即可以分层，4500rpm离心5min在进行内部验证实验时，有2个实验室反映，经过了解，是实验室使用了旋涡混合方式提取，这种方式提取时，混合较为激烈，个别蛋白质变性的样品因为粘度高容易发生乳化；有的则是样品加入氨水溶解后，过了几个小时后进行提取，可能用于后续检测。从而解决了上述问题。经过内部验证实验，精密度准确度达到本文件的要求。文献多采用甲醇与磷酸水溶液作为流动相，我们选择了甲醇+0.4%磷酸=10+90，8+92和6+94为流动相，进行色谱分离试验。当甲醇+0.4%磷酸=10+90时，羟甲基糠醛色谱峰前有一个干扰峰，当全分离，但是杂质峰与羟甲基糠醛色谱峰靠得相对较近，当样品中羟甲基糠醛含量较高时，不能保干粉，羟甲基糠醛色谱峰附近无杂质峰干扰，但是羟甲基糠醛色谱峰的保留时间较长，为保证检测92按2.2提供的方法对空白基质样品和样品进行处理和测定，以羟甲基糠醛峰面积对其浓度（x，/(rg/kg)R2/(rg/kg)/(rg/kg)y=66.80x+346.982.0%-110.0%之间，相对标准偏差在5.2%-8.0进样时间，h024872《Goodbeekeepingpracticesforsustainableapiculture》关于蜂王浆贮存的建议是一致的。本文件起草将进一步研究不同贮存与生产条件下蜂王浆及蜂王浆冻干粉中进行中……经过起草人多年的实践，其《蜂王浆及其干粉中羟甲基糠醛含量的检测方法》也获得了国家发明专利，专利号：ZL202210477234.X。本技术具有创新性、先进性，对于蜂王浆和蜂王浆冻干粉中3.2.2经济分析。本文件专门针对蜂王浆及蜂王浆冻干粉产品的特点而制定，通过多年实践验证其检测机构的基本配置，经济投入少，对于监控产品中HM点，本文件的应用，可以进一步提高产品品质，提高企业、蜂农的收益，经济社会效益十分明显。3.2.3效果评估。本文件在前人研究的基础之上而开发，并经过多年实践应用，监控蜂王浆产品质3.2.4风险评估。本文件属于专利技术的应用。未见相关的国内外标准检测方法。未见与本文件检测原理相同的方法在蜂王浆产品中的应用，具有国际先进性。多年实践表明，本文件的检测方法稳定、准确、可靠。本文件的应用可以提升我国蜂王浆生产、加工的技术水平，进一步提升我国蜂王浆的品质，及在国际上对蜂王浆产品的信任度，提升我国蜂王浆品质的信誉度。同时，在商业竞争中，有利于差异化竞争，使得我国蜂王浆产品向高品质方向发展。对未来我国蜂王浆产品均有积极3.2.5.比较和选择。本文件的方法目的是监控产品是否经过高温贮存或者加工，对蜂王浆产品的新3.2.6.敏感性分析。本文件的应用会对行业产生较为深远的影响。蜂王浆的保存与加工对于产品质量至关重要，目前尚无可靠的判定指标。本文件是为蜂王浆、蜂王浆冻干粉国家标准提供一种新鲜度的检测方法，真正应用到产品还需要经过行业的应用与验证，得到广泛的数据支持，直到足以确定一个对于蜂王浆新鲜度判定的指标。尽管，本文件对于蜂王浆行业会产生一定的影响，但是，这个影响是正向的，目的是为了促进蜂王浆高品质发展，行业相关人士会对本文件的应用后，加强蜂综上，本文件在技术上可行、经济上合理，几十年过去，一直未能制定一个可以较好反映蜂王浆新鲜度的质量指标，在商品贸易活动中主要以蜂王浆主蛋白MRJP1-9。高温下贮存的蜂王浆蛋白质变性而失去活性，中国农科院蜜蜂研究所李建生素等热敏性成分入手，通过不同贮存条件下，对酶活性[1,2]、蛋白活性[3-7]、维生素含量[8成分含量[10-14]、红外光谱指纹[15]的变化趋势进行研究，取得了一些研究成果。由于缺少生产实践验证、检测方法灵敏度不够、研究对象在不同蜂王浆中本底差异较大，并没有合适的指标在生产实践中得到应用。行业关注度高活性蛋白，研究者众多，但是由于不同花种、不同生产季节、蜂种等因素影响，其本底值差异显著，要找到一个合适的蛋白种类作为质量指标来确定蜂王浆的新鲜度，还本文件的起草组认为：作为蜂王浆的新鲜度指标，必须满足：该指标必须对温度敏感，在新鲜的蜂王浆中不存在，而且可以被定量、被准确检测。在现有研究中，我们认为羟甲基糠醛是最可能于羟甲基糠醛的测定方法有很多，但是现行方法均不能满足检测灵敏度的要求。要深入了解蜂王浆中的羟甲基糠醛的变化规律，有必要进一步研究蜂王浆中的羟甲基糠醛含量的本文件的检测方法操作简单，使用常规的液相色谱仪，具有灵敏度高，检测结果准确度、精密度良好的特点，一般企业和检测机构均能很快掌握方法。本文件为蜂王浆新鲜度指标的确定提供了越来越低[26]，这不代表着蜂王浆的总体品质的下降，蜂王浆中的活性蛋白成分并未下降，而蜂王浆蜂王浆全程冷链直到送到消费者手中，旨在生产高新鲜度的蜂王浆，这种蜂王浆的价格最高可达每证产品活性以外，没有其他的证据来证明其产品的新鲜度情况，这是一种不足。起草单位对蜂王浆生产与收购情况非常了解，大部分情况下，蜂农将采收的蜂王浆置于常温下，一个星期左右才送交要解决出有关问题，一个可行的方法就是提倡蜂王浆的新鲜度。现行蜂王浆标准的质量指标均是从蜂王浆的本质特征出发而制订，缺少新鲜度指标，这也是行业多年的难题。HMF是蜂王浆受光照、高温等作用下产生，新鲜蜂王浆中不存在的一种物质，它溶于水，有较高的沸点，无法在不破坏蜂王浆性质特征的情况下从产品中去除，因此，是一个非常好的新鲜度品质指标，可以间接表明本文件的实施，使得蜂王浆的新鲜度得以保证，吸引生产者和消费者更关注蜂王浆的新鲜度，重要的。从这方面来说，新鲜度显得更重要，这也必将促使蜂王浆的生产与加工更加科学、规范与史低谷。由于没有关注蜂王浆的新鲜度，产品保健效果因为忽略新鲜度而不显著，这也是人们不信任蜂王浆的原因之一。本文件的实施，将为蜂王浆新鲜度指标的确立提供技术支持，无论是蜂王浆还是其冻干粉，新鲜度高的蜂王浆生理作用因为活性物质的最大保留而更有保健效果，令消费者重拾对蜂王浆的信心，提升消费量。本文件实施，蜂王浆市场上必将出现新的繁荣时代，真正实现优质优价。人们对新鲜蜂王浆需求，将促进蜂王浆的高品质生产，对蜂王浆的生产进步起到不可估量本文件的实施，为蜂王浆和蜂王浆冻干粉提供新鲜度指标的检测技术，通过大量实践，可以得蜂王浆冻干粉中的合理的HMF指标，来保证产品的新鲜度以及这有利于提升我国的蜂王浆行业的整体质量控制技术水平，经查阅文献，国际上并没有相关本文件养蜂业是一种可持续发展和环保的事业，有利于环境生态的平衡，也得到国家的大力提倡与支持。因为蜂王浆生产与运输的模式多年未曾改变，蜂王浆的品质也一直未曾有重大的提升，蜂农收入也因此受到影响，蜂农老龄化日益明显。本文件实施，必将促进养蜂业的发展，提升现有生产方式，能够按本文件实施的蜂农，生产出的蜂王浆新鲜度好，价格优，可以明显增加蜂农收入。本文件的实施，可以促进企业加工新鲜度好的产品，以满足市场的需求，与一般的产品在品质上体现出了巨大的优势，优质优价，提升产品的竞争力，最终提升整体蜂王浆的市场价格，经济效益显著。四.与国际、国外同类标准技术内容的对比情况，或者与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况五、以国际标准为基础的起草情况，以及是否合规引用或者采用国际国外标准，并说明未采用国际本文件没有可采用的国际标准和国外相同标准进行对比，在国际上处于领先地位。目前，尚无本文件与现行的蜂王浆国家标准(GB9697)和蜂王浆冻术保障角度具有配套性和目标的一致性，为将本文件在起草讨论和征求意见过程中未发生重大分该专利为本文件第一起草单位和第一起草人所有，免费许可本文产品品质的企业无技术支撑，行业协会与标准化技术委员会对蜂王浆产品进行质量分级而制定相应的国家标准、团体标准、行业标准时亟需本文件2.建议本文件应纳入蜂王浆和蜂王浆冻干粉相关技术培训[2]吴粹文,张复兴.贮存温度和时间对蜂王浆中葡萄糖氧化酶GOD活性影响的研究[J],中