NGS系列讲座-NGS基本原理

NGS系列讲座（一）——

NGS简介及原理2017/06/011大家好Outline二代测序技术背景Solexa测序原理2大家好Outline二代测序技术背景Solexa测序原理其他平台测序技术简介3大家好什么是DNA测序？测序的研究对象是什么？DNA测序（DNAsequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。

——百度百科测序主要研究的是DNA一级结构，不涉及DNA的二级、三级结构4大家好DNA合成的基本过程dNTPddNTP5大家好一代测序末端终止法（ABI3700）使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用荧光染料标记4种不同的碱基，通过计算机自动读出。Frederick“Fred”Sanger6大家好Sanger测序5’TGCGCGGCCCAPrimerACGCGCCGGGT???????????????5’3’7大家好Sanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCT8大家好Sanger测序GTCTTGGGCTAGCGCACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp9大家好Sanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGCTA10大家好Sanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAPrimerG11大家好Sanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTTGGGC12大家好Sanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAPrimerGTCTT13大家好Sanger测序ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG5’3’GTCTTGGGCTAGCGC5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAGTCTT16bp14大家好Sanger测序ACGCGCCGGGT???????????????5’3’??????????????C5’TGCGCGGCCCA?????????T5’TGCGCGGCCCA21bp26bp5’TGCGCGGCCCA??????????A22bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCA????????C20bp5’TGCGCGGCCCA????T16bp15大家好5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGG19bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA22bpSanger测序GTCTTGGGCT5’TGCGCGGCCCA21bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGGGC20bp5’TGCGCGGCCCAG12bp5’TGCGCGGCCCAGT13bp5’TGCGCGGCCCAGTCTT16bp5’TGCGCGGCCCAGTC14bp5’TGCGCGGCCCAGTCT15bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTG17bp5’TGCGCGGCCCAGTCTTGG18bpLaserReader16大家好Sanger测序17大家好Sanger测序的特点测序长度500-1000bp。通量低，每次测序最多获得1kb数据，如果测大基因组，成本极高。错误率高，PCR带来错配。测序基于PCR反应，需要引物，并且有些些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。18大家好1990年10月美国确定把当年的10月1日作为官方实施HGP的起始日期，被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划启动。2000年完成草图，2003年正式完成。全部人类基因组约有2.91Gbp，约有39000多个基因。目前已经发现和定位了26000多个功能基因。耗时13年，30亿美金。人类基因组计划（HGP）19大家好1977年2005年Roche4542006年IlluminaGA2007年ABIsolid2008年Helicos

单分子测序仪2009年Pacific

单分子测序仪第一代第二代第三代二代测序技术的出现20大家好鸟枪法基因组基因组片段21大家好鸟枪法基因组片段通过剪切力，超声，酶切等打断基因组22大家好ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGT17bp66bp基本测序思路23大家好ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGTTAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC基因组:基本测序思路24大家好ATTGTTCCCACAGACCGCGGCGAAGCATTGTTCCACCGTGTTTTCCGACCGTTTCCGACCGAAATGGCTTGTTCCCACAGACCGTGAGCTCGATGCCGGCGAAGATGCCGGCGAAGCATTGTTAATGCGACCTCGATGCCACAGACCGTGTTTCCCGAAAGCATTGTTCCCACAGTGTTTTCCGACCGAAATCCGACCGAAATGGCTCCTGCCGGCGAAGCCTTGTTAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC基因组:基本测序思路25大家好Outline二代测序技术背景Solexa测序原理其他二代测序平台技术简介26大家好Solexa测序的关键技术（Illumina）桥式PCR(Solid-phasebridgeamplification)27大家好OPPPHNNOO荧光基团3’保护基团Nextcycle掺入检测去保护基团去荧光基团ODNAHNNOO3’O5’游离3‘末端XOH4种标记过的核苷酸可逆终止反应

ReversibleTerminatorChemistrySolexa测序的关键技术（Illumina）28大家好桥式PCR29大家好准备DNA片段两端接上adapters桥式PCR30大家好准备DNA片段两端接上adapters将DNA片段通过adapter锚定在芯片上循环扩增DNA片段成“DNA簇”20micronsSequence桥式PCR31大家好CAGTCATCACCTAGCGTA5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’ FirstbaseincorporatedCycle1: Addsequencingreagents DetectSignal CleaveTerminatorandDyeCycle2-n:Addsequencingreagentsandrepeat边合成边测序(SequencingBySynthesis)32