畜禽繁殖技术-第六章-繁殖生物工

第六章繁殖生物工程技术随着现代化畜牧业的迅速发展和科技进步，高度集约化的生产方式，要求最大限度地提高家畜繁殖力，与此相适应，家畜繁殖技术的研究也发展到了一个新阶段，即繁殖生物工程阶段，也就是有意识地干预或控制家畜的繁殖过程，达到缩短繁殖周期，提高家畜繁殖效能的目的。畜禽繁殖工程技术涉及到繁殖的各个环节，从性成熟、发情、配种、妊娠、分娩直到哺乳，均已研究出了一系列相应的控制方法，如目前业以中试、应用的诱导发情技术、同期发情技术、超数排卵技术、人工授精和精液冷冻保存技术、胚胎移植、诱发分娩、早期断奶、人工哺乳等技术，以及正在研究中的卵母细胞体外培养成熟和受精、卵子和胚胎的冷冻保存、性别控制与早期胚胎性别鉴定、受精卵的细胞移植、细胞核移植(无性繁殖或单性繁殖)等一些新的繁殖控制技术，必将对生物科学乃至人类社会产生重大影响，也将导致畜牧业产生惊人的技术革命。本章拟重点对发情控制技术、胚胎移植技术以及配子、胚胎生物工程等技术作一介绍。其主要内容包括：

1、发情控制技术

2、胚胎移植技术

3、配子、胚胎生物工程课题1发情控制技术【目的要求】1．熟悉同期发情、诱导发情和超数排卵的概念、意义。2．了解同期发情、诱导发情和超数排卵的机理。3．明确期发情、诱导发情和超数排卵的方法。【基本内容】1、诱导发情技术

2、同期发情技术

3、超数排卵技术【重点难点】1、诱导发情的方法

2、同期发情的方法

3、超数排卵的方法【内容讲授】发情是母畜繁殖过程中的一个重要环节，如果能够通过人为的方法改变母畜的发情活动，使一群母畜在特定的时间内同时发情，使通常产单胎的家畜能产双胎或得到更多的胚胎，从而人为地控制和调整发情、排卵规律，使母畜按照人们的要求，在一定的时间发情、排卵和配种，这就是家畜的繁殖控制。

(一)诱导发情技术

诱导发情是指对处于乏情状态(无发情周期)的母畜，利用外源激素(如促性腺激素)和某些生理活性物质(如初乳)以及环境条件的刺激，促使乏情母畜卵巢从相对静止状态转变为机能性活跃状态，以恢复母畜正常发情和排卵的技术。

1．诱导发情的意义利用诱导发情可以控制母畜的发情时间，缩短繁殖周期，增加胎次和产仔数，提高其繁殖力；可以调整产仔季节，使奶畜一年内均衡产奶，使肉畜按计划出栏，按市场需求供应畜产品，提高畜牧业经济效益。

2．诱导发情的机理家畜的一切性活动始终是在内分泌和神经系统的共同作用下进行的，用外源激素和神经刺激通过内分泌和神经的作用，激发卵巢的机能，使卵巢从相对静止状态转为活跃状态，促进卵泡的生长发育，继而使母畜发情、排卵并予以配种。

3．家畜诱导发情的方法

(1)生殖激素处理

羊

在非发情季节，对乏情期母羊用孕激素处理6-9天，在停药前：48小时按每千克体重注射孕马血清促性腺激素(PMSG)151U，母羊同期发情率可达95％以上，第一情期受胎率为70％左右；用促卵泡素(FSH)和氯地酚也可促使母羊发情排卵。产后1个月以上的泌乳母山羊，在其耳背皮下埋植60mgl8—甲基炔诺酮药管维持9天。取除药管前48小时，按每千克体重肌注PMSGl51U，与此同时，再以2mg溴隐停间隔12小时作两次注射，当母羊发情时再以促黄体素(LH)每只10微克作静脉注射后给予配种。利用这种方法可使诱导发情率达90％以上。

马非发情季节的母马，每日注射雌激素5-10mg，连续10-15天，总剂量为75-150mg，可在一定程度上恢复发情周期。

牛可从产后2周开始，采用孕激素处理10天左右，每头牛再注射PMSGl000IU，即可诱导发情。或者采用牛初乳20mL，同时注射新斯的明10mg，在发情配种时再肌注LHl00微克，可诱发80％-90％的母牛发情并排卵、受胎。

猪哺乳母猪在产后1个月断奶，将仔猪进行人工哺乳，母猪在1周左右即可发情，若在断奶时注射PMSG，则发情效果更好。如果在母猪哺乳期内实行部分断奶，即从哺乳21天开始，每天哺乳12小时，3天后再注射PMSG，则可促使母猪发情。另外，用人工合成的公猪外激素喷洒于乏情期韵母猪鼻端，可使母猪在数日内发情。

(2)改变光照期

羊母羊是由长日照过渡到短日照后开始表现发情的，在春、夏季利用人工缩短光照时间，模拟秋季的光照期，每日光照8小时，黑暗16小时，一般在处理后7—10周开始发情。

马在马厩内离地面2．5m高处悬挂200-400W灯泡，从日落开始延长5-6小时的光照时间，母马的卵巢机能可在翌年1月下旬到2月中旬提前恢复，表现出正常发情。

(3)公畜刺激在与公畜隔离的母畜群里，于发情季节到来之前，将公畜放人母畜群里，则会较好地刺激母畜，使其提前发情，即所谓的“公畜效应”(二)同期发情技术

同期发情就是采用激素或类激素的药物处理母畜，使其在特定时间内集中发情，并排出正常的卵细胞，以便达到共同配种和共同受胎的目的。

1．同期发情的意义

(1)可以促进冷冻精液更迅速更广泛的应用:采用同期发情技术可以进一步扩大冷冻精液的应用范围，提高冷冻精液设备的利用效率，使人工授精工作可以做到成批、集中、定时，不需作发情鉴定及试情工作。

(2)便于合理组织和安排畜牧业的大规模生产和进行科学的饲养管理:同期发情可以使一系列繁殖过程，如配种、妊娠、分娩、仔畜培育和断奶等相继得到同期化，这对节省劳动力和时间，合理组织管理和降低管理费用具有很大的经济意义。

(3)提高家畜繁殖率:同期发情不仅应用于发情周期正常的母畜，而且也可使乏情期的母畜出现性周期活动，缩短了母畜的繁殖周期，提高了繁殖率。

(4)为胚胎移植创造条件:家畜胚胎移植成功的关键是要求供体和受体母畜达到同期发情，这样就能使其生殖器官处于相同的生理状态，移植的胚胎才能正常发育。

2．同期发情的原理

在母畜卵巢机能和形态变化的过程中，黄体期的结束是卵泡期到来的前提条件，只要一群母畜的黄体期同时结束，‘即可引起它们同时发情。同期发情技术就是借助外源性激素直接或间接作用于卵巢，促使群体母畜卵巢的生理机能处于相同阶段，为同期发情创造一个共同的基础。

周期发情技术一般有两种途径。一种是给一群母畜同时施用孕激素类药物，抑制卵泡的生长发育和发情表现。经过一定时期后同时停药，由于卵巢上的周期黄体退化，于是同时出现卵泡发育，引起母畜同时发情(图5—45)。其实质就是人为地延长了黄体期，推迟发情期到来的作用，为该群体母畜的下一个发情周期创造一个共同的起点，使发情同期化。

另一种途径是利用性质完全不同的前列腺素，加速功能性黄体的消退，使卵巢提前摆脱体内孕激素的控制,于是群体母畜卵巢上的卵泡同时开始发育，以达到同期发情(图5—46)。这种情况实际上是缩短了母畜的发情周期，使其发情期提早出现，它只适用于有正常发情周期活动的母畜。3．使家窘周期发情的药物

(1)抑制卵泡发育的制剂。如孕酮、甲孕酮、氟孕酮、氯地孕酮、甲地孕酮及18-甲基炔诺酮等。这类药物的用药期可分为长期(14-21天)和短期(8-12天)：两种，一般不超过一个正常发情周期。

(2)，谘解黄体的制剂。前列腺素如PCf2a和氯前列烯醇具有显著的溶解黄体的作用，在用于同期发情处理时，只限于正处在黄体期的母畜。

(3)配合强化制剂。在使用同期发情药物的同时，如果配合使用促性腺，则可以增强发情同期化和提高发情率，并促使卵泡更好地成熟和排卵。这类药物常用的有孕马血靖促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、促黄体素释放激素(LHRH)，另外还有促性腺索释放激素(GnRH)和氯地酚。4．同期发情的处理方法

(1)牛前列腺素法对卵巢上有功能性黄体存在的母牛采用前列腺素类似物，剂量1－2mg，分两次子宫内灌注，再配合使用促性腺激素，6天内排卵的母牛达90％以上，并且大多集中在用药后3-5天内排卵。

埋植法应用孕激素药物时多采用18—甲基炔诺酮作皮下埋植，一般用量为；18－25mg，经10-12天后除去药管，为提高效果，也可以配合使用促性腺激素。

阴道栓塞法：用孕激素阴道栓预处理7天，并于第6天结合使用PGF2a，第乍灵撤除孕激素阴道栓即可。

(2)羊

阴道栓塞法将一块消毒过的泡沫塑料(直径和厚度各2—3cm)拴上细线，浸以孕激素制剂溶液，制成阴道栓，在子宫颈外口处放置14-16天后取出，并肌注PMSG400-7501U，2-3天后大多数母羊发情，于发情当天和次日各输精一次。其药物种类和用量为：甲孕酮40-60mg，用地孕酮40-5mg吨，18—甲基炔诺酮30-40mg，氯地孕酮20-30mg，氟孕酮30－60mg；孕酮150-300mg.

前列腺素法在发情结束后数日，向母羊子宫注入或肌注前列腺素，用药后2－3天内大多数处理母羊发情，药物用量为牛的1／4，类似于牛的同期发情处理方法。

(3)马

一般使用前列腺素处理，其方法与牛相似，两次处理的时间间隔为8天，结合使用促性腺激素时效果更好。

(4)猪断奶配合激素对猪切实可行的方法是结合断奶进行，如在产后4-6周，使一群母猪同时断奶，可造成自然的同期发情。但在断奶时同时注射：PMSG750-1500IU或在肌注PMSG的同时，再注射HCG5001U，效果较好。非激素制剂对各种生理状态的母猪，利用氯地酚可引起同期发情。使用时，先用少量酒精溶解，然后加入生理盐水，使氯地酚含量达到20mg／mL，每次注射氯地酚30-40mg，注射后4-7天，大多数母猪皆发情。各种家畜同期发情处理的效果如何，受多种因素的影响，如母畜的生理状态、年龄、体况和药物种类、质量、剂量和施用方式等。如果被处理的母富有80-90％集中在处理后第2天4天内表现发情，情期受胎率达50—60％或相当于当地自然发情的受胎率，同期发情技术便认为是成功的，可以在生产中广泛应用。(三)超数排卵技术

应用外源性促性腺激素诱发母畜卵巢的多个卵泡同时发育，并排出具有受精能力的卵的方法称为超数排卵，简称“超排”

1、超数排卵的意义

哺乳动物的初生卵巢上含有20万-40万个卵母细胞，但在自然条件下仅有数十个卵母细胞得l~AiE常发育并排卵。为了提高动物的繁殖效率，应用超排技术可以使每次排卵数由1-3个增加至10-20个：，或经过超排处理后，人工由母畜卵巢回收卵母细胞并培养成熟，使之受精形成早期胚胎，以开发卵母细胞资源，充分挖掘优良母畜的繁殖潜力，加速品种改良。

2．超数排卵的原理自然情况下，家畜卵巢上约有99％的有腔卵泡发生闭锁而退化，只有1％能发育成熟而排卵。在家畜有腔卵泡闭锁之前，注射FSH或PMSG可使大量卵泡不闭锁而正常发育成熟，在排卵之前注射Ht或HCG补充内源性LH的不足，可保证这些大量成熟卵泡同时排卵，形成超数排卵。3、各种家畜的超数排卵处理的方法

羊

成年母羊在预定发情到来之前的4天，即发情周期的第12-13天，皮下或肌注PMSG750-10001U，发情或配种当日肌注HCG500-7501U，则可达到超数排卵目的；也可以在同样时间开始注射FSH代替PMSG，用LH代替HCG，FSH连续注射3天，每天上、下午各注射4-5mg，共200-3001U，LH100-1501U。

牛

在胚胎移植时采用，处理方法同羊。在预计发情到来之前的4天，即发情周期第14-16天注射PMSG或FSH，经4天或发情后再注射HGG，其用量为羊的3-4倍。目前采用的方法多在发情周期的第9-11天开始用递减法注射FSH，每日两次：连续4

天，总剂量为32-40mg(或360-400IU)，开始注射后第3天或48小时肌注前列腺素PGF2a

2-4mg。

4．超数排卵的效果

(1)受胎率超数排卵处理的卵子受精率和母畜受胎率均低于自然发情的受精率和受胎率。回收胚胎的时间越晚，变性胚胎的比例就越大，因此回收胚胎的时间应适宜。

(2)排卵数供体母畜一次超数排卵的数目不宜过多，两侧卵巢第一次排卵以10-15枚较好。

(3)发情率应用促性腺激素和PGF2a进行超排处理时，有60-80％的母畜有发情表现，有的供体虽不表现发情，却能正常排卵。

(4)发情出现时间和胚胎回收率超数排卵处理时，供体母畜在注射PGF2a。后48小时以内发情者胚胎的回收率最高，72小时以后发情者胚胎的回收率大为下降，而且大多为未受精卵。

(5)发情周期超数排卵后的母畜，血液中含有高浓度的孕激素，因而发情周期延长。【复习思考】1、名词：诱导发情、同期发情、超数排卵2、诱导发情、同期发情、超数排卵的意义3、诱导发情、同期发情、超数排卵的方法【目的要求】

1．熟悉体外受精、性别控制、性别鉴定、卵核移植、动物克隆、胚胎分割与嵌合、基因导入等技术的的概念、意义。2．了解体外受精、性别控制、性别鉴定、卵核移植、动物克隆、胚胎分割与嵌合、基因导入等技术的基本原理。3．明确体外受精、性别控制、性别鉴定、卵核移植、动物克隆、胚胎分割与嵌合、基因导入等技术的实施程序。【基本内容】

1、体外受精技术

2、胚胎性别控制及鉴定技术

3、核移植与动物克隆技术

4、胚胎分割与嵌合技术

5、基因导入技术【重点难点】

本课题只作一般性介绍。课题2胚胎生物工程技术【内容讲授】

一、体外受精技术体外受精技术是动物胚胎工程的一项重要技术，是指通过人为操作使精子和卵在体外环境中完成受精过程。体外受精技术不仅对揭示卵母细胞成熟和受精机理具有重要的理论意义，而且对畜牧业的发展具有广泛的应用前景。其操作技术如下：

1．精子采集与获能处理精子的采集可采用射出精子或附睾尾精子。精子可在体内子宫中获能，也可在体外获能。

2．卵母细胞采集与成熟培养将屠宰动物的卵巢取出，用生理盐水冲洗后，放入盛有生理盐水的保温瓶内运回实验室，用注射器针头抽取卵母细胞。然后将卵母细胞放在培养液中，在39cC和5％C02气相条件下培养24小时左右。

3．精卵体外受精将成熟培养的卵母细胞先用受精液洗涤三次，然后加入获能精子，置于C02培养箱孵育。

4．受精的判定在精子和卵母细胞进行体外受精的过程中，隔一定时间检查受精情况，如在固定染色的整装片上出现精子穿人卵内、精子头部膨大、精于头部和尾部在卵细胞质内存在、第二极体的排出、原核的形成和正常的卵裂等即确定为受精。如将受精卵移植到同期发情的受体中，能产出正常的试管后代，这是判断体外受精成功的最确凿的证据。

5．体外受精卵(早期胚胎)的培养发育将受精卵移入培养液中继续培养，为了克服早期胚胎体外发育阻滞现象，并获得较高的发育率，多采用与卵丘细胞、输卵管上皮细胞等共同培养的方法，使其发育至桑葚期或囊胚期，然后即可用于胚胎移植或其他生物工程的操作。

1981年6月9日，世界上第一个体外受精的牛犊在美国产生。迄今为止，已有20余种哺乳动物体外受精获得成功，我国在这一技术上研究起步较晚，但进展十分迅速，目前已在绵羊、奶牛、水牛、山羊、猪等家畜及多种动物上获得成功，步人了世界先进行列，有的达到国际领先水平。

二、胚胎性别控制及性别鉴定技术

（一）胚胎性别控制技术

胚胎性别控制是指结合胚胎移植技术，选择所需性别的胚胎，或将所需性别的胚胎作为核移植的供体细胞，反复克隆，以无性繁殖的方式生产相应性别的胚胎，进而使母畜按人们的愿望繁殖所需性别的后代。方法主要有：1、X、Y精子的分离精于分离主要依据是X、Y精子在DNA含量、大小、比重、活力、膜电荷、酶类、细胞表面、移动速度、抵抗力上等均有差异，但差异甚小。其主要分离方法有沉降法、离心沉降法、密度梯度离心法、过滤法、层析法、电泳法及免疫学方法等。但目前均没有取得稳定可靠的结果。从研究现状看，分离X、Y精子还存在相当大的困难，与生产应用尚有一定距离。

2．改变受精环境雄性动物产生X或Y精子，有支配性别的决定权；而雌性动物有支配性别的选择权，改变母畜受精的环境，有可能改变性比例。（1）酸性与碱性环境：酸性环境有利于雄性发育，而碱性有利于雌性发育。多喂谷物（酸性）雌雄比例为1：1.7，多喂青贮饲料（碱性）则相反。日本的学者利用5％精氨酸（碱性）预先处理子宫颈后输精，使牛的母犊控制率达80％。（2）营养环境：伯罗斯和柯瓦列夫斯基发现战争、饥荒年代和营养不良的母亲生男孩儿多。（3）气候环境：娄根娜等人试验观察奶牛在较温暖的春夏季节交配，比在秋冬时交配有较多的母犊。（4）双亲年龄：娄根娜等人发现中年双亲多生雌性，父比母大多生雄性。（5）交配次数：实验表明，一天内多次交配雄性较多。（6）受精时间：卵子刚排出时受精雌性多，相反雄性多。(二)胚胎的性别鉴定

对胚胎的性别进行鉴定，选择(淘汰)某一性别的胚胎，仍不失为一种控制后代性别较为理想的方法。

1．细胞遗传学方法

(1)性染色质染色法雌性胚胎的两个X染色体中。有一条处于暂时失活状态并固缩，有特殊的染色反应，这种性染色质小体称为Barr小体。Gar&ar根据性染色质鉴定家兔囊胚(6月龄)的性别，准确率为100％。但对其他大家畜来说，胚胎细胞的Barr小体不易观察，所以未能普遍应用。

(2)染色体组型分析法从胚胎取出部分细胞直接进行染色体分析或阻断培养至细胞分裂中期再进行染色体分析，对胚胎进行性别鉴定。据报道用此法鉴别牛胚胎性别准确率达70％一80％。

2．X染色体连锁酶活性测定法在小鼠，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、磷酸葡萄糖激酶及。a—乳糖酶等与X染色体的数量有关。Rieger和Williams(1986)通过检测X染色体连锁酶来判别小鼠胚胎的性别，雌性胚胎鉴别准确率达72％。

3．Y染色体特异性基因探针法

Leonard(1987)首次报道用牛Y染色体特异性探针鉴定牛囊胚性别获得成功，准确率为95％；Herr(1990)首先采用PCR技术扩增Y染色体特异性，重复序列鉴定了牛、羊胚胎性别；Peura(1991)用PCR技术对牛的部分胚胎进行了鉴定，准确率达90％一95％。

Sinclair等(1990)找到了位于哺乳动物Y染色体短臂上决定雌性的DNA，片断，这一特定的DNA片断，定名为SRY(性别决定区或叫性别决定因子)。SRY的发现和测定技术的成功，为胚胎性别鉴定提供了技术途径，与聚合酶链反应(PCR)扩增技术相结合，用于胚胎的性别鉴定准确率可达100％，此法具有省时，灵敏度高，特异性专一等优点。因此，是很有前途的方法。

4．免疫法

(1)细胞毒性法将胚胎与H-Y抗血清及补体混合培养，表达H-Y抗原的胚胎其细胞有一定程序的裂解，则判定为雄性。据Epstein(1990)报道，小鼠的8细胞胚胎放人补体和抗血清之后，半数致死、退化或出现死细胞，分析未受影响胚胎的染色体组型，92％为雌性。

(2)间接免疫荧光法将胚胎在H-Y抗血清或单克隆抗体中培养，然后再加入带荧光素标记的第二抗体，在荧光显微镜下观察胚胎是否呈现特异性荧光。判定标准是：H-Y阳性(即胚胎整个内细胞上有光斑，均匀荧光为背景)判为雄性。H-Y阴性(即胚胎背景黑暗，无荧光斑，偶尔有少许亮点，无光斑)判为雌性。Wachtel(1984)用间接免疫荧光鉴别8枚牛胚胎，移植后产犊7头与性别判定相符。White(1984、1987)成功用此法鉴定了羊、猪胚胎性别，在绵羊中产羔后验证准确率为100％，在猪中雌性胚胎准确率为86％，雄性为77％。

三、核移植与动物克隆技术

核移植也称克隆或无性繁殖，是将分离的胚胎卵裂球(核供体)或体细胞核与成熟并去核的卵母细胞或去核的原核期受精卵或2细胞期的去核胚胎(核受体)融合，不经过有性繁殖过程，连续不断地复制遗传上相同的胚胎，并通过克隆胚胎的移植生产大量同基因型的克隆动物系或动物群的…项动物繁殖新技术。应用核移植技术可以控制家畜的性别；可以复制大量基因型相同的高产家畜；可以为家畜育种提供珍贵的遗传材料；可以加速家畜遗传改良的进程。细胞核供体一般采用早期胚胎或体细胞核，再用显微操作仪将其注入到去核的卵母细胞的卵周隙内，借助电刺激，使核供体的细胞核与核受体细胞质融合，融合后的胚胎经培养发育，移植到受体内妊娠产仔。核受体除用成熟并去核的卵母细胞外，也可用去核的原核期的受精卵或2细胞期去核的早期胚胎。哺乳动物核移植首先1983年在小鼠获得成功，随后绵羊在1987年，牛1987年，兔1988年，猪1989年，羊1991年获得成功。Stice等(1992)研究了牛细胞核连续移植技术，并获得了第三世代的核移植后代。在理论上，核移植可获得无限的克隆动物。种间核质杂交是通过核移植将来源于不同种的供体细胞核与受体细胞质重组在一起的方法。Nolfel(1992)获得了不同属间(多个牛X牛、羊X羊)的核杂交囊胚，但囊胚率都很低(1．7-2．3％)。四、胚胎分割

胚胎分割是通过对胚胎显微操作，人工制造同卵双胎或同卵宰胎的方法。胚胎分割是扩大胚胎来源的一条重要途径和方法。Leibo(1987)分割422枚牛胚胎，移植842个牛胚，结果441头妊娠，半胚移植妊娠率达52．4％，可获得一卵双生或多生，避免牛的异性孪生不育。通过分割胚的冷冻保存，可先移植一半，另一半冷冻保存，待移植的那半胚产仔证实是优秀的个体后，再将冷冻保存的半胚解冻和移植。胚胎分割为性别鉴定也提供了可能性。早期胚胎的每个细胞都具有独立发育成一个个体的能力，这是胚胎分割得以成功的理论依据。胚胎分割有两种方法，一种是对2～16细胞期胚胎，用显微操作仪上的玻璃针或刀片将每个卵裂球或2个卵裂球为一组或4个卵裂球为一组进行分割，分别放人一个空透明带内，然后进行移植。另一种方法是用上述相同的方法将桑椹胚或早期囊胚一分为二或一分为四，将每块细胞团移人一个空透明带内，然后进行移植。目前将不移人透明带内的经分割的细胞或细胞块称裸胚，直接移植也获成功。得到了牛、绵羊、山羊、猪、兔等通过胚胎分割而产生的同卵双生后代，四分胚在牛、绵羊上也相继成功。冷冻胚胎分割在牛和绵羊也已成功。

五、胚胎嵌合

胚胎嵌合又称胚胎，(受精卵)的融合，是近年来继胚胎分割后又一种新的生物技术。生物学上所说的嵌合体(Chimera)系指由不同基因型的细胞和组织混合在同一个体，由2个或2个以上的受精卵发育而成的复合体，它具有2个以上亲代的特性。动物胚胎嵌合不但对品种改良及新品种培育具有重大意义，而且为不同品种间的杂交改良开辟了新的渠道，对分析胚胎的发生机制和基因表达机制以及了解性别分化或免疫机理等均具有极广泛的利用价值。

胚胎嵌合体的制造方法主要有分裂球融合法和细胞注入法两种。分裂球融合法就是将2个以上胚胎的分裂球相互融合，形成一个胚胎。细胞注入法，就是把其他的细胞团注入到囊胚腔内，使之与原来的内细胞团融合在一起。在畜禽中已培育出山羊一绵羊以及鹌鹑一鸡等嵌合体动物。

六、基因导入（转基因）技术

基因导入系指通过显微操作手段将外源的特定基因导入胚胎中，从而获得转基因动物的技术。通过导入外源基因获得转基因家畜的意义主要有以下方面：

1．提高家畜的经济性状给家畜导人外源生长激素基因，可提高生长速度、饲料转化率或胴体品质。如1987年美国康奈尔大学用导人外源生长激素基因的方法培育瘦肉型猪，取得成功，这种猪的生长速率比普通猪快15％～18％。

2．改变畜产品组成结构通过导人外源基因可从遗传性上改变畜产品(肉、蛋、奶、毛)的组成结构，如能将乳蛋白基因、乳酪蛋白基因导人奶牛中生产新型乳制品’。

3．以家畜为宿主生产有用的生物活性物质是将编码有用的生物活性物质的基因导入家畜细胞中，使目的基因在家畜体内表达，这样有用的生物活性物质作为血液或乳汁成分便可被大量、持续地生产出来。如美国科学家将编码血液凝固基因导人绵羊，培育出转基因绵羊，可从乳汁中大量采集血液凝固因子，将其用于血液病患者便可起到很大作用。

4．抗病育种例如将干扰素基因的结构基因和肝脏中特异性表达的基因启动子相连接并导人家畜中，有可能培育出干扰素产生能力强，且可以遗传的转基因家畜。现行外源基因导人方法主要有：

1．病毒感染法即将目的基因整合到反转录病毒的原病毒上，然后将基因直接注入胚胎，或给动物的培养细胞接毒并与胚胎一起培养，以使病毒感染胚胎.

2．微注射法即将目的基因通过显微操作，直接注入受精卵的原核中。迄今所报道的转基因小鼠大部分是用这种方法培育的。

3．胚胎干细胞法即将外源基因导入胚胎干细胞中，基因的整合、表达程度等都可在于细胞阶段运行选择，进而再产生转基因动物。

4．精子载体法即将外源DNA与获能精于一起孵背后，以精子作为载体，与卵子体外受精。该方法已在小鼠、绵羊获得成功。尽管目前基因导人过程中尚有许多困难有待克服，将这项技术广泛用于家畜尚存在很多技术性问题，但已得到了转基因猪、兔、牛、羊、鼠的后代。随着研究的不断深入，预计随着这项技术的日趋成熟，它将给畜牧业发展插上腾飞的翅膀。课题3胚胎移植技术【目的要求】1．明确胚胎移植技术的的概念、意义。2．熟悉胚胎移植技术的基本方法。3．掌握胚胎移植技术的实施程序。【基本内容】1、概述

3、同期发情和超数排卵的实施

4、胚胎采集

5、胚胎的检查与鉴定

6、胚胎保存

7、胚胎移植技术【重点难点】

本课题只作一般性介绍。【内容讲述】一、概述

(一)含义

是将一头优良母畜配种后的早期胚胎取出，移植到另一头同种的生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体，也叫借腹怀胎。提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个体称为受体。供体决定其遗传特性；受体只影响其体质发育o(二)意义如果说人工授精技术是提高优良公畜配种效率的有效方法，那么胚胎移植则是为提高优良母畜的繁殖力提供了新的技术途径。

1．充分发挥优良母畜的繁殖潜力一则使优良供体省去很长的怀孕期、缩短繁殖周期；二则实行超数排卵，一次可获得更多的优良胚胎，与提高优良公畜的配种效能的人工授精技术相对应；如一次可获得9头以上的犊牛、10头以上的羔羊。

2．缩短世代间隔，及早进行后裔测定短期内重复进行超排处理，大大提高了后代总数，可尽早了解母畜遗传力o3．提高生产效率诱发肉畜杯2胎，即向已配种的母畜(排卵的对侧子宫角)移植一个胚胎，或者向未配种的母畜移植两个胚胎。

4．代替种畜的引进胚胎的冷冻保存可以使胚胎移植跨地域和时空，大大节约购买和运输活畜的费用。此外可以从养母得到免疫能力，更容易适应本地区的生态环境o5．保存晶种资源胚胎的冷冻保存，可以避免因遭受意外灾害而灭绝。且费用远远低于活畜保存，并且它与冷冻精液可共同构成动物优良性状的基因库。

6．有利子防制疫病在养猪业中，为了建立S1)F猪群，向封闭猪群引进新个体时，为了控制疫病，往往采取胚胎移植技术代替剖腹取仔的方法。7．提供研究手段胚胎移植是研究受精作用、

(三)胚胎移植的基本原则

1．胚胎移植前后所处环境的同一性(1)供体和受体在分类学上的相同属性，即两者须属于同一物种。(2)动物生理上的一致性。即受体和供体在发情时间上的同期性，一般要求相差24h以内。(3)动物解剖部位的一致性。即移植后的胚胎与移植前，所处的空间环境相似性。2．胚胎发育的期限胚胎采集和移植的期限(胚胎的日龄)不能超过周期黄体的寿命，最迟要在周期黄体退化之前数日进行移植。通常在供体发情配种后3～8d收集胚胎，受体同时接受移植。3．胚胎的质量胚胎不应受到任何不良因素(物理、化学、微生物等)的影响而危及生命力。必须经过鉴定确认为正常者。4．供、受体的状况供体的生产性能、经济价值均须大于受体；两者均须健康无病。此外，还需强调的是胚胎移植只是空间位置的更换，而不是生理环境的改变；远比器官移植简单。但准确熟练的操作是必需的。

(四)胚胎移植的技术程序

主要包括1、供体的超数排卵。2、供体和受体的同期发情处理、3、供体的发情鉴定与配种。4、胚胎的收集、胚胎的检查与鉴定。5、胚胎的培养与保存。6、胚胎移植(图8—1)。三、同期发情和超数排卵的实施(一)供体和受体的选择供体应具有高的育种价值，旺盛的生殖机能，对超排反应良好；受体的头数应多于供体，具有良好的繁殖性能和健康状态，体形中上等。二者发情时间相同或相近，前后不超过1d。(二)供体和受体的同期发情当前较理想的同期发情药物是前列腺素及其类似物，其剂量根据药物的种类和方法而不同。采用子宫灌注的剂量要低于肌肉注射的剂量。在注射PGF2。后2h，配合注射PMSG或FSH，可以明显提高同期发情效果。(三)供体母畜的超数排卵

1．母牛用FSH超排，在发情的9一13d中的任何一天开始肌注FSH。以递减剂量连续注射4d，每天注射2次(间隔12h)，总剂量按牛体重、胎次作适当调整，总剂量为300～400大鼠单位。在第一次注射FSH后48h及60h，各肌注一次PGF2a，每次2—4mg，若采用子宫灌注剂量可减半。进口PGF2a及其类似物，由于产地、厂家不同所用剂量不一，ICl80996一次剂量约为0．5mg。用PMSG超排，在发情周期的第11—13d中的任意一天肌注一次即可，按每千克体重51U确定PMSG总剂量，在注射PMSG后48h及60h分别肌注PGF2a。一次，剂量同FSH超排。母牛出现发情后12h再肌注抗PMSG，剂量以能中和PMSG的活性为准。

2．母羊用FSH超排，在发情周期第12或13d，开始肌注或皮下注射，以递减剂量连续注射3d6次，每次间隔12h，总剂量为200—350大鼠单位，PGF2a。在第5d同时注射。FSH注射后随即每天上下午进行试情，发情后立即静脉注射LHl00—150大鼠单位或肌注200大鼠单位并配种。有的用60大鼠单位的GnRH代替LH，亦获得同样效果。用PMSG超排，在发情周期的12或13d，次肌注或皮下注射PMSG700—15001U，出现发情或当天再肌注HcG500～7501U。在PMSG注射之后，隔日注射PGF2a或其类似物。(四)供体的发情鉴定和配种

超排处理结束后，要密切观察供体的发情症状。正常情况下，供体大多数在超排处理结束后12～48h发情。以牛为例，发情鉴定主要以接受其他牛爬跨且站立不动为主要判定标准。每天早中晚至少观察3次。第一次观察到接受爬跨且站立不动的时间，视为零时，由于超排处理后排卵数较正常发情牛多且排卵时间不一致，加上精子和卵子的运行受排卵处理的影响，为了确保卵子受精，采取增加输精次数和加大输精量的方法；新鲜精液优于冷冻精液。一般在发情后8～12h输第一次精，以后间隔8～12h再输精一次。

四、胚胎采集利用冲洗液将胚胎由生殖道中冲出，并收集在器皿中。分手术法和非手术法(牛、马)两种。

(一)胚胎采集前的准备

1．冲胚液、培养液的配制(表8—1)冲胚液和培养液在使用前都要加入血清白蛋白，含量一般为0.1～3.2％，也可用犊牛血清代替，需加热(560C水浴30min)灭活其中的补体，以利胚胎存活。冲胚液血清含量一般为3％(1～5％)，培养液血清含量为20％(10～50％)。2．采集时间

不应早于排卵后的第1d，即最早要在发生第一次卵裂后(发育至4—8个细胞以上为宜)，否则不宜辨别卵子是否受精(表8—2)。一般是在配种后3～8d（牛：非手术法取胚在发情配种后7d；绵羊：从输卵管取胚，适宜时间为发情后2．5d(56～76h），从子宫采胚大都在发情后6d。(二)胚胎采集方法

1．牛手术法收集胚胎在腹部适当部位(腹中线或肷窝)作一lOcm左右切口。输卵管冲胚法：第一种方式用注射器的磨钝针头刺人子宫角尖端，注入冲卵液，然后从输卵管的伞部接取(上行法)，这种方式适合于牛羊兔等(图8-4上)；第二种方式与此相反(下行法)，伞部注入，子宫角上端接取(图8-4中)，猪马采用。上述两种方法适合于胚胎还处于输卵管或刚进入子宫角时(排卵后4d以内)。冲卵液用量lOml。（1）子宫角冲胚法：当一旦确认胚胎已进入子宫角内，可采用此法。一种是从子宫角上端注入冲卵液，由基部接取(图8-4下)；另一种是由子宫角基部注入、上端接取。这两种方式适合手各种家畜。冲卵液用量一般为30－50ml(以子宫角容积而定)。（2）输卵管一子宫角冲胚法：结合以上两种方法，可以把输卵管和子宫角的胚胎全部冲洗出来，采胚率高。

2．羊的手术采胚法

基本方法与牛相同。不同点是：采胚的手术部位比牛多，可选择左右腹股沟部、肷窝及耻骨部；切口一般长4～6cm；冲胚液量比牛少，输卵管冲胚2—4ml、子宫角冲胚10—20mlo手术法要求：操作迅速准确，防止对伤口及生殖道和冲洗液的污染；避免对动物有过多刺激和对生殖道造成损伤。此法最大的缺点易造成粘连和不孕。3．非手术法

目前在牛、马大家畜都采用此法。一般在配种后7d进行。采用二路式导管冲卵器：将冲卵液通过内管注入子宫角内，然后导出冲卵液，外管前端连接一气囊，当将冲卵器插入子宫内时，充气使气囊胀大，堵住子宫颈内口，以免冲卵液经子宫颈流出(图8—5