酶的固定化与酶反应器

酶的固定化与酶反应器提纲§3.1引言§3.2酶的固定化§3.3细胞的固定化§3.4固定化酶与固定化细胞的应用§3.5酶及固定化酶反应器第2页,共85页，2024年2月25日，星期天第一节引言

酶的应用受到限制的原因

◆稳定性差，在温度、pH和无机离子等外界等因素的影响下容易变性；◆反应后从反应混合物中回收有活性的酶使其重复利用有困难，这种一次性的使用方式使得生产成本高，且难以连续化；◆酶反应后成为杂质与产物混合在一起，给后续分离带来困难。

怎样获得理想的生物催化剂？20世纪50年代固定化技术正是出于此目的发展起来的第3页,共85页，2024年2月25日，星期天1953年，德国人采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮法活化后分别与羧肽酶、淀粉酶等结合制成不容与水的固定化酶60年代后期，固定化技术迅速发展。1969年，日本千烟一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶生产L-氨基酸；1978年，日本人用固定化枯草杆菌细胞生产α-淀粉酶；1982年，日本首次研究固定化原生质体生产谷氨酸取得进展在我国，华南理工大学在固定化技术方面有些研究。1984年，郭勇等人首次应用固定化细胞生产α-淀粉酶、糖化酶和果胶酶研究；1986年，应用固定化原生质体生产碱性磷酸酶取得成功

(作业：综述我国固定化酶技术的研究进展及应用概况)

酶固定化技术的发展

第4页,共85页，2024年2月25日，星期天

固定化酶的定义

固定化酶的制备原则

酶的固定化方法

固定化酶的性质

辅酶的固定化第二节酶的固定化第5页,共85页，2024年2月25日，星期天固定化酶的定义一、基本概念

所谓固定化酶指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收利用。固定化所采用的酶，可以是经提取分离后得到的有一定纯度的酶，也可以是结合在菌体(死细胞)或细胞碎片上的酶或酶系。固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定化菌体，它是固定化酶的一种形式。在固定化细胞(活细胞)出现之前，也有人将固定化菌体称为固定化细胞。第6页,共85页，2024年2月25日，星期天优点：

①极易将固定化酶与底物、产物分开；②可以在较长时间内进行反复分子化反应和装柱连续反应；③大多数情况下能提高酶的稳定性；④产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；⑤酶的使用效率高，成本降低。二、固定化酶与游离酶相比的特点：第7页,共85页，2024年2月25日，星期天

缺点：

①固定化时酶活力有损失，如交联的枯草杆菌蛋白酶晶体水解氨基酸酯的活力比可溶性酶低96.4%，然而固定化的脂肪酶合成酶的活力比游离酶增加40倍；②增加了生产的成本，工厂初始投资大；③只能用于可溶性底物，而且适用于小分子底物，对大分子底物不适合；④与完整菌体相比，不适宜于多酶反应，尤其是需要辅助因子反应；⑤胞内酶必须经过酶的分离手续。第8页,共85页，2024年2月25日，星期天制备固定化酶要遵循几个基本原则：必须注意维持酶的催化活性及专一性；固定化应该有利于生产自动化、连续化，为此载体必须有一定的机械强度；固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近；酶与载体必须牢固结合，有利于回收、反复利用；应由最大的稳定性，所选载体不与底物、产物反应；成本低，有利于工业使用。固定化酶的制备原则第9页,共85页，2024年2月25日，星期天

非共价结合法

化学结合法

包埋法

逆胶束酶反应系统热处理法酶的固定化方法第10页,共85页，2024年2月25日，星期天非共价结合法结晶法

就是使酶结晶从而实现固定化的方法。晶体酶提供了高的酶浓度，对于活力较低的酶来说具有优越性。局限性：不断的重复循环中，酶会有耗损。物理吸附法

利用固体吸附剂将酶吸附于其表面而使酶固定化的方法。

常用的载体：☆无机载体：多孔玻璃、活性炭、漂白土、硅胶；

☆天然高分子载体：淀粉、胶原蛋白等；☆大孔树脂优点：酶活性中心不易被破坏和酶的高级结构变化少，酶活力损失少

缺点：酶与载体相互作用弱，酶易脱落第11页,共85页，2024年2月25日，星期天离子结合法

酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。载体：☆阴离子交换剂：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等☆阳离子交换剂：CM-纤维素

特点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的残基部已被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。其吸附量可达50-150mg酶蛋白/g载体

缺点：结合力较弱，酶与载体的结合不牢固，在pH值和离子强度等条件改变时，酶易脱落。第12页,共85页，2024年2月25日，星期天以固定化氨基酰化酶为例将处理成一OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加至含有氨基酰化酶的0.1mol／L的pH.7.0磷酸缓冲液中，于37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。将处理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处理，使之成为OH型，用无离子水冲洗，再用pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶溶于pH7.0的0.1m01／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液，在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰-DL—氨基酸，生产L—氨基酸。第13页,共85页，2024年2月25日，星期天1.共价结合法

——酶与载体以共价键结合的固定化方法

◆酶分子中可以形成共价键的基团：氨基、羧基、巯基、羟基、酚羟基和咪唑基等。

◆共价键结合法所采用的载体：

天然有机载体：多糖、蛋白质、细胞等；

无机载体：玻璃、陶瓷等；

合成聚合物：聚酯、聚氨、尼龙等

◆载体的活化：借助于某种方法，在载体上引进某一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。化学结合法——共价结合法；交联法第14页,共85页，2024年2月25日，星期天◆载体的活化方法

纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，可用溴化氢法、活化酯法、环氧化法及三嗪法。

①溴化氢法：能在非常温和的条件下与酶蛋白的氨基发生反应而普遍使用，用溴化氢活化的琼脂糖已在实验室广泛用于制备固定化酶。ROHOH[ROHNOC]ROOC=NHR-O-C-NH-ER-O-C-NH-ENHROOC=N-E亚胺碳酸酯型异脲型氨基甲酸酯型H2N+E碱性CNBr(一)羟基聚合物亚氨基碳酸酯衍生物第15页,共85页，2024年2月25日，星期天②三嗪法HClClR-O-R’-ClH2N-EHS-EOH-ER-O-R’-NH-ER-O-R’-S-ER-O-R’-O-ER-OH+RCNNCNCO+三氯-均三嗪ClCNNCNCClClCl第16页,共85页，2024年2月25日，星期天③活化酯法④环氧化法第17页,共85页，2024年2月25日，星期天小结对于含羟基的聚合物载体的活化可以采用：溴化氰法、三嗪法、活化酯法和环氧化法活化，其中溴化氰法活化的琼脂糖已经在实验室被广泛用于制备固定化酶。第18页,共85页，2024年2月25日，星期天（二）多胺载体①重氮法：具有芳香族氨基酸的载体在稀盐酸和亚硝酸钠中进行反应，成为重氮盐化合物，然后与酶发生偶合反应得到固定化酶。酶蛋白中游离的氨基、咪唑基、酚羟基等参与反应。

R-O-CH2NH2+HNO2

R-O-CH2N+N

R-O-CH2N=N-EHCl第19页,共85页，2024年2月25日，星期天②甘蔗渣或纤维素等多糖类的载体在碱性条件下与β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA）反应，生成对氨基苯磺酰乙基纤维素（ABSE-纤维素），然后再重氮化，与酶偶联。

优点：采用比较廉价的纤维素作载体，在酶分子与载体间间隔了ABSE基团，这样偶联的载体上的酶蛋白分子有较大的摆动自由度，可以减少载体造成的空间位阻。第20页,共85页，2024年2月25日，星期天（三）羧基载体②叠氮法①酰肼衍生物第21页,共85页，2024年2月25日，星期天酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。反应条件苛刻，操作复杂由于共价结合可能引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，因此不能达到比活力较高的固定化酶，酶活回收率一般在30%左右，甚至底物的专一性等酶的性质会发生变化◆共价结合法的特点现已有活化载体的商品出售，如商品名为偶联凝胶（couplinggel）第22页,共85页，2024年2月25日，星期天2.交联法

—用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物细胞和细胞之间交联的固定化方法。

双功能试剂：戊二醛、乙二胺、双偶氮联苯胺等，其中应用最广泛的是戊二醛。参与反应的酶蛋白基团：N-末端的α-NH3ε-NH3、酚羟基、咪唑基、巯基等。戊二醛的反应：第23页,共85页，2024年2月25日，星期天交联法的特点

制备的固定化酶结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈。酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。

将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。例如，将酶先用凝胶包埋后再用戊二醛交联，或先将酶用硅胶等吸附后再进行交联等。这种固定化方法称为双重固定化法。双重固定化法已在酶和菌体固定化方面广泛采用，可制备出酶活性高、机械强度又好的固定化酶或固定化菌体。第24页,共85页，2024年2月25日，星期天

将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法，又分为网格型和微囊型两种方法。网格型：将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型包埋法海藻酸钙凝胶、K-角叉菜胶、琼脂凝胶等特点：条件温和，对酶活性影响小，但强度差

合成凝胶：常用载体：天然凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂、聚乙烯醇等特点：强度高，对温度、pH耐受性强，但需一定条件才能反应，易引起酶部分失活。

第25页,共85页，2024年2月25日，星期天以聚丙烯酰胺凝胶为例在含有酶（或细胞）的水溶液中加入一定比例的单体丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）和交联剂N,N’-甲撑双丙烯酰胺；在催化剂（二甲氨基丙氰）和引发剂（过硫酸钾）的作用下低温（冰浴）聚合，产生的聚合物凝胶便是固定化酶；通过机械方法分散成一定大小的颗粒以供应用。

此法固定量高，可达10-100mg/g单体，是固定化微生物中用得最多的、最有效的方法。第26页,共85页，2024年2月25日，星期天微囊型：将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。制备微囊型固定化酶的方法：

♫界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有机相界面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋的方法。常用的作为膜材料的高聚物有：硝酸纤维素、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等。例如：三醋酸纤维能溶于二氯甲烷，但在甲苯溶液中沉淀析出。酶水溶液+含醋酸纤维的二氯甲烷乳浊液，在搅拌的条件下，混入甲苯中，三醋酸纤维便在水相界面沉淀，形成薄膜。第27页,共85页，2024年2月25日，星期天♫界面聚合法：利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶的方法。

例如：酶水溶液与1,6-己二胺水溶液混合，立即在含有Span-85的氯仿-环己烷中分散乳化，加入溶于有机相的癸二酰氯后，便在油水界面上发生聚合反应，形成尼龙膜，将酶包埋。

特点：此法制备的微囊大小能随乳化剂浓度和乳化时的搅拌速度而自由控制；制备过程所需时间短；但在包埋过程中由于发生化学反应会引起酶失活。第28页,共85页，2024年2月25日，星期天包埋法的特点♫不需要酶蛋白的氨基酸残基反应，很少改变酶的结构，酶活回收率高；♫在包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活；♫只有水分子可以通过，高分子凝胶的网格扩散，只适用于作用小分子底物和产物的酶。♫二级乳化法：酶溶液先在高聚物（常用乙基纤维素、聚苯乙烯等）有机相中分散，乳化液再在水相中分散成次级乳化液，当有机高聚物溶液固化后，每个固体球内包含着酶液。

特点：方法容易，但膜较厚，影响底物的分散。第29页,共85页，2024年2月25日，星期天逆胶束：表面活性剂等两性分子在有机相中自发形成聚集体，表面活性剂亲水端连接成逆胶束的极性核，而疏水端向外进入有机相中。

酶以逆胶束形式被固定，并在有机相中参与反应。用于逆胶束的表面活性剂：琥珀酸二辛酯磺酸钠（AOT）；溴代十六烷基三甲铵（TAB）;氯代三辛基甲铵等.主体有机相：环己烷、庚烷、辛烷、硅油等制备方法：将含酶水溶液注入到含表面活性剂的有机相中，然后进行搅拌直到形成透明胶为止。逆胶束酶反应系统第30页,共85页，2024年2月25日，星期天

将酶细胞在一定温度下加热处理,使酶固定在菌体内制得固定化菌体。如，扩大培养的含葡萄糖异构酶的链霉素细胞，在60-65℃处理15min即可。此法可与交联法或其它方法联用。热处理法第31页,共85页，2024年2月25日，星期天固定化方法的优缺点比较特性物理吸附法离子结合法包埋法共价结合法交联法制备易易易难难结合力中弱强强强酶活力高高高中中底物专一性无变化无无有变化有再生可能可能不可能不可能

不可能固定化费用低低中中高第32页,共85页，2024年2月25日，星期天固定化后酶活力的变化固定化对酶稳定性的影响固定化酶的最适温度变化固定化酶的最适pH变化固定化酶米氏常数的变化固定酶的性质第33页,共85页，2024年2月25日，星期天固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小例如：用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30%，而对低分子底物苯酚精氨酸对硝基酰替苯胺的活力保持80%。固定化后酶活力的变化原因①酶空间自由度受到限制；②空间构象会有所变化；③内扩散阻力使底物分子与活性中心接近受阻；④包埋时，大分子底物不能透过膜与酶接触第34页,共85页，2024年2月25日，星期天酶固定化的稳定性一般比游离酶的稳定性好主要表现在：●对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度；●对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等；●对于不同pH、蛋白酶、贮存条件和操作条件、固定化酶的稳定性都有影响。

固定化对酶稳定性的影响第35页,共85页，2024年2月25日，星期天稳定性提高的原因：

●固定化后酶与载体多点连接，防止酶分子伸展变形；●酶活力释放缓慢；●抑制酶的自降解。第36页,共85页，2024年2月25日，星期天

固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，但有些由于采用的固定化方法和所用载体不同，也会发生变化。以氨基酰化酶为例用DEAE-葡聚糖凝胶经离子键结合法固定化后，其最适温度(72℃)比游离酶的最适温度(60℃)提高12℃；用DEAE-纤维素固定化的，其最适温度(67℃)比游离酶提高7℃；用烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最适温度却比游离酶有所降低。固定化酶最适温度的变化第37页,共85页，2024年2月25日，星期天

酶经过固体化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化固定化酶最适pH的变化第38页,共85页，2024年2月25日，星期天●载体的带电性质

※带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH值比游离酶的最适pH值为高（即向碱性一侧移动）；

※带正电荷载体制备的固定化酶的最适pH值比游离酶的最适pH值为低（即向酸性一侧移动）；

※不带电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH值一般不改变（有时也会有所改变，但不是由于载体的带电性质所引起的）。原因:

由于在使用带负电荷的载体时，载体会吸引反应液中的氢离子（H+←）到其附近，致使固定化酶所处的反应区域的pH值比周围反应液的pH值低一些,这样就必须把反应液的pH值提高一些，才能使酶充分发挥其催化功能。第39页,共85页，2024年2月25日，星期天●酶催化产物的带电性质

※催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值要比游离酶的最适pH值高一些；

※产物为碱性时，固定化酶的最适pH值要比游离酶的最适pH※产物为中性时，最适pH值一般不改变。原因:由于固定化载体成为扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域内的pH值降低，必需提高周围反应液的pH值，才能达到酶所要求的pH值。为此，固定化酶的最适pH值比游离酶要高一些。第40页,共85页，2024年2月25日，星期天固定化酶的表观米氏常数Km随着载体的带电性能变化，具体表现在：

1.酶结合于电中性载体，由于扩散限制造成Km上升；

2.载体电荷性质与底物相反的，固定化酶Km低于溶液的Km；

3.载体与底物电荷相同的，固定化酶的Km显著增加；变化受溶液中离子强度的影响：离子强度增加，载体周围的静电梯度逐渐减少，Km变化也逐渐缩小至消失。

例如：在低离子浓度下，多聚阴离子衍生物胰蛋白酶复合物对苯甲酰胺酸乙酯的Km比原酶小96.8%，但在高离子浓度下接近原酶的Km

固定化酶米氏常数Km的变化第41页,共85页，2024年2月25日，星期天辅酶的固定化一、辅酶的定义及分类

有无机和无机辅助因子之分。其中有机辅助因子分为两类：

一是辅酶（酶间载体），其作用是从某反应向另一反应传递物质。它们与酶蛋白结合得比较松散，并且往往能够通过透析法除去。例如，脱氢酶反应中需要的辅酶I（NADH和NAD+）和辅酶Ⅱ（NADPH和NADP＋）；

二是辅基（酶间传递），它们与酶蛋白结合相当紧密，用透析法不易除去，必须经过一定的化学处理才能使之分离。它是酶活性中心的组成部分。例如，过氧化氢酶中的铁卟啉，黄素酶类中的黄素核苷酸（FMN和FAD）及维生素B6、维生素B12等第42页,共85页，2024年2月25日，星期天二、辅酶的固定化方法辅基的固定化

首先，应选择合适的载体.目前使用的载体主要有琼脂糖，此外还有纤维素、玻璃珠及合成高分子载体等。理想的载体应具备的条件：无特异性吸附；具有多孔性；有适合引入配基的官能团；化学稳定性好，；有适当的机械强度。

其次，间隔臂（手臂）的选择也非常重要。一般辅基分子和载体之间需要0.5～1．0nm长的手臂。此外必须考虑辅基的性质，如疏水性、亲水性、离子性和体积大小等因素。

辅基共价偶联于载体上：①引入适当的功能基团。（一般引入羧基和氨基后），②将具有某种功能团的辅基先与间隔臂结合，再与活化的载体偶联；或者先使间隔臂与活化的载体结合，再与辅基偶联。第43页,共85页，2024年2月25日，星期天与CNBr活化的载体直接偶联第44页,共85页，2024年2月25日，星期天与具有间隔臂的载体偶联第45页,共85页，2024年2月25日，星期天辅酶的固定化辅酶的固定化方法与酶相似，一般采用溴化氯法、碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，亦或将其进行适当的化学修饰后用在超滤器中。共价偶联法与辅基固定化十分类似。

1.引入功能团和间隔臂

辅酶引入的功能团主要是氨基或羧基。ATP、NAD(P)和CoA的AMP的部分直接体现辅酶活力，所以不适宜进行化学修饰，因此这类酶一般考虑在腺嘌呤6位或8位引入新的功能团，制成辅酶衍生物。

2.高分子化

具有羧基的辅酶衍生物可以用二亚胺的缩合反应使其与具有氨基的聚赖氨酸、聚乙亚胺等水溶性高分子结合而高分子化。水溶性高分子的选择：①溶解度要大；②分子大小要适当，使其能保持在半透膜中；第46页,共85页，2024年2月25日，星期天辅酶的再生根据辅酶和酶的固定化情况.需要辅酶的酶反应系统一般分几种类型:①均不;②辅酶不固定而酶固定;③辅酶固定而酶不固定;④辅酶和酶分别固定;⑤辅酶和酶共固定;⑥辅酶-酶复合物反应系统.NAD+(H)酶HLADH载体骨架NAD+NAD+酶Ⅰ酶ⅡA辅酶和酶共固定在载体上B通过间隔臂将辅助因子直接固定在酶分子上第47页,共85页，2024年2月25日，星期天一、固定化细胞的定义二、固定化细胞的分类、形态特征三、固定化细胞的制备四、评价固定化酶（细胞）的指标第三节细胞的固定化第48页,共85页，2024年2月25日，星期天一、固定化细胞的定义

局限性：☆形成不需要的副产物；

☆存在着扩散限制作用；

☆载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性等

固定化细胞是指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。

固定化细胞的优越性：

☆固定化细胞密度大，可增殖；☆发酵稳定性好；

☆发酵液中含菌体较少；第49页,共85页，2024年2月25日，星期天固定化死细胞：在固定化之前或之后细胞经物理或化学方法的处理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制副反应。固定化静止细胞和饥饿细胞在固定化之后细胞是活的，但是由于采用了控制措施，细胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。固定化生长细胞又称固定化增殖细胞，是将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。

分类方式固定化细胞细胞类型微生物、动物、植物生理状态死细胞：完整细胞、细胞碎片、细胞器；活细胞：增值细胞、静止细胞、饥饿细胞二、固定化细胞的分类、形态特征第50页,共85页，2024年2月25日，星期天三、固定化细胞的制备

固定化酶和固定化细胞都是以酶的应用为目的，制备方法和应用方法与固定化酶基本相同。

化学法（共价交联）涉及酶或细胞的化学修饰。由于所用化学药品的毒性，这类方法可引起细胞破坏。由于在使用中细胞间、细胞和载体间的键不易被底物或盐所破坏，所以操作稳定性高；

吸附螯合法制备固定化细胞条件温和、方法简便，但载体和细胞间吸附力弱，操作时细胞易从载体脱落，所以操作稳定性差，但优点是可再生。

包埋法从理论上来说细胞和载体间没有束缚，固定化后应保持高活力，然而实际上限制酶活力的因素较多。

交联法没有良好机械强度，所以不适于实际应用。但可得到高细胞浓度，大多数情况难于再生。第51页,共85页，2024年2月25日，星期天1.固定化酶（细胞）的活力

☆固定化酶(细胞)活力：催化某一特定化学反应的能力，其大小可用一定条件下所催化的某一反应的初速度表示。

☆固定化酶单位：μmol/min.mg☆表示固定化酶活力时须注明下列测定条件：2.固定化酶（细胞）半衰期

——指在连续测定条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2

半衰期t1/2=0.693/KDKD成为衰减常数。

KD=-2.303/t×lg(E/E0)E/E0时间t后没活力残留百分数四、评价固定化酶（细胞）的指标

温度、搅拌速度、固定化酶的干燥条件、固定化的原酶含量、用于固定化的原酶的比活力第52页,共85页，2024年2月25日，星期天3.偶联率及相对活力的测定偶联率=1，表示反应控制好，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显；偶联率＜1，表示扩散限制对酶活力有影响；偶联率＞1，表示有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。偶联率=加入蛋白质活力-上清液蛋白质活力加入蛋白质的活力X100%相对活力=固定化酶的总活力加入酶的总活力-上清夜中未偶联酶活力X100%活力回收=固定化酶的总活力加入酶的总活力X100%第53页,共85页，2024年2月25日，星期天◆生物化学及分子生物学基础研究♫酶的结构与功能研究

●阐明酶反应的机理

以糖酵解途径中，葡萄糖生成3-磷酸甘油醛为例●酶亚基性质的研究

第四节固定化酶与固定化细胞的应用●阐揭示酶原激活机理和研究蛋白质、核酸分子结构

8mol/L尿素透析醛缩酶单亚基固定化第54页,共85页，2024年2月25日，星期天

新的药物（包括化学合成药物、天然药物及基因工程药物）的临床应用不顺利，其原因：①易被胃酸破坏或沉淀；②易被肝脏及血液中的酶消除；③细胞毒性药物选择性差，副作用大；④亲水性强难以穿过细胞膜；⑤药物稳定性差，不宜贮存。

以上问题不能用简单的药物改构来完成，通过从时间和空间分布上控制药物释放是一条有效途径。

几种重要的控制体系：聚合物修饰、凝胶包埋、微球、免疫导向等。这几种控释体系涉及药物与聚合物载体偶联或固定于某种聚合物载体上，称载体药物。◆药物控释载体第55页,共85页，2024年2月25日，星期天◆生物传感器

传感器是能将一种被测量的信号转换成一种可输出信号的装置。生物传感器（Biosensor）就是利用生物成分作为感受器的传感器。一般由感受器、换能器和电子线路组成。

感受器是生物传感器的心脏。制备包括选择最佳的载体材料和在载体表面固定亲和配基。

换能器可以感知固定化配基（分子识别器）与待测物质特异结合产生的微小变化，并把这种变化转变成其它可以记录的信号。葡萄糖检测仪、免疫分析检测早孕、乙肝和尿糖的试纸第56页,共85页，2024年2月25日，星期天酶反应器的类型与特点酶反应器的设计与选型酶反应器的操作第五节酶及固定化酶反应器第57页,共85页，2024年2月25日，星期天按几何形状：罐形、塔形、膜式的等；按操作方式：间歇式、连续式；按流体流动特性：理想流动（活塞流）和非理想流动；按酶的类型：均相酶反应器、固定化酶反应器

◆均相酶反应器

1.搅拌罐式反应器

☆组成部分：搅拌器、罐、控温系统，也可以在反应器内部安装有挡板，以强化反应过程中物料与酶的混合。一、酶反应器的类型与特点

以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置称为酶反应器（EnzymeReactor）第58页,共85页，2024年2月25日，星期天第59页,共85页，2024年2月25日，星期天☆操作方式：分批式：半分批式：☆应用：主要应用于食品和饮料工业中。☆优点：反应器结构简单，适合于大、中、小型企业。☆缺点：通常不能进行酶的回收，反应结束后，通过加热的方式使酶变性失活，对于产物的分离、纯化有一定的影响。2.超滤膜反应器

☆操作方式：分批操作、连续操作☆膜的形状：平板状、管状、螺旋状、中空纤维状☆膜的应用：用于胶态或不溶性底物，尤其是产物对酶有抑制☆缺点：酶的长期操作稳定性差，而且酶易在超滤膜上吸附损失或在膜表面浓缩极化。第60页,共85页，2024年2月25日，星期天◆固定化酶反应器

1.搅拌罐型反应器（stirredtankreactorSTR）

☆分批式反应器(Batch

stirredtankreactorBSTR)

把固定化酶用于该反应器，每批操作完成后，从流出液中分离出产物和固定化酶，可以采用过滤或离心的方法。由于酶经过反复循环回收，会失去活性，故在工业生产中固定化酶很少采用这种反应器。

☆连续搅拌罐反应器(Continuous

flowstirredtankreactorCSTR)

操作方式采用连续进料、连续出料的方式。

●优点:反应器内的物料可以得到充分的混合，温度和pH容易控制，传质阻力少，可以处理粘性物系。●缺点:搅拌桨产生的剪切力较大，容易引起固定化酶的破坏。。第61页,共85页，2024年2月25日，星期天近年来有一种改良的CSTR，是将载有酶的圆片聚合物固定在搅拌轴上或者放置在与搅拌轴一起转动的金属网筐内，这样既能保证反应液搅拌均匀，又不致损坏固定化酶第62页,共85页，2024年2月25日，星期天第63页,共85页，2024年2月25日，星期天2.填充床反应器(Packedbedreactor)

将颗粒状或片状固定化酶填充与固定床内，物料按一定的方向以恒定的速度通过反应床。是目前单位体积反应器装载酶制剂负荷

最高的反应器，也是催化效率较高的反应器。

☆固定化酶的形式:可以采用各种形状，如球形、碎片、碟形、薄片、丸粒等.

☆载体:有多孔玻璃珠、珠状离子交换树脂、聚丙烯酰胺凝胶、二乙胺乙基葡聚糖凝胶、胶原蛋白薄膜片等。近年来，球形微囊体也用于填充床。

☆流型:填充床反应器内流体的流动型态接近于平推流？

（又称活塞流)流型—理想的无反混反应器底物按照一定的方向以恒定流速通过反应床，即在其横截面上液体流动速度完全相同。根据底物的流动方式，又有下向流动、上向流动和循环流动。工业生产中，液流方向常用上向方式。第64页,共85页，2024年2月25日，星期天☆缺点:

●温度和pH值较难控制;●底物、产物往往会产生轴向浓度分布●床的清洗、更换非常麻烦;

●床内有自压缩倾向，易堵塞，且运行过程中压力降很大，增加了运行成本。☆优点:

●可使用高浓度的催化剂，反应产生的产物和抑制物可从反应器中不断流出；

●产物浓度沿反应器长度逐渐升高，可以减少产物的抑制作用第65页,共85页，2024年2月25日，星期天3.流化床反应器(FluidizedbedreactorFBR)

是一种装有较小颗粒的垂直塔式的反应器,底物以一定速度由下向上流过,使固定化颗粒在浮动状态下进行反应。流体混合程度可认为介于CSTR和PFR之间。

☆优点:●具有良好的混合、传热、传质效果，温度、pH值的控制比较容易;

●不易堵塞，FBR可用于处理粘性强和含有固体颗粒的底物，也可用于需要供应气体或排放气体的反应有;

●可以处理粉末状底物；

●反应器运行过程中，压力降较少，即使使用直径很少的酶颗粒，压力降也不会很大。

第66页,共85页，2024年2月25日，星期天☆缺点:●需保持一定的流速运行成本高，难以放大；●酶颗粒处于流动状态，易受到机械破损;●流化床的空隙体积大，酶浓度不；●由于底物高速流动使酶冲出，降低了转化率。第67页,共85页，2024年2月25日，星期天

第68页,共85页，2024年2月25日，星期天生物流化床是20世纪70年代开发的一种新型生物膜法，美国和日本率先进行了多方面的研究工作并取得了大量的成果。所谓生物流化床就是以砂、活性炭、焦炭等颗粒为载体充填于生物反应器内，因载体表面浮着生长着生物膜而使其密度减小，当污水以一定流速从下往上流动时，载体便处于流化状态，附着在载体上的生物膜与污水充分接触而使污水中的有机物得以降解。按照载体流化的动力来源不同，通常可分为以液流为动力的两相流化床、以气流为动力的三相流化床和机械搅动流化床等3种类型。一些学者分别利用不同类型的流化床处理啤酒废水、生活污水和油脂废水等.第69页,共85页，2024年2月25日，星期天4.膜型反应器

由膜状或板状固定化酶活固定化微生物组装的反应器均称为膜型反应器。有(a)平板状、(b)螺旋卷型、(c)转盘型、(d)空心酶管和(e)中空纤维膜型

平板型和螺旋卷型反应器具有：①压力降小；②膜面积清晰③放大容易等优点。缺点：单位体积催化剂的有效面积小。第70页,共85页，2024年2月25日，星期天空心酶管反应器的酶固定在细管的内壁上，底物溶液流经细管时，只有与管壁接触的部分进行酶反应。转盘型固定化酶反应器以包埋法为主，制备成固定化凝胶薄板（圆盘状或叶片状）装配在旋转轴上，并把整个装置浸在底物溶液中，此类反应器更换催化剂方便。第71页,共85页，2024年2月25日，星期天中空纤维膜反应器是数千根醋酸纤维制成的中空纤维（内径200-500μm，外径300-900μm）,内层紧密光滑，具有一定分子量截留值，可截留大分子物质而允许不同的小分子物质通过，外层为多孔的海绵状支持层，酶被固定在海绵状支持层中。第72页,共85页，2024年2月25日，星期天5.鼓泡塔型反应器

底物与气体从底部通入，通常气体进入反应器前要经过气体分散板得到充分分散。第73页,共85页，2024年2月25日，星期天二、酶反应器的设计与选型酶反应器的设计

研究工业酶反应器的主要目的就是追求高的经济效益，希望酶反应器在时间上、空间上、经济上达到最佳的效果。

1.酶反应器的设计原理

●底物的酶促反应动力学及温度、压力、pH等操作参数对此特性的影响；●反应器的型式和反应器内流体流动状态及传热特性；●需要的生产量及生产工艺流程。三项组合建立操作方程式或设计方程式。

第74页,共85页，2024年2月25日，星期天2.与设计有关的参数●酶反应器的生产强度:表示每小时每升反应体积所产生的产品的克数。即P:流出液中产物的浓度g/L；Q：流速L/h；VR:反应器体积L或Yp/s:产品转化率；t：停留时间；S0:流入底物的浓度Qp主要取决于反应器内固定化酶的活性、浓度、酶反应器的特性及操作方法等因素，设计反应器的首要目的是使反应器具有高的Qp第75页,共85页，2024年2月25日，星期天●产品转化率Y/p/s反及酶的催化率:

Y/p/s：指每克底物中有多少克转化为产物，即

Rp/e

表示单位量的酶催化产物形成的克数，即

Sa:单位时间内每克酶能作用

Tc：酶的有效时间，一般以酶的半衰期表示●产物浓度P及底物停留时间tP:是一个影响到分离提纯，即回收成本高低的关键问题底物在反应器内的停留时间t=VR/q被定义为空时,其倒数1/t称为空速,又称稀释率

第76页,共85页，2024年2月25日，星期天酶反应器的选择

1.酶的形状、大小和机械强度☆反应器的形状大致可根据酶的形状来确定

固定化酶的形状主要有粒状（颗粒、小球），膜状（膜、薄膜片状、管状）和纤维状等三种.

粒状酶:搅拌罐、固定床、流化床反应器等膜状酶:螺旋式、转盘式、平板式、空心管膜等膜反应器☆固定化酶的机械强度，希望越大越好

☆溶液酶由于回收困难，一般只适用于BSTR反应器。

2.底物的性质☆溶解性或浊液性底物，对任何类型的反应器都适用☆颗粒状和胶状底物，往往会堵塞填充床，需要采用高流速搅拌的

CSTR、FBR以减少底物颗粒的集结、沉积和堵塞，使底物保持悬浮状态。第77页,共85页，2024年2月25日，星期天3.酶促反应的动力学特性☆接近平推流特性的填充床反应器，在固定化酶反应器中占有主导地位，适合于产物对酶活性具有抑制作用的反应。

☆若底物表现出对酶的活性有抑制作用时，CSTR所受的影响要比PBR少一些。4.酶的稳定性☆接固定化酶在反应器中催化活性的损失有3种原因：①酶的失效；②酶从载体上脱落；③载体的肢解5.操作要求及运